ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ПРОТИВ КАНДИДОЗА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ Российский патент 2006 года по МПК A61K36/06 

Изобретение относится к области медицины, а именно - к микологии, и может быть использовано для лечения кандидозов.

Кандидоз (кандидамикоз) - инфекционное заболевание кожи, слизистых оболочек и внутренних органов, вызываемое патогенными грибами из рода Candida. Возбудителем заболевания наиболее часто является Candida albicans.

Кандидоз кожи проявляется в виде подострых дерматитов в складках кожи, изредка с образованием абсцессов. При кандидозе слизистых оболочек обнаруживаются поверхностные, легко отходящие беловато-желтые пленки. Кандидоз внутренних органов (висцеральный кандидамикоз) может быть изолированным (желудочно-кишечный тракт, органы дыхания, мочеполовая система) и генерализованным с единичными или множественными метастазами во внутренних органах, нервной системе, мышцах, костях.

Известна композиция для лечения микозов у млекопитающих, в частности человека, инфицированного грибком из группы Candida albicans (см. заявку РФ №98 105635, кл. МПК А 61 К 31/505, опуб. 27.01.2000 г.). Композиция содержит состав замедленного высвобождения ингибитора синтеза хитина, представляющего собой никомицин или его производные. Состав замедленного высвобождения может содержать различные компоненты. В одном из вариантов он содержит лецитин, этиловый спирт, диметилсульфоксид, кукурузный крахмал, физиологический раствор. В другом варианте состав содержит ланолин, хлопковое масло, "TWEEN" 40, стеариновую кислоту, гидроксиметилцеллюлозу, карбопол и физиологический раствор. При этом композицию вводят либо непрерывно внутривенно, либо перорально, либо подкожно.

Данная противогрибковая композиция является химическим препаратом, вызывающим ряд побочных эффектов. В частности, возможно его аллергизирующее, токсическое воздействие ввиду непереносимости больными некоторых реагентов, входящих в состав препарата. Кроме этого, препарат не решает задачи освобождения организма больного от возбудителя.

Известно средство против кандидоза, включающее убитую культуру Candida albicans (см. заявка РФ №97105400, кл. МПК А 61 К 39/116, опуб. 10.04.99 г.). Средство предназначено для предотвращения вагинальных инфекций путем введения его в пищеварительный тракт. Средство получают путем смешивания убитого микроорганизма с фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем, разбавителем и/или другим вспомогательным веществом.

Однако данное средство готовится из микроорганизмов, выделенных непосредственно от больных и применяется на них же. Такое средство не обладает стабильными антигенными свойствами и не может быть постоянно в наличии в лечебном учреждении.

Известно также лекарственное средство против кожного и висцерального кандидозов млекопитающих (человека и животных) для инъекций (см. Патент РФ №2219945, кл. МПК А 61 К 39/00, опуб. 27.12.2003 г.), содержащее гомогенизированные инактивированные микроконидии дерматофитов и инактивированные дрожжевые бластоспоры или их антигенный материал. При этом дрожжевые бластоспоры принадлежат к штаммам Candida albicans НБМ-9456, и/или Candida albicans НБМ-9457, и/или Candida albicans НБМ-9458, и/или Candida albicans НБМ-9459. Препарат может содержать или не содержать адъювант и вещество с иммуномодулирующей активностью. Содержание спор составляет 10-90 миллионов спор на мл (1·10⁷-9·10⁷ спор/мл).

Однако, в данном препарате присутствуют бластоспоры и микроконидии, т.е. карпускулярный антиген, эффективность которого незначительна. Кроме этого, наличие спор приводит к аллергизации организма человека.

Наиболее близким к заявляемому является лекарственное средство против кандидоза человека (см. Effectiveness of a vaccine composed of heat-killed Candida albicans and a novel mucosal adjuvant, LT (R192G), against systemic candidiasis. / Cardenas-Freytag L; Cheng E; Mayeux P; Domer JE; Clements JD // Infect. Immun. 1999 Feb. 67(2):826-33), содержащее термоубитую цитоплазматическую фракцию гриба из штамма С.albicans и адъювант, в качестве которого используют детоксинированную форму термолабильного энтеротоксина E.coli.

Недостатком такого средства является его низкая иммуногенность. Напряженность иммунитета колеблется в пределах 1·10⁴-1·10⁵ спор/мл при контрольном внутривенном заражении возбудителем кандидоза. Кроме того, использование в качестве адъюванта термолабильного энтеротоксина, являющегося прежде всего антигеном E.coli, вызывает вынужденное образование в организме дополнительно и антител к возбудителю колибактериоза. Данное обстоятельство отрицательно влияет на органы и системы иммунитета. Недостатком средства является и то, что образование специфических противокандидозных антител происходит только после искусственного заражения, а не после профилактической иммунизации данным препаратом. При этом средство вводят интраназально.

Изобретение направлено на решение задачи создания эффективного и безопасного лекарственного средства для инъекций против кандидоза человека, которое обладает высокоиммуногенными и низкореактогенными свойствами за счет наличия в нем большого количества макромолекулярных полипептидов, низкого содержания липидов и высокого уровня полисахаридов.

Для решения поставленной задачи в лекарственном средстве против кандидоза человека, содержащем активную часть в виде инактивированной цитоплазматической фракции гриба из штамма Candida albicans и растворитель, согласно изобретению активная часть представляет собой клеточные стенки и цитоплазму гриба со сроком культивирования 28-36 часов штамма Candida albicans №253 с концентрацией клеток гриба 1,85·10⁸-2,5·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды, индексом иммуногенности 6-9% и содержанием липидов - до 0,2%, полисахаридов - 50-76%, пептидов с м.м > 10 Кд - 80-87%, средство содержит в качестве инактиватора - формалин, а в качестве растворителя - дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Активная часть в виде клеточных стенок и цитоплазмы гриба из штамма Candida albicans №253 с концентрацией спор 1,85·10⁸-2,5·10⁸  в 1 см³ дистиллированной воды2,0-2,7Формалин0,1-0,15Дистиллированная водаОстальное

В известных авторам источниках патентной и научно-технической литературы не описано эффективного и безопасного лекарственного средства для инъекций против кандидоза человека, содержащего в качестве активной части клеточные стенки и цитоплазму гриба со сроком культивирования 28-36 часов штамма Candida albicans №253 с концентрацией клеток гриба 1,85·10⁸-2,5·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды, индексом иммуногенности 6 - 9% и определенным содержанием липидов, углеводов и полипептидов. При этом большое количество макромолекулярных полипептидов (до 87%), низкое содержание липидов (до 0,2%) и высокий уровень полисахаридов (до 76%) позволяют считать заявляемый препарат высокоиммуногенным и обладающим низкой реактогенностью, способствующей освобождению организма человека от возбудителя.

Процентное соотношение компонентов, указанных в формуле изобретения, было подобрано экспериментальным путем.

Штамм Candida albicans №253, предназначенный для изготовления данного препарата, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ) (Справка о депонировании штамма от 12.10.01 г. прилагается). На штамм получен патент РФ на изобретение №2209243.

Штамм Candida albicans №253 характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки. Овальные (2:1) или почти круглые клетки с хорошо заметными вакуолями с небольшими ядрами.

Культуральные признаки. На агаре Сабуро через 48 часов культивирования при температуре 28°С образуются выпуклые белые колонии с небольшим кремовым оттенком сметанообразной консистенции с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями. На 5 сутки культивирования поверхность колонии гладкая, матовая, с кремовым оттенком, края слегка волнистые.

При культивировании на жидких питательных средах через 48 часов при 28°С заметно помутнение бульона и образование компактного осадка.

Ферментативные свойства. Ферментативная активность проявляется на полужидкой среде Гисса: с глюкозой - образованием кислоты и газа; с мальтозой - также кислоты и газа; с сахарозой - только кислоты; с лактозой активность не проявляется.

Активность штамма - начало спорообразования на 2-е сутки культивирования.

Антигенные свойства. Антигены штамма - комплекс специфических белков, полисахаридов и липидов.

Способ изготовления лекарственного средства против кандидоза человека заключается в следующем.

1. Выращивают культуру штамма Candida albicans №253.

Для этого штамм Candida albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 28°С в течение 3 суток.

2. Выросшую культуру смывают стерильным физиологическим раствором и отбирают ту, у которой урожайность спор составляет 4,7·10⁸-5,2·10⁸ в 1 см³ физиологического раствора.

3. Высевают полученную культуру в бактериологические матрасы с питательной средой, содержащей (мас.%): глюкозу 4-5; пептон 0,95-1,05; агар 3,5-3,6; сыворотку крови крупного рогатого скота 9-11; солевой раствор Хенкса - остальное.

3. Проводят ее культивирование в термостате при 28°С в течение 28-36 часов. Полученные клетки гриба смывают стерильной дистиллированной водой и доводят их концентрацию в 1 см³ дистиллированной воды до 1,85·10⁸-2,5·10⁸.

При этом концентрацию спор (по п.1) и клеток гриба (по п.3) определяют путем подсчета в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства.

4. Осуществляют выделение цитоплазматической фракции из этих клеток в виде клеточных стенок и цитоплазмы.

Для этого используют метод разрушения клеточных мембран микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора "Solana" (Erian industries). Воздействие дезинтегратором осуществляют в течение 60 минут. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану "Владипор" МФА - МА №3 при помощи вакуум-насоса. Полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белково-полисахаридных антигенов.

4. Осуществляют оценку свойств полученной цитоплазматической фракции по индексу агломерации лейкоцитов и содержанию липидов, полисахаридов и пептидов.

5. Выбирают те фракции, индекс агломерации лейкоцитов которых составляет 6-9%, содержание липидов - до 0,2%, полисахаридов - 50-76%, пептидов с м.м. > 10 Кд - 80-87%.

Для выявления фракций с индексом агломерации лейкоцитов 6-9% берут пробу фильтрата, разводят ее физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл полученной смеси и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 минут при 37°С, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем являются пробирки с антигеном с изотоническим раствором хлорида натрия вместо комплемента и стабилизированной кровью кролика. Другим контролем служат пробирки со стабилизированной кровью кролика, комплементом морской свинки и изотоническим раствором хлорида натрия вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 37°С в течение 45 минут.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают и затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 минут. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут.

Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении ×450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных не менее 3-х). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 9% от общего числа лейкоцитов - 100 фракцию считают наиболее иммуногенной.

Биохимический состав цитоплазматической фракции грибов определяли с предварительным концентрированием проб в 100 раз с осаждением ацетоном. Содержание белка устанавливали по методу Бредфорда, с денатурированием в однократном буфере, содержащем 1 М трис, рН 6,8; 10% SDS, 8M мочевины; 0,1% меркаптоэтанола; 5% глицерина бромфенолового синего, с последующим кипячением в течение 5 минут. Белковый электрофорез поводили в 12,5% ПААГ по методу Laemli на аппарате ЕС 120 Mini Vertical Gel System (США). Использовали маркеры с м.м 225, 150, 100, 75, 50, 35, 25, 15, 10 кД. Пробы загружали в трех концентрациях: по 40, 20 и 10 мкл на лунку. Электрофорез проводили при напряжении 120 В, силе тока 50 мА и толщине геля 0,75 мм, с экспозицией 1 час. Содержание азота определяли с ТХУ и 3% фосфорно-молибденовой кислотой. Липиды и их кислотный состав определяли согласно "Методам биохимического исследования растений". Определение растворимых и легкогидролизуемых углеводов проводили согласно ГОСТ 26176-91 по методу Бертрана.

6. Осуществляют инактивирование отобранных фракций с использованием раствора формалина 36,5-37,5%-ной концентрации в количестве 0,1-0,15% от общего объема препарата.

Проверку лекарственного средства на стерильность и безвредность проводят общепринятыми методами, а оценку иммуногенных свойств препарата - на лабораторных животных.

Для оценки иммуногенных свойств препарата его вводят внутримышечно двукратно с интервалом 7-10 дней в дозе: мышам - по 0,5 мл, морским свинкам - по 3 мл и кроликам - по 5 мл. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после последнего введения препарата.

Способ лечения кандидоза человека заключается в следующем.

Препарат вводят внутримышечно двукратно в дозе 5 мл с интервалом 7-10 дней. При необходимости, проводят два курса лечения. Возможно и трехкратное введение препарата - через 7 дней после первого введения и через 14 дней после второго.

Пример 1.

Больная А., 19 лет, болеет кандидозным вульвовагинитом. Заболевание было диагностировано три года назад. Лечение традиционными препаратами не давало результатов.

Проведено два курса лечения:

1 курс - внутримышечное введение препарата в дозе 5 мл двукратно с интервалом 7 дней. 2 курс - спустя две недели после первого курса, при этом повторное двукратное введение препарата осуществляли с интервалом 7 дней между инъекциями.

В результате лечения клинические признаки заболевания отсутствовали, улучшилось общее состояние больной. Микроскопические исследования свидетельствовали об отсутствии возбудителя.

Пример 2.

Больная Б., 48 лет, диагноз: Кандидозный вульвовагинит. Болеет более 7 лет. Проведено 2 курса лечения по схеме, указанной в примере 1.

Спустя 30 дней по завершении 2 курса лечения проявления кандидоза полностью исчезли.

Подобно описанному в примере 1 проводилось лечение еще 5-ти больных с аналогичным диагнозом. Результаты лечения положительные.

Пример 3.

Больная В., 54 года. Диагноз: Дрожжевой стоматит.

Проведено трехкратное введение препарата в дозе 5 мл: в 1-й, 7-й и на 21-й день после первого введения.

Через 3 месяца наступило полное выздоровление. Отсутствовали клинические признаки заболевания и характерные поражения ротовой полости.

Пример 4.

Больной Г., 40 лет. Диагноз: Кандидозный баланит. Заболевание диагностировано два года назад. Лечение традиционными препаратами не давало результатов.

Проведено два курса лечения:

1 курс - внутримышечное введение препарата в дозе 5 мл двукратно с интервалом 7 дней; 2 курс - спустя две недели после первого курса повторное двукратное введение препарата с интервалом 7 дней между инъекциями.

В результате лечения улучшилось общее состояние больного. Клинические признаки заболевания отсутствовали.

Таким образом, заявляемое лекарственное средство эффективно, безопасно, дает положительный результат уже через 30 дней после начала лечения.

Изобретение относится к области медицины, а именно - к микологии, и может быть использовано для лечения кандидозов. Лекарственное средство против кандидоза человека содержит активную часть в виде инактивированной цитоплазматической фракции гриба из штамма Candida albicans и растворитель, активная часть представляет собой клеточные стенки и цитоплазму гриба со сроком культивирования 28-36 часов штамма Candida albicans №253 с концентрацией клеток гриба 1,85·10⁸-2,5·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды, индексом иммуногенности 6-9% и содержанием липидов - до 0,2%, полисахаридов - 50-76%, пептидов с м.м. > 10 Кд - 80-87%, средство содержит в качестве инактиватора формалин, а в качестве растворителя - дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов (мас.%): активная часть в виде клеточных стенок и цитоплазмы гриба из штамма Candida albicans №253 с концентрацией спор 1,85·10⁸-2,5·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды 2,0-2,7; формалин 0,1-0,15; дистиллированная вода - остальное. Изобретение обеспечивает эффективное и безопасное средство против кандидоза человека.

Лекарственное средство против кандидоза человека, содержащее активную часть в виде инактивированной цитоплазматической фракции гриба из штамма Candida albicans и растворитель, отличающееся тем, что активная часть представляет собой клеточные стенки и цитоплазму гриба со сроком культивирования 28-36 ч штамма Candida albicans № 253 с концентрацией клеток гриба 1,85·10⁸-2,5·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды, индексом иммуногенности 6-9% и содержанием липидов - до 0,2%, полисахаридов - 50-76%, пептидов с м.м. > 10 Кд - 80-87%, средство содержит в качестве инактиватора - формалин, а в качестве растворителя - дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Активная часть в виде клеточных стенок и цитоплазмы гриба из штамма Candida albicans № 253 с концентрацией клеток гриба спор 1,85·10⁸-2,5·10⁸ в 1 см³ дистиллированной воды2,0-2,7Формалин0,1-0,15Дистиллированная водаОстальное