ВАКЦИНА ПРОТИВ АСПЕРГИЛЛЁЗА Российский патент 2004 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к микологии, и может быть использовано для получения вакцин для профилактики аспергиллеза сельскохозяйственных животных.

Аспергиллез - инфекционное заболевание сельскохозяйственных животных, преимущественно молодняка, вызываемое патогенными грибами из рода Aspergillus (в основном A. fumigatus), характеризующееся язвенно-некротическими и гранулематозными поражениями пищеварительного тракта (рубца, книжки, сычуга у телят и ягнят и желудка у поросят) и казеозными гранулемами в легких. У взрослых животных отмечают и аборты. Болеют также птицы всех видов и человек.

Известна вакцина против аспергиллеза птиц (см. Yearoum D.R.Aspergillosus: diagnosis treatment and prevention / Lessons of the past-pathways to the fumure. - 1988. - p. 143-151), содержащая антиген из аттенуированных штаммов грибов A. fumigatus и A. flavus.

Однако данная вакцина используется только для профилактики аспергиллеза птиц, а наличие в составе вакцины дополнительного гриба А. flavus, не играющего ведущую роль в этиологии аспергиллеза животных, вызывает иммунный ответ у телят и поросят на антигены и этого гриба. Поэтому использование данной вакцины на животных не имеет перспективы. Кроме того, использование “живой” вакцины приводит к возникновению осложнений и даже заболеваний у вакцинируемых животных с ослабленной иммунной системой, поскольку аттенуированные штаммы имеют склонность к реверсии своих изначальных вирулентных свойств. Использование данной вакцины предусматривает аэрогенный способ иммунизации с использованием струйных аэрозольных генераторов (САГ), не нашедших в животноводстве широкого применения.

Известна также вакцина против аспергиллеза птиц (см. A.Richard T.L., Thurston L.R. et. al. Vaccination studies of aspergillatis in turkeys: subcutanes inoculation with several vaccine preparations Jollowed by aerosol challenge exposure. Am. J. Vet. Res., 1982. - Mai, 43(3). - p.488-492), содержащая антиген из штамма гриба Aspergillus fumigatus, полученный из мицелиальной стадии гриба. Вакцина “живая”, способ введения - подкожный.

Однако профилактическая эффективность такой вакцины при профилактике аспергиллеза птиц, в частности индеек, невелика и составляет всего 50%. Сведения об использовании данной вакцины для профилактики аспергиллеза животных отсутствуют.

Наиболее близкой к заявляемой является вакцина против аспергиллеза (см. патент Японии №10234379, по кл. А 61 К 39/00, опуб. 08.09.98г.), содержащая водорастворимые антигены из штамма гриба Aspergillus fumigatus, представляющие собой цитоплазматическую фракцию гриба, полученные при разрушении клеточных мембран.

Однако данная вакцина предназначена для использования только в медицинской практике. Кроме того, приготовление вакцины из культур гриба без учета его стадии роста может приводить к нежелательным аллергическим реакциям у вакцинированных людей. При этом стоимость такой вакцины высока, поскольку она получена методом генной инженерии.

Изобретение направлено на решение задачи создания эффективной, безопасной и дешевой вакцины против аспергиллеза сельскохозяйственных животных, обладающей высокоиммуногенными и низкоаллергенными свойствами.

Для решения поставленной задачи вакцина против аспергиллеза, содержащая растворимый антиген из штамма гриба Aspergillus fumigatus, представляющий собой цитоплазматическую фракцию гриба, и адьювант содержит согласно изобретению в качестве растворимого антигена - антиген из штамма Aspergillus fumigatus №6 с активностью спор 2,5·10⁸-3,0·10⁸ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6-16% при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Адьювант 9-10

Антиген из штамма

Aspergillus fumigatus №6 остальное

В известных авторам источниках патентной и научно-технической литературы не описано эффективной и безопасной вакцины против аспергиллеза сельскохозяйственных животных, содержащей в качестве растворимого антигена антиген из штамма Aspergillus fumigatus №6, представляющий собой цитоплазматическую фракцию гриба с активностью спор 2,5·10⁸-3,0·10⁸ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6-16%. Подобранные экспериментальным путем соотношения компонентов вакцины обеспечивают ее высокоиммуногенные и низкоаллергенные свойства.

Штамм Aspergillus fumigatus №6, предназначенный для изготовления вакцины, характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки.

Аспергиллы представлены ветвящимися переплетающимися гифами 3-5 мкм ширины с поперечными перегородками. Органы плодоношения имеют фляжкообразные утолщения на концах гиф с цепочками спор по периферии. В окрашенных по Граму мазках аспергиллы представлены в виде грамположительных гиф и их фрагментов.

Культуральные признаки.

На пластинчатом агаре Сабуро через 24-48 часов роста при температуре 37°С образуется беловатый пушистый налет. Через 72-96 часов вырастает массивная колония круглой формы с зеленовато-голубоватым оттенком в центре и белой каймой по периферии. В бульоне Сабуро на 3 сутки культивирования отмечается поверхностный рост культуры бархатистого вида темно-зеленого цвета.

Активность штамма - начало спорообразования - на 2 сутки культивирования. К пятнадцатым суткам культивирования количество спор в питательном бульоне, описанном в патенте РФ №2093569 и содержащем (мас.%): глюкозу 4-5; гидролизат лактальбумина 0,45-0,55; сыворотку крови крупного рогатого скота 9-11; солевой раствор Хенкса - остальное, составляет 2,9·10⁸ спор/см³.

Антигенные свойства. Антигены штамма - липополисахариды и комплекс токсинов: фумагиллин, фумигатин, глиотоксин и треморген.

Для получения антигенов штамма Aspergillus fumigatus №6, представляющих собой цитоплазматическую фракцию гриба, используют метод разрушения клеточных мембран микроорганизмов с помощью ультразвуковой дезинтеграции аппаратами типа У.Ф.А. - 11 (Польша), “Solana” (Brian industries) или малогабаритным лабораторным дезинтегратором (МЛ - 1) производства НПО “Биоприбор” АН СССР.

Для этого из авирулентного штамма Aspergillus fumigatus №6 через определенные промежутки культивирования отбирают пробы. Пробы разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего смесь подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора в течение 2 минут, получая таким образом цитоплазматическую фракцию.

Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану “Владипор” МФА - МА №3.

Отбор иммуногенной стадии антигенов проводят с использованием реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ) по способу, описанному в патенте РФ №2176392, в соответствии с которым антигены смешивают с комплементом морской свинки, добавляют стабилизированную кровь кролика, смесь инкубируют, готовят мазки, подсчитывают фиксированное количество лейкоцитов и отмечают число агломерированных клеток белой крови. По величине индекса агломерации оценивают пригодность полученных антигенов для создания вакцины. Экспериментальным путем была подобрана величина индекса агломерации лейкоцитов, при которой антиген считается иммуногенным. Для антигена штамма Aspergillus fumigatus №6 в виде цитоплазматической фракции величина индекса агломерации составляет 6-16%.

К выявленным вышеописанным методом растворимым антигенам с индексом агломерации лейкоцитов 6-16% добавляют для обезвреживания и повышения иммуногенных свойств формалин 0,3-0,4%-ной концентрации. После чего в полученный комплекс добавляют для повышения синтеза антител и замедления всасывания антигенов адьювант (например, 6%-ный раствор гидроокиси алюминия, неполный масляный адьвант Фрейнда, сапонин) в соотношении 10:1.

Антигенный комплекс помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 21 суток.

Проверку вакцины на стерильность и безвредность проводят общепринятыми методами, а оценку иммуногенных свойств - на лабораторных животных.

Пример 1. Способ изготовления вакцины против аспергиллеза сельскохозяйственных животных заключается в следующем.

1. Выделяют из штамма Aspergillus fumigatus №6 культуру клеток микроорганизма с активностью спор 2,5·10⁸-3,0·10⁸ в 1 см.

Для этого штамм Aspergillus fumigatus №6 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 37°С в течение 3 суток. Количество пробирок зависит от объема питательной среды, в которую в дальнейшем будет внесен посевной материал штамма из расчета 1 пробирка на 1 литр среды. Выросшую культуру смывают стерильным физиологическим раствором, высевают в бактериологические бутыли с питательным бульоном с использованием солевого раствора Хенкса по патенту РФ №2093569. Проводят культивирование в термостате при 37°С в течение 15 суток. В полученной культуре определяют концентрацию спор методом подсчета в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства. Урожай спор обычно колеблется в пределах от 2,5·10⁸ до 3,0·10⁸ спор/см³.

2. Выделяют цитоплазматическую фракцию полученной суспензии клеток, используя метод разрушения клеточных мембран микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора “Solana” (Erian industries). Воздействие дезинтегратором осуществляют в течение 2 минут. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану “Владипор” МФА - МА №3 при помощи вакуум-насоса. Полученный фильтрат представляет собой комплекс липополисахаридных и токсических антигенов.

3. Производят оценку полученных растворимых антигенов на иммуногенность и выявляют антигены с индексом агломерации лейкоцитов 6-16%.

Для этого фильтрат разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл полученной смеси и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 минут при 37°С, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем служат пробирки с антигеном, изотоническим раствором хлорида натрия вместо комплемента и стабилизированной кровью кролика. Другим контролем служили пробирки с стабилизированной кровью кролика, комплементом морской свинки и изотоническим раствором хлорида натрия вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 37°С в течение 45 минут.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают и затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 минут. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут.

Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении ×450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных не менее 3-х). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 16% от общего числа лейкоцитов - 100 антигены считаются наиболее иммуногенными и соответственно пригодными для конструирования вакцины против аспергиллеза.

4. К растворимым антигенам с индексом агломерации лейкоцитов 6-16% добавляют формалин 0,3-0,4%-ной концентрации.

5. В полученный комплекс добавляют адьювант - 6%-ный раствор гидроокиси алюминия в соотношении 10:1.

6. Комплекс антиген - адьювант помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 21 суток.

Пример 2. Оценка иммуногенных свойств вакцины.

Вакцину вводят кроликам внутримышечно в дозе 2,5 мл двукратно с 8-10-дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации.

Учитывая, что при аспергиллезе животных поражаются, в основном, органы пищеварительного тракта, так как в естественных условиях возбудитель проникает в организм алиментарным путем, оценку напряженности иммунитета проводят с использованием перорального способа заражения кроликов, вакцинированных по описанной выше схеме. Для этого с помощью интрагастрального зонда вводят в желудок кроликов культуру вирулентного штамма A. fumigatus с концентрацией возбудителя 1,0-10⁶ спор/см³ и объеме вводимой суспензии клеток гриба - 10 см³.

У вакцинированных животных клинические симптомы заболевания отсутствуют. У невакцинированных животных клинические признаки заболевания (отказ от корма, расстройство пищеварения, явления угнетения нервной системы) проявляются через 3-4 суток после заражения. Гибель интактных кроликов наступает через 3-6 суток после появления первых клинических признаков болезни. Результаты испытаний представлены в таблице 1.

Для серологической оценки гуморального иммунитета используют реакцию преципитации (РП) и иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства НПО “Аквапаст” (г.Санкт-Петербург). Кровь для исследований берут от иммунизированных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Результаты представлены в таблице 2.

Вакцина была испытана на крупном рогатом скоте и свиньях. С целью получения противоаспергиллезного иммунитета вакцину вводят дважды с интервалом 8-10 дней внутримышечно телятам в дозе 1 мл на одно введение с 1-2-месячного возраста, а поросятам - в дозе 1 мл с месячного возраста. При однократном способе введения препарат инъецируют в дозе 2 мл.

У иммунизированных животных через 14 и 90 дней после вакцинации брали пробы крови. В полученных сыворотках крови определяли титры антител к аспергиллезным антигенам в РП и ИФТС, которые были не ниже значений 1:16 и 1:3125, соответственно как при однократной, так и при двукратной вакцинации.

Вакцина опробирована в условиях хозяйств, неблагополучных по аспергиллезу телят и поросят. У животных до применения вакцинации отмечали клинические и патологоанатомические признаки заболевания. Лабораторными исследованиями диагноз на аспергиллез был подтвержден выделением возбудителя. После проведения одно- и двукратной иммунизации в указанных выше дозах клинические признаки заболевания у вакцинированных животных не регистрировались.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Вакцина содержит растворимый антиген из штамма гриба Aspergillus fumigatus №6 с активностью спор 2,5·10⁸-3,0·10⁸ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6-16% и адъювант при следующем соотношении компонентов (мас.%): адъювант 9-10, антиген из штамма Aspergillus fumigatus -остальное. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, безвредна. 2 табл.

Вакцина против аспергиллеза, содержащая растворимый антиген из штамма гриба Aspergillus fumigatus, представляющий собой цитоплазматическую фракцию гриба, и адъювант, отличающаяся тем, что она содержит в качестве растворимого антигена - антиген из штамма Aspergillus fumigatus № 6 с активностью спор 2,5·10⁸-3,0·10⁸ в 1 см³, индексом агломерации лейкоцитов 6-16% при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Адъювант 9-10

Антиген из штамма Aspergillus

fumigatus № 6 Остальное