ШТАММ FELINE CALICIVIRUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН, ИЗГОТОВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/125 C12N7/00 C12N7/00 C12R1/93 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к новому штамму feline calicivirus, используемому для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления инактивированных вакцин и получения специфических лечебно-профилактических и диагностических сывороток и глобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к калицивирусу кошек.

По литературным данным за рубежом различными авторами в различное время выделялись штаммы feline calicivirus. Впервые калицивирус был выделен и описан Fastier L.B. (1957 г.) в Новой Зеландии, Bolin (1957 г.) в Америке, Burki (1963 г.) в Швеции, Zwillenberg и Burki (1966 г.) в Австрии, Torlone (1960 г. ), Prydie (1966 г.) в Англии, Studdert (1970 г.) в Австралии. Подробной характеристики и областей использования ни одного из указанных штаммов калицивируса не приводится. В нашей стране мы не нашли сообщений о выделении от кошек штаммов feline calicivirus или закупке импортных штаммов вируса.

Целью изобретения является получение культурального штамма калицивируса кошек, обладающего стабильной инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, который может быть использован для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления инактивированных вакцин и получения специфических лечебно-профилактических и диагностических сывороток и глобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к калицивирусу кошек.

Штамм feline calicivirus "Ларс" получен из выделенного в 1993 году изолята вируса feline calicivirus от больной беспородной кошки 3-месячного возраста с признаками острого респираторного заболевания путем последовательных пассажей на субкультуре клеток почки кошки.

В том же году штамм депонирован в коллекцию микроорганизмов Государственного учреждения Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер - 30 ДЕП.

Штамм feline calicivirus штамм "Ларс" ВГНКИ 30 характеризуется следующими признаками и свойствами:
Морфологические свойства.

Вирионы имеют икосаэдральную форму, безоболочечные, напоминают по форме "Звезду Давида". Диаметр вирионов колеблется от 37 до 40 нм.

Культуральные свойства.

Вирус хорошо размножается в культуре клеток почки кошки, перевиваемых культурах клеток: CrFk (почки кошки), Fs (селезенки кошки) и других клетках кошачьего происхождения. Вызывает цитопатическое действие (ЦПД). При культивировании в первично-трипсинизированной культуре клеток почки кошки и в перевиваемых культурах клеток CrFk, Fs титр вируса составляет 6-8 lgТЦД 50/см³. Цитопатическое действие вируса штамма "Ларс" в использованных культурах проявляется через 6-10 часов после заражения округлением значительного количества клеток, постепенной их дегененерацией и отделением от стекла с образованием пустот в виде "сетки".

Антигенные свойства.

Штамм "Ларс" при парентеральном введении кроликам индуцирует образование вируснейтрализующих антител в титрах 6-9log₂.

Вирулентность.

При ороназальном и интратрахеальном заражении интактных кошек культуральной расплодкой штамма в дозе 10⁷ ТЦД 50/см³ клинические признаки калицивирусной инфекции проявляются у всех животных на 3-6 сутки. У животных отмечают снижение аппетита, кашель, ринит, катаральный конъюнктивит, язвенный стоматит, лихорадку (температура тела повышается до 40,0-41,0^oС. На 8-9 день с момента появления клинических признаков болезни в 70% случаев происходит падеж, в 30% клиническое выздоровление животных, причем около половины животных остаются вирусоносителями.

Стабильность основных свойств штамма.

Штамм "Ларс" сохраняет стабильную инфекционную и антигенную активность на протяжении 10 пассажей.

Серологические свойства.

Активен в реакции нейтрализации со специфической сывороткой.

Гемагглютинирующие свойства.

Штамм калицивироза кошек "Ларс" не агглютинирует эритроциты животных.

Безвредность для лабораторных животных.

Штамм калицивироза кошек "Ларс" безвреден для белых мышей, морских свинок и кроликов при внутримышечном, подкожном и оронозальном введении.

Дополнительные сведения о штамме.

Штамм "Ларс" свободен от бактериальных, микоплазменных, грибковых и вирусных контаминантов.

Способность штамма к распространению в естественных условиях.

Заражение животных в окружающей среде происходит аэрогенно и через контакт здоровых животных с выделениями больных. Инкубационный период 3-6 дней.

Основные условия хранения.

Штамм "Ларс" калицивируса кошек лиофилизированный со стабилизирующими добавками сохраняет активность при -20^oС не менее одного года.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
Штамм калицивируса кошек "Ларс" используют для изучения его вирулентных свойств для кошек. Вирус с активностью 7 lg ТЦД 50/см³ вводят 2 группам котят 2-6-месячного возраста ороназально и интратрахеально в дозе 1 см³. До заражения сыворотки крови животных исследуют на наличие специфических антител в РН в культуре клеток почек котенка с калицивирусным антигеном активностью 100 ТЦД 50/см³. Интактные котята заболевают на 3-5 день после заражения тем и другим способом с характерной для вирусных респираторных болезней клинической картиной: лихорадкой, ринитом, конъюнктивитом, язвенным стоматитом, пневмонией. Котята, в сыворотке крови которых титр гуморальных антител составляет 5 log₂ и выше не заболевают при данных условиях заражения.

Пример 2
Проводят исследования по изучению безвредности штамма калицивируса кошек "Ларс" для белых мышей, морских свинок и кроликов. Вирус с активностью 7 lg ТЦД 50/см³ вводят ороназально 3 группам по 5 серонегативных животных: белым мышам, морским свинкам и кроликам в объемах: 0,3 см³, 0,5 см³ и 1,0 см³ соответственно. Наблюдают за зараженными животными 14 суток. На протяжении периода наблюдения все животные остаются клинически здоровыми.

Пример 3
Проводят исследования по изучению стабильности вирулентных свойств штамма калицивируса кошек "Ларс" после 10 пассажей на культурах клеток почки кошки, CrFk (почки кошки), Fs (селезенки кошки). Проводят по 10 пассажей вируса на указанных культурах клеток и получают вирусные сборы с активностью не ниже 7 lg ТЦД 50/см³. Серонегативным по калицивирусу котятам 3-5-месячного возраста вводят ороназально по 1 см³ вируса однократно. Котята заболевают на 4 - 7 день после заражения с характерной для вирусных респираторных заболеваний клинической картиной: лихорадкой, ринитом, конъюнктивитом, язвенным стоматитом, пневмонией.

Пример 4
Проводят исследования по изучению стабильности штамма калицивируса кошек "Ларс" при хранении в лиофилизированном виде. Калицивирус с активностью 8,5 lg ТЦД 50/см³ смешивают со средой высушивания ВГНКИ в соотношении 1:1 и лиофилизируют. Определяют активность вируса титрованием в культуре клеток Fs до и после лиофилизации и при дальнейшем хранении при температуре минус 20^oС с интервалом полгода. Снижение титра калицивируса при сушке на среде ВГНКИ составляет 0,2-0,5 lg ТЦД 50/см³. Снижение титра калицивируса при хранении в течение полугода при температуре минус 20^oС составляет 0,1 lg ТЦД 50/см³, в течение года - 0,3 lg ТЦД 50 /см³, полутора лет - 0,5 lg ТЦД 50, двух лет - 1,0 lg ТЦД 50 /см³.

Пример 5
Определяют антигенные свойства инактивированного штамма калицивируса кошек "Ларс" для кошек. Для этого получают культуральную расплодку вируса на перевиваемой линии клеток Fs. Вирусный сбор с титром 9 lg ТЦД 50/см³ инактивируют формалином, конечная концентрация которого составляет 0,2%. Пяти кошкам 4-месячного возраста вводят подкожно однократно инактивированный антиген в объеме 1 см³. Максимальное накопление антител в сыворотках крови кошек регистрируют на 21 сутки после введения калицивируса. На протяжении этого периода происходит их постепенное нарастание. Титр после однократного введения антигена в РНГА составляет 6-8 log₂.

Пример 6
Специфические гипериммунные сыворотки на штамм калицивируса кошек "Ларc" получают на кроликах и козах. Используют 2 способа иммунизации: еженедельное 3-кратное введение антигена в объеме 1 см³ кролику и 3 см³ козе и иммунизацию малыми дозами антигена, при которой антиген вводят внутримышечно в том же объеме и добавлении полного адъюванта Фрейнда (1:1), а затем через 2 месяца без адъюванта внутривенно в объеме 0,3 см³ и 0,5 см³ соответственно. Отбор крови для получения проб сывороток производят через 14, 21 и 28 дней после последнего введения антигена. Активность полученных сывороток устанавливают в РН. Специфичность полученных сывороток проверяют в РН с данным вирусом и вирусом ПЛК.

При использовании различных методов гипериммунизации кроликов на всех животных получают активные в РН сыворотки крови. У кроликов и коз контрольной группы они являются негативными. Сыворотки крови кроликов, которым вводят антиген еженедельно, обладают активностью в РН 6,0-7,5 log₂, коз - 5,5-7,5 log₂. Более высокую активность в РН проявляют сыворотки крови, которые получают от кроликов и коз, иммунизированных малыми дозами антигена - 7,6-8,5 log₂ и 8,0-8,8 log₂ соответственно. Полученные сыворотки не проявляют активности в РН с вирусом панлейкопении кошек.

Полученные гипериммунные сыворотки используют для диагностики калицивироза в серологических реакциях и для специфического лечения больных животных. Сыворотки хранят в лиофилизированном или нативном виде при температуре минус 10-20^oС в течение 24 месяцев.

Пример 7
Получают глобулин из сыворотки крови гипериммунизированных коз с титром 8,0 log₂ в РН и кошек - с титром 8,5 log₂ в PH. Для этого используют общепринятый метод его высаливания насыщенным раствором натрия сульфата.

Осадок глобулина ресуспендируют фосфатным буферным раствором рН 7,2. Титр глобулина из сыворотки крови коз после ресуспендирования составляет 8,5 log₂ в РН, кошек - 9,25 log₂.

Полученные глобулины используют для диагностики калицивироза в серологических реакциях и для специфического лечения больных животных. Глобулины хранят в лиофилизированном или нативном состоянии при температуре минус 10-18^oС в течение 24 месяцев.

Пример 8
Диагностическую сыворотку к калицивирусу кошек, полученную, как описано в примере 6, используют для идентификации изолятов вирусов, выделенных от кошек с признаками респираторных заболеваний. Для этого содержимое ампулы с лиофилизированной сывороткой растворяют в 10 см³ ростовой культуральной среды. Исследуемые образцы изолятов калицивируса и контрольный образец калицивируса кошек штамма "Ларс" (положительный контроль антигена) соединяют с разведенной сывороткой в соотношении 1:1. Полученную смесь инкубируют 1 час при комнатной температуре и вносят по 1 см³ в пробирки с культурой клеток почки кошки на сформированный монослой (по 4 пробирки на каждый образец). Параллельно в 4 другие пробирки с культурой клеток вносят по 1 см³ разведения изолятов 1:2 в поддерживающей культуральной среде без сыворотки. Контролем культуры клеток служат незараженные пробирки с монослоем клеток, куда вносят по 1 см³ поддерживающей культуральной среды без сыворотки и вируса. Все пробирки помещают в термостат на 7 дней и ежедневно микроскопируют. Диагностическая сыворотка нейтрализует ЦПД изолятов, содержащих калицивирус кошек, что проявляется отсутствием ЦПД в пробирках, содержащих смесь вируса и позитивной сыворотки. В пробирках, содержащих тот же изолят калицивируса без сыворотки, ЦПД проявляется в первые сутки характерным округлением клеток, а затем их отторжением от стекла с образованием пустот в виде "сетки". При исследовании проб изолятов, не содержащих калицивирус, в пробирках с этим изолятом характерного ЦПД не проявляется, а в случае появления неспецифического ЦПД оно наблюдается также в пробирках, содержащих данный изолят и антикалицивирусную сыворотку. В контрольных пробирках с незараженной культурой клеток не наблюдается дегенеративных изменений клеточного монослоя.

Пример 9
Проводят оценку антигенной активности калицивируса в вакцине "Трикет" против калицивироза, инфекционного ринотрахеита и панлейкопении кошек, производства фирмы Нобивак, Голландия, сер. 9515Е. Для этого кошек 2-4-месячного возраста вакцинируют указанной вакциной в дозе 1 см³ согласно наставлению по применению. Перед вакцинацией и через 21 день у всех привитых щенков берут пробы крови и получают сыворотки крови.

Для определения титра вируснейтрализующих антител к калицивирусу кошек полученные сыворотки исследуют в РН с 100 ТЦД 50/см³ штамма калицивируса "Ларс" в перевиваемой культуре клеток Fs. В качестве положительной контрольной сыворотки в РН используют специфическую диагностическую сыворотку к калицивирусу кошек, полученную, как описано ниже в примере 6. Оценку реакции проводят через 7 суток по развитию ЦПД в культуре клеток. Титр вируснейтрализующих антител в сыворотках крови привитых кошек составляет 1:32 - 1: 256. При сравнении результатов титрования сывороток, полученных от кошек перед вакцинацией и после, отмечают, что у всех подопытных животных титры специфических антител к возбудителю калицивироза возрастают не менее чем в 2 раза, а у серонегативных до вакцинации животных становятся не ниже, чем 1: 32.

Таким образом установлено, что калицивирусный компонент в вакцине "Трикет" является активным и, следовательно, вакцина по данному компоненту пригодна для использования.

Пример 10
Вакцину против калицивироза кошек получают путем культивирования калицивируса в монослое клеток почек котенка.

Для заражения используют культуральный калицивирус шт. "Ларс" 2 уровня пассажей с активностью в РН 9 lg ТЦД 50/см³ в объеме 1 см³ на 200 см³ поддерживающей среды. Время культивирования составляет 48-72 часа. По истечении этого срока проводят однократное замораживание и оттаивание вируссодержащей культуральной жидкости. До инактивации вирусных сборов проводят электронную микроскопию для исключения их контаминации и определяют инфекционную активность вирусного сбора в культуре клеток. Активность вируса в РН должна быть не менее 7 lg ТЦД 50/см³. Вирус инактивируют формалином, конечная концентрация которого составляет 0,2%. В качестве адъюванта используют гидроксал в конечной концентрации 10%.

Вакцина против калицивироза кошек инактивированная представляет собой жидкость розового или сиреневато-розового цвета с рыхлым осадком, разбивающимся при встряхивании в гомогенную взвесь. Она пригодна к применению в течение 18 месяцев с даты ее изготовления при условии хранения при температуре 2-4^oС.

Проводят проверку вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой загрязненности. Для проверки вакцины на стерильность делают посевы на питательные среды МПА, МПБ, МППБ, Сабуро по общепринятой методике. Устанавливают, что приготовленная вакцина стерильна в микозном и бактериальном отношениях.

Проводят проверку вакцины на антигенную активность. Для этого 3-4-месячным серонегативным котятам и кроликам массой не менее 3 кг вакцину вводят подкожно однократно в дозе 1,0 см³. Сыворотки животных на 21 сутки после иммунизации исследуют в РН. Титр составляет 6-7 log₂. Вакцина антигенна.

Проводят проверку вакцины на безвредность. Для этого ее вводят подкожно 3 группам белых мышей соответственно по 0,1; 0,25 и 0,5 см³. Двум группам морских свинок - по 1,5 и 2,5 см³. Двум группам кроликов - 2,5 и 5,0 см³. Котятам - 1,0 (1 доза); 2,0 (2 дозы) и 3,0 см³ (3 дозы). Контрольным животным вводят максимальное для данной группы количество культуральной жидкости без вируса и адъюванта. Наблюдают за всеми животными в течение 3 недель. Температура тела и общее клиническое состояние всех опытных животных в период наблюдения (21 сутки) остается нормальной, местной реакции на введение вакцины не отмечают. Препарат безвреден.

Проводят проверку вакцины на иммуногенность для кошек. Для этого используют две группы по 4 серонегативных котенка 3-4-месячного возраста. Первой группе котят вакцину вводят подкожно, однократно в дозе 1,0 см³. Второй группе котят (контрольной) вводят в том же объеме культуральную среду без вируса. Через 21 сутки после начала опыта всех котят заражают ороназально калицивирусом с активностью не менее 7 lg ТЦД 50/см³, который вводят в дозе 1 см³. Интактные котята контрольной группы заболевают на 3-5 день после заражения с характерной для вирусных респираторных болезней клинической картиной: лихорадкой, ринитом, конъюнктивитом, язвенным стоматитом, пневмонией. Общее клиническое состояние вакцинированных котят в период наблюдения (21 сутки) остается нормальным, местной реакции на введение вакцины не отмечают. Вакцина иммуногенна.

Пример 11
Изучают эффективность применения вакцины, полученной по примеру 10, в клинических условиях. Данной вакциной иммунизируют 47 кошек и 43 кота, из них 24 беспородных, 21 - персидских, 19 скотиш-фолд, 14 британских, 5 сиамских, 7 - девон-рекс. Возраст животных - от 2 мес до 5 лет, причем 82 привитых животных в возрасте до 1 года. Вакцину вводят согласно наставлению по ее применению подкожно в дозе 1 см³.

Ни в одном случае не наблюдают поствакцинальных реакций как местного, так и общего порядка. Ни у одного животного не отмечают угнетения, отказа от корма, аллергических реакций. Местных кожных реакций на введение вакцины не выявляют. Ни в одном случае не наблюдают поствакцинальных осложнений и заболеваний животных калицивирозом в течение года наблюдения за ними.

Пример 12
Изучают лечебные свойства гипериммунных сывороток, полученных по примеру 6, и глобулинов, полученных по примеру 7. В опыте используют 64 кошки различных пород и возраста, диагноз "калицивироз" у которых подтверждают в РН. В 16 случаях для лечения используют только антибиотики, в 18 случаях наряду с применением тех же антибиотиков неспецифическое лечение дополняют использованием гипериммунной сыворотки (полученной по примеру 6) с титром 8,0 log₂, в 14 - случаях глобулина (полученного по примеру 7) из сыворотки коз, в 16 - глобулина из сыворотки кошек. Специфические препараты вводят кошкам подкожно, по 1,0 см³ в сутки, в течение 3 суток. Во всех случаях использования специфических препаратов устанавливают выздоровление кошек, которое наступает через 24-72 часа, что раньше, чем обычно на 3-5 суток, и ни в одном случае не отмечают рецидивов или осложнений болезни. В группе кошек, которым назначают только антибиотики, отмечают не менее 2 летальных исходов болезни; в группе, где проводят серотерапию, летальных случаев не отмечают. У одного котенка породы девон-рекс регистрируют аллергическую реакцию на второе введение сыворотки козы, выраженную гиперемией участков кожи и зудом. Эту реакцию устраняют однократным введением раствора димедрола в общепринятых дозах. При введении глобулинов котятам того же помета аллергических реакций не отмечают. Проведенными исследованиями устанавливают терапевтическую эффективность использования специфических сывороток и глобулинов при лечении калицивироза кошек.

Использование в ветеринарной практике штамма feline calicivirus "Ларс" ВГНКИ 30 позволит с достаточной достоверностью судить о качестве изготавливаемых и используемых биопрепаратов против калицивироза кошек, изготавливать на его основе высокоиммуногенную вакцину против калицивироза кошек, получать гипериммунные сыворотки на разных видах животных для лечения и профилактики калицивироза кошек, использовать антиген и полученную на него сыворотку в серологических реакциях для диагностики калицивироза кошек.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Штамм Feline calicivirus обладает стабильной инфекционной, атигенной и иммуногенной активностью. Штамм используется в качестве тест-анализа биопрепаратов против калицивироза кошек, позволяет готовить на его основе высокоиммуногенную вакцину против калицивироза кошек, получать гипериммунные сыворотки на животных для лечения и профилактики калицивироза кошек, а также использовать антиген и полученную на него сыворотку в серологических реакциях для диагностики калицивироза кошек.

Штамм Feline calicivirus ВГНКИ "Ларс-30-ДЕП", используемый для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления специфических лечебно-профилактических и диагностических биопрепаратов.