МОДИФИЦИРОВАННАЯ Tn5-ТРАНСПОЗАЗА, НАБОР ДЛЯ ТРАНСПОЗИЦИИ, СПОСОБ ТРАНСПОЗИЦИИ, ФРАГМЕНТ ДНК И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ МОБИЛЬНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК Российский патент 2003 года по МПК C12N15/55 C12N15/85 C12N9/22 

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Изобретение относится к генетической инженерии. В заявке описан набор для транспозиции in vitro, включающий ДНК-донора, которая несет мобильный генетический элемент, фланкированный парой последовательностей-повторов внешних концов бактериального транспозона Tn5, ДНК-мишень, в которую мобильный генетический элемент может быть перенесен, и модифицированную Tn5-транспозазу. Представлена модифицированная Tn5-транспозаза, которая с меньшей вероятностью по сравнению с Tn5-транспозазой дикого типа принимает неактивную многомерную формулу. Модифицированная транспозаза имеет замену в положении 54, 372 Tn5-транспозазы дикого типа и необязательно в положении 56. Для транспозиции in vitro объединяют молекулу ДНК-донора с молекулой ДНК-мишени и с модифицированной Tn5-транспозазой. Описан фрагмент ДНК, кодирующий модифицированную Tn5-транспозазу. Генетическая конструкция мобильной последовательности ДНК включает на своих 5' и 3' концах фланкирующие последовательности 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' или 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3', совместимые с модифицированной Тn5 транспозазой. Изобретение позволяет увеличить скорость реакции транспозиции и отказаться от использования внешнего высокоэнергетического источника. 5 с. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.

1. Модифицированная Тn5-транспозаза, которая включает замену в положении 54 Тn5-транспозазы дикого типа, которым обусловлено то, что модифицированная транспозаза связывается с большей авидностью с последовательностями-повторами внешнего конца Тn5, чем Тn5-транспозаза дикого типа, и замену в положении 372 Тn5-транспозазы дикого типа, которым обусловлено то, что модифицированная транспозаза с меньшей вероятностью по сравнению с транспозазой дикого типа принимает неактивную многомерную форму.2. Модифицированная Тn5-транспозаза по п.1, отличающаяся тем, что замена в положении 54 представляет собой лизин.3. Модифицированная Тn5-транспозаза по п.1 или 2, отличающаяся тем, что замена в положении 372 представляет собой пролин.4. Модифицированная Тn5-транспозаза по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что модифицированная транспозаза дополнительно включает мутацию, характеризующуюся заменой в положении 56 транспозазы дикого типа.5. Модифицированная Тn5-транспозаза по п.4, отличающаяся тем, что замена в положении 56 представляет собой аланин.6. Набор для транспозиции in vitro мобильной последовательности ДНК, включающий модифицированную Тn5-транспозазу по любому из предыдущих пунктов; молекулу ДНК-донора, включающую мобильную последовательность ДНК, причем последовательность ДНК фланкирована на своих 5'- и 3'-концах последовательностями-повторами внешнего конца, совместимыми с Тn5 транспозазой, и молекулу ДНК-мишени, в которую может переноситься мобильный генетический элемент.7. Набор по п.6, отличающийся тем, что молекула ДНК-донора фланкирована на своих 5'- и 3'-концах фланкирующей последовательностью ДНК, которая состоит из 18 или 19 пар оснований и включает нуклеотид А в положении 10, нуклеотид Т в положении 11 и нуклеотид А в положении 12.8. Набор по п.7, отличающийся тем, что фланкирующая последовательность включает нуклеотид в положении 4, выбранный из группы, включающей А или Т; нуклеотид в положении 15, выбранный из группы, включающей G или С; нуклеотид в положении 17, выбранный из группы, включающей А или Т; нуклеотид в положении 18, выбранный из группы, включающей G или С.9. Набор по п.7 или 8, отличающийся тем, что фланкирующая последовательность имеет последовательность 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' или 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3'.10. Способ транспозиции in vitro, включающий объединение молекулы ДНК-донора, которая включает мобильную представляющую интерес последовательность ДНК, фланкированную на своих 5'- и 3'-концах последовательностями-повторами внешнего конца, совместимыми с Тn5 транспозазой, с молекулой ДНК-мишени и с модифицированной Тn5-транспозазой по любому из пп.1-5.11. Способ по п.10, отличающийся тем, что представляющая интерес последовательность ДНК фланкирована на своих 5'- и 3'-концах фланкирующей последовательностью ДНК, которая состоит из 18 или 19 пар оснований и включает нуклеотид А в положении 10, нуклеотид Т в положении 11 и нуклеотид А в положении 12.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что фланкирующая последовательность включает нуклеотид в положении 4, выбранный из группы, включающей А или Т; нуклеотид в положении 15, выбранный из группы, включающей G или С; нуклеотид в положении 17, выбранный из группы, включающей А или Т; нуклеотид в положении 18, выбранный из группы, включающей G или С.13. Способ по п.11, отличающийся тем, что фланкирующая последовательность имеет последовательность 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' или 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3'.14. Фрагмент ДНК, кодирующий модифицированную Тn5-транспозазу по любому из пп.1-5.15. Фрагмент ДНК по п.14, отличающийся тем, что в Тn5-транспозазе в положении 54 присутствует остаток лизина, в положении 372 - остаток пролина.16. Фрагмент ДНК по п.15, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1.17. Генетическая конструкция мобильной последовательности ДНК, которая включает на своих 5'- и 3'-концах фланкирующие последовательности 5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3' или 5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3', совместимые с модифицированной Тn5 транспозазой по п.1.

Приоритет по пунктам: