СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОГЕННОСТИ АНТИГЕНОВ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/53 G01N33/569 

Изобретение относится к микробиологии, в частности микологии, и может быть использовано для оптимизации контроля процесса культивирования культур грибов и иммунологической оценки антигенов.

Иммуногенная активность микроорганизмов является определяющим моментом при изготовлении антигенов для диагностических наборов и лечебно-профилактических препаратов.

Известно, что в проявлении иммуногенных свойств у грибов родов: Candida, Aspergillus и Mucor основную роль играют растворимые антигены. Растворимые антигены цитоплазмы грибов на различных этапах культивирования имеют неоднородный состав. Поэтому при культивировании грибов целесообразно учитывать стадии их роста, которые влияют на антигенный состав и соответственно на проявление иммуногенных свойств.

Известен способ оценки иммуногенности культур (см. Карпухин Г.И., Шапиро Н. И., Андриевская Р.А. "Химические вакцины для профилактики кишечных инфекций", Л., "Медицина", 1979, с. 99-112) путем расчета коэффициента иммунологической эффективности по тесту активной защиты мышей (АЗМ), заключающийся в иммунологической оценке защиты животных от летальных доз инфекции в сравнении с интактными мышами или с действием стандартных антигенов.

Однако, способ оценки иммуногенности по тесту АЗМ недостаточно точен, что обусловлено своеобразием характера зависимости доза-эффект в системе антиген- организм. Это своеобразие определяется выраженной неоднородностью индивидуальных реакций животных на иммунизацию, которая зависит от гетерогенности используемых в опытах животных и специфики взаимодействия иммуногенных субстанций с физиологическими системами организма. В соответствии с законами статистики этот недостаток теста АЗМ может быть устранен только при использовании большего числа животных.

Известен способ оценки иммуногенности микробных культур (см. а.с. СССР N 1818348 по кл. C 12 Q 1/00, опуб. 30.05.93 г.), заключающийся в подкожной иммунизации экспериментальных животных и оценке результатов, при этом на 6-8-е сутки после иммунизации выделяют перитонеальные макрофаги, разделяют их на субпопуляции, а иммуногенность оценивают по величине соотношения между популяциями.

Однако, способ трудоемок и не экономичен, поскольку для его реализации требуется много лабораторных животных, а процедура разделения перитонеальных макрофагов на субпопуляции длительна и сложна. Кроме этого, способ используется только для определения иммуногенности противочумных вакцин и не предназначен для определения иммуногенности антигенов грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor.

Известен также способ оценки иммуногенности микробных культур (см. Карпухин Г.И., Шапиро Н.И., Андриевская Р.А. "Химические вакцины для профилактики кишечных инфекций", Л., "Медицина", 1979 г.), заключающийся в иммунизации лабораторных животных, исследовании сыворотки крови этих животных с помощью серологических реакций и оценке отдельных показателей факторов иммунитета (например, титров агглютинации, фагоцитарной активности и пр.).

Однако, данный метод неприменим при оценке иммуногенности антигенов грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor. Кроме этого, титры агглютининов не отражают степени эффективности иммунизации, а свидетельствуют только о подготовке антигенов грибов к действию комплемента и фагоцитов. Способ так же, как и предыдущий аналог, не экономичен и трудоемок, так как для его реализации требуются лабораторные животные, их иммунизация и серологические исследования сыворотки крови.

Наиболее близким к заявляемому является способ оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов (см. Федотов В.Б., Ласкавый В.Н. "Сравнительное определение иммуногенности эшерихий методом агломерации лейкоцитов", Бюллетень ВИЭВ, вып.5, М., 1985, с. 24-25), заключающийся в смешивании антигенов эшерихий с комплементом морской свинки, добавлении стабилизированной крови кролика, инкубировании смеси, приготовлении мазков, окрашивании их 0,1%-ным раствором метиленовой сини, выборе фиксированного анализируемого количества лейкоцитов (в данном методе - 1000 лейкоцитов), определении среди них количества склеенных лейкоцитов и оценке иммуногенности по величине индекса агломерации как отношения числа склеенных лейкоцитов к анализируемому количеству лейкоцитов.

Однако, способ направлен на решение задачи оценки иммуногенности эшерихий по определению К-антигена и не предназначен для определения степени иммуногенности антигенов культур грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor, более того следует отметить, что К-антигены у культур грибов вообще отсутствуют.

Кроме этого, способ трудоемок, так как предполагает подсчет не менее 1000 лейкоцитов вследствие получения низких коэффициентов агломерации (1,8-5,6) с антигенами эшерихий.

Изобретение направлено на решение задачи оценки иммуногенности растворимых антигенов грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor при дешевизне и простоте способа.

Для решения поставленной задачи в способе оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов, заключающемся в смешивании антигенов с комплементом морской свинки, добавлении стабилизированной крови кролика, инкубировании смеси и приготовлении мазков, выборе фиксированного анализируемого количества лейкоцитов, определении среди них числа склеенных (агломерированных) лейкоцитов и оценке результатов по величине индекса агломерации как отношения числа склеенных лейкоцитов к анализируемому количеству лейкоцитов, согласно изобретению, в качестве антигенов микроорганизмов используют цитоплазматическую фракцию грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor, после инкубирования смеси дополнительно осуществляют фиксацию мазка метиловым спиртом, анализируемое количество лейкоцитов выбирают равным 100, а антигены считают иммуногенными при величине индекса агломерации 6-16%. При этом, антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Candida считают иммуногенным при величине индекса агломерации 6-10%. Антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Aspergillus считают иммуногенным при величине индекса агломерации лейкоцитов 6-16%. Антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Mucor считают иммуногенным при величине индекса агломерации лейкоцитов 6-15%.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа оценки иммуногенности антигенов в виде цитоплазматической фракции грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor, позволяющего просто и с минимальными затратами оценивать иммуногенность путем определения индекса агломерации лейкоцитов. Более того, в доступных неограниченному кругу лиц литературных источниках не описано каких-либо методов оценки иммуногенности грибковых антигенов рода Candida, Aspergillus и Mucor, что позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом решении критериев "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ осуществляется следующим образом.

Получают цитоплазматическую фракцию грибов рода Candida, Aspergillus или Mucor. Для этого из авирулентных штаммов Candida albicans, Aspergillus fumigatus и Mucor racemosus через определенные промежутки культивирования отбирают пробы (не менее трех для каждого исследования). Пробы разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего производят разрушение клеточной стенки мицелия. При этом, разрушение производят либо с помощью последовательного замораживания и оттаивания проб, либо посредством воздействия ультразвукового дезинтегратора в течение 90 с.

К полученному антигену добавляют комплемент морской свинки, а затем стабилизированную кровь кролика. Смесь инкубируют, после чего наносят на предметные стекла и осуществляют фиксацию мазков метиловым спиртом в течение 20 мин. Затем мазки окрашивают 0,1%-ным раствором метиленовой сини. Полученные мазки анализируют при увеличении х 450. Для этого выбирают 100 лейкоцитов, среди которых подсчитывают число склеенных, при этом агломерированными считают те лейкоциты, которые склеиваются в количестве не менее трех. Определяют индекс агломерации как отношение числа склеенных в общем числе выбранных для анализа лейкоцитов, а антиген считают иммуногенным при величине индекса агломерации 6-16%.

Индекс агломерации для каждого из антигенов был подобран экспериментально путем внутримышечной иммунизации лабораторных кроликов вакцинными препаратами, приготовленными из полученных антигенов культур Candida, Aspergillus и Mucor. Иммунизацию осуществляли по стандартной методике - двукратно с интервалом 8-10 дней в дозе по 5 мл на каждое животное.

Защитные функции организма животных оценивали для препаратов, полученных из антигенов культур Candida - по титру специфических антител с помощью иммуноферментной тест-системы, а из антигенов культур Aspergillus и Mucor - по числу выживших животных после контрольного заражения их вирулентными штаммами.

Пример. Отбирают по 3 пробы культуры гриба из штамма Candida albicans через 8 ч культивирования. Пробы разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего смесь подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора в течение 90 с, в результате чего получают цитоплазматическую фракцию.

В пробирки вносят по 0,04 мл полученного антигена гриба рода Candida albicans, добавляют к нему по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 мин при 37^oC, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика. При этом, контролем служат антигены с изотоническим раствором хлорида натрия и стабилизированной кровью кролика, а также стабилизированная кровь кролика с комплементом морской свинки и изотоническим раствором хлорида натрия.

Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 37^oC в течение 45 мин.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, при этом мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 20 мин. Затем мазки окрашивают 0,1%-ным раствором метиленовой сини в течение 5 мин.

Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении х450 и выбирают для анализа 100 лейкоцитов. Среди них выявляют число склеенных - 11. Поскольку индекс агломерации равен 11%, антиген считают слабо иммуногенным.

Аналогичные исследования проводят с антигенами 16, 22, 28, 36, 47, 56, 64-часовых культур.

В таблицах 1-3 представлены результаты оценки иммуногенности антигенов цитоплазматической фракции грибов Candida albicans, Aspergillus fumigatus и Mucor racemosus, где n - количество проб для каждого времени отбора культур.

Таким образом, заявляемый способ позволяет при минимальных затратах быстро, эффективно и просто определять иммуногенность антигенов грибов рода Candida, Aspergillus, Mucor.

Для реализации способа не требуется использование лабораторных животных.

Предлагаемый способ позволил решить проблему определения иммуногенности грибковых антигенов.

Изобретение относится к микробиологии, в частности микологии, и может быть использовано для оптимизации контроля процесса культивирования культур грибов и иммунологической оценки антигенов. В способе оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов, заключающемся в смешивании антигенов с комплементом морской свинки, добавлении стабилизированной крови кролика, инкубировании смеси и приготовлении мазков, выборе фиксированного анализируемого количества лейкоцитов, определении среди них числа склеенных (агломерированных) лейкоцитов и оценке результатов по величине индекса агломерации как отношения числа склеенных лейкоцитов к анализируемому количеству лейкоцитов, согласно изобретению в качестве антигенов микроорганизмов используют цитоплазматическую фракцию грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor. После инкубирования смеси дополнительно осуществляют фиксацию мазка метиловым спиртом, анализируемое количество лейкоцитов выбирают равным 100. При этом антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Candida считают иммуногенным при величине индекса агломерации 6-10%. Антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Aspergillus считают иммуногенным при величине индекса агломерации лейкоцитов 6-16%. Антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Mucor считают иммуногенным при величине индекса агломерации лейкоцитов 6-15%. Изобретение обеспечивает простой и дешевый способ оценки иммуногенности растворимых антигенов грибов рода Candida, Aspergillus и Mucor. 3 табл.

Способ оценки иммуногенности антигенов микроорганизмов путем смешивания их с комплементом морской свинки, добавления стабилизированной крови кролика, инкубирования смеси, приготовления мазков, выбора фиксированного анализируемого количества лейкоцитов, определения среди них числа склеенных лейкоцитов и оценки результатов по величине индекса агломерации как отношения числа склеенных лейкоцитов к анализируемому количеству лейкоцитов, отличающийся тем, что в качестве антигенов микроорганизмов используют цитоплазматическую фракцию грибов рода Candida, или рода Aspergillus, или рода Mucor, после инкубирования смеси дополнительно осуществляют фиксацию мазка метиловым спиртом, анализируемое количество лейкоцитов выбирают равным 100, при этом антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Candida считают иммуногенным при величине индекса агломерации 6-10%, антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Aspergillus считают иммуногенным при величине индекса агломерации 6-16%, а антиген в виде цитоплазматической фракции гриба рода Mucor считают иммуногенным при величине индекса агломерации 6-15%.