СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ ПРИ ПОМОЩИ КОМПЛЕМЕНТАРНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ Российский патент 2016 года по МПК C12N15/10 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам идентификации жизненно важного гена, который служит мишенью для антибиотиков в бактерии, к способам идентификации антибиотиков и к способам получения антибиотиков и фармацевтических композиций, содержащих антибиотики.

Уровень техники

Существует насущная необходимость разработки новых антибиотиков, чтобы противостоять появлению новых патогенов и резистентности к существующим противомикробным препаратам. Важной задачей является идентификация мишеней для антибиотиков-кандидатов, поскольку такая информация может открыть доступ к большому количеству близких по функции новых семейств лекарственных препаратов. Например, открытие пенициллин-связывающих белков как мишени пенициллина привело к разработке большого семейства антибиотиков, включая несколько поколений цефалоспоринов, пенициллинов и карбапенемов (см. Schmid (2006) Nature Biotechnology 24(4): 419-420).

Недавно было описано транспозон-направленное секвенирование сайтов встраивания (TraDIS - см. Langridge et al. (2009) Genome Research 19: 2308-2316), и оно было применено для идентификации: (а) жизненно важных генов; (б) генов, полезных для роста (но нежизненно важных); (в) генов, неблагоприятных для роста при определенных условиях; и (г) генов, участвующих в придании устойчивости к определенным условиям («нише-специфичные» жизненно важные гены). Похожие технологии были описаны, например, у Gawronski et al. (2009) PNAS 106: 16422-16427; Goodman et al. (2009) Cell Host Microbe 6: 279-289; van Opijnen et al. (2009) Nat. Methods 6: 767-772 and Gallagher et al. (2011) mBio 2(1):e00315-10, и в настоящее время такие технологии в совокупности назвали технологией «Tn-seq».

Однако важным классом мишеней для действия антибиотиков являются продукты генов, участвующие в клеточных процессах, важных для жизнеспособности при применяемых условиях роста. Такие мишени нельзя идентифицировать способом Tn-seq (включая TraDIS), поскольку вставки транспозонов в жизненно важные гены (включая гены, выступающие в роли мишеней действия антибиотиков) не представлены в значительной степени в общем числе мутантов. Таким образом, различий в распределении транспозонов после роста общей совокупности мутантов в присутствии или в отсутствии антибиотиков (или с разным их количеством) не возникает, вследствие чего Tn-seq не позволяет провести различие между жизненно важным геном и жизненно важным геном, выступающим в роли мишени для антибиотиков.

Следовательно, существует потребность в высокоэффективном функциональном скрининге мишеней действия антибиотиков, который позволил бы выявлять жизненно важные гены, служащие мишенями действия антибиотиков.

Сущность изобретения

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ идентификации жизненно важного гена, который служит мишенью действия антибиотиков в бактерии, указанный способ включает этапы:

(а) создания устойчивого к антибиотикам мутанта указанной бактерии при помощи способа, включающего этап отбора в ходе роста в присутствии указанного антибиотика для получения клона устойчивого к антибиотикам мутанта (мутант Ab^R);

(б) трансформации мутанта Ab^R: (i) одним или более жизненно важными генами указанной бактерии; и (ii) транспозоном, который при встраивании инактивирует ДНК бактерии, с получением совокупности транспозонных мутантов, которые меродиплоидны по указанному одному или более жизненно важным генам и которые содержат ген (гены), инактивированные транспозоном;

(в) выращивания бактерий из меродиплоидной совокупности в присутствии разных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и

(г) сравнения распределения вставок транспозонов между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью действия указанного антибиотика у указанной бактерии.

Предпочтительно на этапе (б) мутант Ab^R сначала трансформируют вектором ДНК, содержащим один или более жизненно важных генов указанной бактерии. Дополнительно, на этапе (б) мутант Ab^R сначала трансформируют вектором ДНК, содержащим один или более жизненно важных генов указанной бактерии, а затем транспозоном. Согласно таким вариантам реализации мутант Ab^R сначала могут трансформировать внехромосомным элементом (например, плазмидным или ВАС), содержащим: (i) один или более жизненно важных генов указанной бактерии; и (ii) одну или более последовательностей транспозонных повторов; а затем трансформировать (например, путем конъюгации с бактерией-донором) плазмидой для доставки транспозона, содержащей: (i) ген, кодирующий транспозазу; и (ii) сайты распознавания транспозазы обратных повторов; где одна или более последовательностей транспозонных повторов указанного внехромосомного элемента придают иммунитет к транспозиции в отношении транспозона, доставляемого плазмидой для доставки транспозона.

Указанный способ также может включать этапы:

(а) создания совокупности бактерий-мутантов путем транспозонного мутагенеза с применением активирующего транспозона (Tn_A), причем указанный Tn_A содержит промотор, такой, чтобы встраивание транспозона в ДНК бактерии повышало транскрипцию гена близи сайта встраивания;

(б) выращивания бактерий из совокупности мутантов в присутствии разных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и

(в) сравнения распределения вставок Tn_A между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика у указанной бактерии.

Согласно другому аспекту предложен способ идентификации антибиотика, включающий идентификацию жизненно важного гена, который служит мишенью для действия указанного антибиотика согласно способу, предложенному в настоящем изобретении.

Согласно дополнительному аспекту предложен способ получения антибиотика, включающий идентификацию антибиотика при помощи способа, включающего идентификацию жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика согласно способу, предложенному в настоящем изобретении. Такой способ может необязательно включать этап синтеза указанного антибиотика, а также необязательно может включать смешивание синтезированного антибиотика с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом с получением фармацевтической композиции.

Согласно еще одному аспекту предложен способ идентификации гена (например, жизненно важного гена), который служит мишенью для действия антибиотика у бактерии, способ, включающий этапы:

(а) трансформации бактерии при помощи внехромосомного элемента (например, плазмидного или ВАС), содержащего: (i) один или более жизненно важных генов указанной бактерии; и (ii) одну или более последовательность транспозонных повторов, с получением совокупности бактерий, которые меродиплоидны по указанному одному или более жизненно важным генам; и

(б) трансформации меродиплоидов в соответствии с этапом (а) плазмидой для доставки транспозона, содержащей: (i) ген, кодирующий транспозазу; и (ii) сайты распознавания транспозазы обратных повторов;

причем указанная одна или более последовательность транспозонных повторов для указанного внехромосомного элемента в соответствии с этапом (а) придает свойство иммунитета к транспозиции в отношении транспозона, доставляемого плазмидой в соответствии с этапом (б).

Согласно еще одному дополнительному аспекту предложена плазмида для доставки транспозона, содержащая: (i) ген, кодирующий транспозазу; и (ii) сайты распознавания транспозазы обратных повторов, для применения при реализации способа согласно настоящему изобретению.

Согласно другому аспекту предложен набор, включающий плазмиду для доставки транспозона, содержащую: (i) ген, кодирующий транспозазу; и (ii) сайты распознавания транспозазы обратных повторов, и необязательно также включающий плазмиду или ВАС, содержащие: (i) один или более жизненно важных генов указанной бактерии; и (ii) одну или более последовательность транспозонных повторов, причем указанные последовательности повторов придают иммунитет к транспозиции в отношении транспозона, доставляемого плазмидой для доставки транспозона.

Применение совокупностей транспозонных мутантов, полученых из устойчивых к антибиотику мутантов, которые меродиплоидны по одному или более жизненно важным генам, гарантирует, что встраивание транспозона в жизненно важные гены (включая гены, служащие мишенью для действия антибиотиков) представлено в исходной совокупности мутантов, поскольку встраивание транспозонов гены-мишени для действия антибиотиков приводит к образованию жизнеспособных фенотипов при неселективных условиях (когда копия жизненно важного гена дикого типа комплементирует инактивированную вследствие встраивания мутантную копию), но не при селективных условиях (когда копия жизненно важного гена дикого типа не комплементирует инактивированную вследствие встраивания мутантную копию).

Таким образом, можно легко определить различия в распределении транспозонов после выращивания указанной совокупности меродиплоидных мутантов с антибиотиком или без него, и это создает возможность для идентификации жизненно важных генов, служащих мишенями для действия антибиотиков.

Другие аспекты и предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения охарактеризованы и описаны в других пунктах формулы изобретения ниже.

Подробное описание изобретения

Все публикации, патенты, заявки на патенты и другие материалы, упоминаемые в настоящей заявке, включены в нее посредством ссылок на их полные версии для любых целей, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были специально и индивидуально указаны и включены посредством ссылки, и их содержание было цитировано целиком.

Определения и общие предпочтения

Подразумевается, что следующие термины, применяемые в настоящей заявке, за исключением случаев, когда указано другое, имеют следующие значения наряду с любыми более широкими (или узкими) значениями указанных терминов, которые могут применяться в данной области техники.

Если контекст не диктует иного, применение в настоящей заявке единственного числа следует понимать так, что оно включает множественное число, и наоборот. Неопределенные артикли единственного числа применительно к какой-либо сущности следует понимать так, что они относятся к одной или более таким сущностям. Сами по себе неопределенные артикли единственного числа, термин «один или более» и «по меньшей мере один» в настоящей заявке применяются взаимозаменяемо.

В настоящей заявке термин «включать» или его разновидности, такие как «содержит» или «содержащий», следует понимать так, что они указывают на включение любого из перечисленных целых чисел (например, особенность, элемент, характеристика, свойство, этап способа или ограничение) или группы целых чисел (например, особенностей, элементов, характеристик, свойств, этапов способа или ограничений), но не на исключение любого другого целого числа или группы целых чисел. Таким образом, в настоящей заявке термин «включающий» является охватывающим или неисчерпывающим и не исключает дополнительных, не перечисленных целых чисел и этапов способов.

Термин «ген» представляет собой термин, описывающий единицу наследования, включающую последовательность ДНК, которая занимает специфическое место в хромосоме или плазмиде и определяет конкретные характеристики организма. Ген может определять характеристику организма за счет кодирования полипептидной цепи, которая образует белок или часть белка (структурный ген); или может кодировать молекулу РНК; или регулировать работу других генов, или же угнетать такую работу; или влиять на фенотип посредством какого-либо другого, еще не идентифицированного, механизма.

Термин «геномная ДНК» представляет собой термин в области техники, применяемый в настоящей заявке для описания хромосомной ДНК в отличие от внехромосомной плазмидной ДНК.

Термин «геном» представляет собой термин в области техники, который описывает весь набор генетического материала в организме и, таким образом, включает хромосомную, плазмидную, профаговую и любую другую ДНК.

Термин «грамположительная бактерия» представляет собой термин в области техники, описывающий конкретный класс бактерий, которые объединены в одну группу на основании определенных характеристик окрашивания клеточной стенки.

Термин «грамположительная бактерия с низким G+C» представляет собой термин в области техники, описывающий конкретный подкласс родственных с эволюционной точки зрения бактерий в пределах класса грамположительных бактерий на основе состава оснований в ДНК. Данный подкласс включает виды Streptococcus, виды Staphylococcus, виды Listeria, виды Bacillus, виды Clostridium, виды Enterococcus и виды Lactobacillus.

Термин «Грамположительная бактерия с высоким G+C» представляет собой термин в области техники, описывающий конкретный подкласс родственных с эволюционной точки зрения бактерий в пределах класса грамположительных бактерий на основе состава оснований в ДНК. Данный подкласс включает актиномицеты (актинобактерии), включая виды Actinomyces, виды Arthrobacter, виды Corynebacterium виды Frankia, виды Micrococcus, виды Micromonospora, виды Mycobacterium, виды Nocardia, виды Propionibacterium и виды Streptomyces.

Термин «грамотрицательная бактерия» представляет собой термин в области техники, описывающий конкретный класс бактерий, которые объединены в одну группу на основании определенных характеристик окрашивания клеточной стенки. Примеры грамотрицательных бактерий включают Klebsiella, Acinetobacter, Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter и Neisseria.

В настоящей заявке термин «жизненно важной ген» представляет собой термин в области техники, описывающий конкретный класс генов, продукты которых необходимы для жизнеспособности, либо при всех условиях, либо при применяемых условиях роста. Важным подклассом жизненно важных генов являются гены, кодирующие продукты (например, белки, пептиды и регуляторные полинуклеотиды), которые вносят вклад в метаболические процессы, важные для жизнеспособности при значимых условиях роста (например, и в случае патогенных бактерий, при условиях, которые преобладают при инфекции или размножении в организме хозяина).

Антибиотики и мишени для действия антибиотиков

Антибиотик, применяемый для получения тестируемых культур согласно настоящему изобретению, является новым исследуемым антибиотиком (антибактериальным химиотерапевтических агентом), механизм действия (и, следовательно, биологические мишени) которого не известен. Во многих областях применения антибиотик выбирают из комбинаторных библиотек, библиотек природных продуктов, описанных химических объектов, пептидов, миметиков пептидов и олигонуклеотидов. Мишень воздействия антибиотика, идентифицируемая согласно настоящему изобретению, является жизненно важным геном/продуктом жизненно важного гена и, следовательно, может участвовать в одном или более из следующих биологических процессов в клетке бактерии-хозяина:

(а) деление клеток;

(б) репликация ДНК (включая полимеризацию и суперспирализацию);

(в) транскрипция (включая праймирование, элонгацию и терминацию);

(г) трансляцию (включая рибосомальные компоненты, инициацию, элонгацию и высвобождение);

(д) пути биосинтеза (включая пептидогликаны и жирные кислоты);

(е) сборка клеточной стенки; и/или

(ж) целостность клетки бактерий.

Бактерии для применения при реализации способов согласно изобретению

Способы согласно настоящему изобретению можно применять для идентификации мишеней для действия антибиотиков в любой бактерии. Таким образом, способы согласно настоящему изобретению находят применение при идентификации мишеней действия антибиотиков в: (а) грамположительных, грамотрицательных и/или грамвариабельных бактериях; (б) спорообразующих бактериях; (в) неспорообразующих бактериях; (г) нитчатых бактериях; (д) внутриклеточных бактериях; (е) облигатных анаэробах; (ж) факультативных анаэробах; (з) микроаэрофильных бактериях и/или (и) оппортунистических бактериальных патогенах.

Согласно определенным вариантам реализации способ согласно настоящему изобретению применяют для идентификации мишени действия антибиотиков в бактериях следующих родов: Acinetobacter (например, A. baumannii); Aeromonas (например, А. hydrophila); Bacillus (например, В. anthracis); Bacteroides (например, В. fragilis); Bordetella (например, B. pertussis); Borrelia (например, В. burgdorferi); Brucella (например, В. abortus, В. canis, В. melitensis и B. suis); Burkholderia (например, комплекс S. cepacia); Campylobacter (например, С. jejuni); Chlamydia (например, С trachomatis, С suis и С muridarum); Chlamydophila (например, С.pneumoniae, С pecorum, С. psittaci, С. abortus, С. felis и С. caviae); Citrobacter (например, С. freundii); Closthdium (например, С. botulinum, С difficile, С perfringens и С. tetani); Corynebacterium (например, С. diphteriae и С glutamicum); Enterobacter (например, Ε. cloacae и Ε. aerogenes); Enterococcus (например, Ε. faecalis и L. faecium); Eschehchia (например, Ε. coli); Flavobacterium; Francisella (например, F. tularensis); Fusobacterium (например, F. necrophorum); Haemophilus (например, H. somnus, H. influenzae и H. parainfluenzae); Helicobacter (например, H. pylori); Klebsiella (например, К. oxytoca и К. pneumoniae), Legionella (например, L. pneumophila); Leptospira (например, L interrogans); Listeha (например, L. monocytogenes); Moraxella (например, M. catarrhalis); Morganella (например, M. morganii); Mycobacterium (например, M. leprae и M. tuberculosis); Mycoplasma (например, M. pneumoniae); Neisseria (например, N. gonorrhoeae и N. meningitidis); Pasteurella (например, P. multocida); Peptostreptococcus; Prevotella; Proteus (например, P. mirabilis и P. vulgaris), Pseudomonas (например, P. aeruginosa); Rickettsia (например, R rickettsii); Salmonella (например, serotypes. Typhi и Typhimurium); Serratia (например, S. marcesens); Shigella (например, S. flexnaria, S. dysenteriae и S. sonnei); Staphylococcus (например, S. aureus, S. haemolyticus, S. intermedius, S. epidermidis и S. saprophyticus); Stenotrophomonas (например, S. maltophila); Streptococcus (например, S. agalactiae, S. mutans, S. pneumoniae и S. pyogenes); Treponema (например, Т. pallidum); Vibrio (например, V. cholerae) и Yersinia (например, Y. pestis).

Способы согласно настоящему изобретению можно применять для идентификации мишени для действия антибиотиков у бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, включая без ограничений устойчивые к пенициллину, устойчивые к метициллину, устойчивые к хинолонам, устойчивые к макролидам и/или устойчивые к ванкомицину штаммы бактерий, включая, например, Streptococcus pneumoniae, устойчивый к пенициллину, метициллину, макролидам, ванкомицину и/или к хинолонам; Staphylococcus aureus, устойчивый к пенициллину, метициллину, макролидам, ванкомицину и/или к хинолонам; Streptococcus pyogenes, устойчивый к пенициллину, метициллину, макролидам, ванкомицину и/или к хинолонам, и энтерококки, устойчивые к пенициллину, метициллину, макролидам, ванкомицину и/или к хинолонам.

Таким образом, способы согласно настоящему изобретению можно применять для идентификации мишени для действия у устойчивого к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), например, выбираемого из C-MSRA1, C-MRSA2, C-MRSA3, C-MSRA4, бельгийского MRSA, швейцарского MRSA и любого из штаммов EMRSA.

Соединения согласно настоящему изобретению можно применять для идентификации мишени для действия антибиотиков как у грамположительных бактерий с высоким G+C, так и у грамположительных бактерий с низким G+C.

Способы согласно настоящему изобретению находят конкретное применение при идентификации мишени для действия антибиотиков в бактериях, выбранных из Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli (включая ST131), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes и Neisseria gonorrhoeae.

Особенно предпочтительны способы идентификации мишеней для действия антибиотиков у Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii или Escherichia coli.

Совокупности мутантов

Способы согласно настоящему изобретению подразумевают создание совокупности мутантных бактерий при помощи транспозонного мутагенеза. Размер совокупности мутантов влияет на разрешение способа: по мере увеличения размера совокупности, будет представлено все больше разных генов с встраиванием транспозонов (и, таким образом, эффективно анализироваться). По мере уменьшения размера совокупности разрешение способа снижается, гены анализируются менее эффективно, и все больше генов вообще не анализируется.

В идеале, совокупность мутантов, создаваемая при реализации способов согласно настоящему изобретению, является всеобъемлющей, в том смысле, что представлены вставки в каждый ген (и предпочтительно в несколько разных сайтов в каждом и во всех генах). Количество мутантов с встраиванием транспозонов (т.е. размер совокупности мутантов), которое требуется для достижения этого, зависит от разных факторов, включая (а) размер генома бактерии; (б) средний размер генов; и (в) любое смещение сайтов встраивания транспозонов.

Что касается последнего фактора, некоторые области геномов бактерий склонны к низкой частоте вставок (особенно GC-богатые области). Таким образом, предпочтительны частота встраивания и размер совокупности, которые достаточно велики для того, чтобы гарантировать встраивание в области, плохо поддающиеся встраиванию.

Как правило, для получения всеобъемлющей совокупности/библиотеки, требуется минимальная частота встраивания один транспозон на 25 по, которая обычно предусматривает минимальный размер совокупности для бактерии с размером генома 4-7 Мб - от 0,5×10⁵ до 1×10⁵, например 5×10⁵, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ мутантов. Во многих случаях размер 1×10⁶ мутантов позволяет проводить идентификацию ~300000 разных сайтов встраивания и соответствует встраиванию 1 транспозона на каждые 13-23 по (или приблизительно 40-70 разных сайтов встраивания на один ген).

Однако способы согласно настоящему изобретению не обязательно требуют всеобъемлющей совокупности мутантов (в том смысле, которые оговаривался выше) для извлечения полезной информации, такой как информация для идентификации мишеней действия антибиотиков. Как раз размеры совокупности меньше идеальной всеобъемлющей совокупности могут применяться при условии, что снижение разрешения (и сопутствующая невозможность анализа определенных генов) может быть приемлемой. Это может быть справедливо, например, когда способ разработан так, чтобы он выполнялся итерационно до тех пор, пока мишень не будет идентифицирована; в таких вариантах реализации эффективных размер совокупности растет с каждой итерацией указанного способа.

Создание меродиплоидов

Для создания меродиплоидного состояния при реализации способов согласно настоящему изобретению существует несколько способов. Они включают без ограничений: (а) создание дуплицированной области бактериальной хромосомы путем встраивания с применением вектора-«самоубийцы»; (б) создание дуплицированной области бактериальной хромосомы путем встраивания с применением интегративной плазмиды; (в) создание дуплицированной области бактериальной хромосомы, поддерживаемой на внехромосомной ДНК, путем добавления плазмид; и (г) создание дуплицированной последовательности, поддерживаемой на внехромосомной ДНК, путем добавления искусственной бактериальной хромосомы (ВАС).

Транспозонный мутагенез

Транспозоны, которые иногда называют мобильными генетическими элементами, представляют собой мобильные полинуклеотиды. Термин «транспозон» хорошо известен специалистам в данной области техники и включает классы транспозонов, которые можно различать по организации последовательностей, например, короткие инвертированные повторы на каждом конце; прямо повторяемые длинные концевые повторы (LTR) на концах; и последовательности полиА на 3′-концах РНК-транскриптов, у которых 5′-конец часто процессирован.

Транспосомы представляют собой комплексы транспозаза-транспозон, в которых указанный транспозон не кодирует указанную транспозазу. Таким образом, будучи встроенным, транспозон становится стабильным. Для обеспечения стабильности совокупности мутантов предпочтительно, чтобы указанный транспозон не кодировал указанную транспозазу и был представлен в форме транспосомы (т.е. в виде комплекса с ферментом транспозазой), как описано ниже.

Транспозон/транспосому можно встраивать в геномную ДНК и/или ДНК плазмиды в клетках бактерии при помощи любого из широкого спектра стандартных способов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, транспосомы можно вводить посредством электропорации (или любого другого подходящего способа трансформации).

Предпочтительно, чтобы способ трансформации позволял получать от 1×10³ до 5×10³ трансформантов/нг ДНК, и такая производительность трансформации обычно достигается при электропорации.

В качестве альтернативы, транспозонный мутагенез можно проводить in vitro, и рекомбинантные молекулы трансформировать/трансфецировать в клетки бактерий. Согласно таким вариантам реализации траснпосомы можно получить в соответствии со стандартным протоколом путем смешивания коммерческого фермента транспозазы с транспозонным фрагментом ДНК. Образующиеся транспосомы затем смешивают с плазмидной ДНК рассматриваемой плазмиды, чтобы могла произойти транспозиция, затем указанную ДНК вводят в штамм бактерии-хозяина при помощи электротрансформации, чтобы создать совокупность плазмид транспозонных мутантов.

При вариантах реализации, в которых мутагенез проводят in vitro, возможно смешивать транспосомы с геномной ДНК in vitro и затем вводить подвергнутую мутагенезу ДНК (необязательно, после фрагментации и/или циркулизации) в штамм бактерии-хозяина (например, посредством электропорации), вследствие чего аппарат эндогенной рекомбинации включает ее в геном. Такой способ может быть особенно полезен в случае бактерии, которая от природы компетентна (например, виды Acinetobacter) и/или может включать ДНК посредством событий рекомбинации гомологичного кроссовера (например, двойного кроссовера).

При реализации способов согласно настоящему изобретению указанный мутант Ab^R сначала трансформируют: (i) одним или более жизненно важными генами указанной бактерии; и (ii) транспозоном, который при встраивании инактивирует бактериальную ДНК, с получением совокупности транспозонных мутантов, которые меродиплоидны по указанному одному или более жизненно важным генам. Указанный мутант Ab^R можно (а) трансформировать одновременно одним или более жизненно важными генами указанной бактерии и транспозоном; (б) трансформировать сначала указанным транспозоном, а затем одним или более основными генами указанной бактерии; или (в) трансформировать одним или более жизненно важными генами указанной бактерии, а затем транспозоном.

Когда мутанта Ab^R трансформируют одновременно одним или более жизненно важными генами указанной бактерии и указанным транспозоном, или трансформируют сначала одним или более жизненно важными генами указанной бактерии, а затем указанным транспозоном, может возникать нежелательное встраивание транспозона во введенные жизненно важные гены, которое может снижать эффективность формирования меродиплоидов, и может осложнять анализ данных, полученных на основании таких библиотек.

Таких проблем удается избежать, когда указанного мутанта Ab^R сначала трансформируют транспозоном, а затем одним или более жизненно важными генами указанной бактерии. Однако в зависимости от эффективности процесса, применяемого для введения жизненно важного гена (генов), для такой стратегии может потребоваться значительно больше экспериментов по трансформации, чтобы получить библиотеку достаточного размера. Существует альтернативное решение, которое основано на феномене иммунитета к транспозиции. При реализации данного способа нежелательную транспозицию во введенные жизненно важные гены удается исключить (или уменьшить) путем включения последовательностей транспозонных повторов во внехромосомную ДНК (обычно плазмидную или ВАС), содержащую жизненно важные гены, применяемые для создания меродиплоидов. Такую стратегию можно применять в сочетании с транспозонами на основе транспозонов, например Tn3 или близкими ему формами, которые описаны ниже.

Транспозоны для применения при реализации способов согласно настоящему изобретению

При реализации способов согласно настоящему изобретению можно применять любой транспозон. Подходящие транспозоны включают транспозоны на основе Tn3 и Tn3-подобных транспозонов (II класса), включая γδ (Tn1000), Tn501, Tn2501, Tn21, Tn917 и их производные. Также подходят Tn10, Tn5, TnphoA, Tn903, бактериофаг мю и родственные транспонируемые бактериофаги. Также разнообразные подходящие транспозоны можно получить из коммерческих источников, включая, например, транспозон EZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>.

Предпочтительны транспозоны, которые несут в себе гены устойчивости к антибиотикам (которые могут быть полезны при идентификации мутантов, несущих транспозон), включая Tn5, Tn10 и TnphoA. Например, Tn10 несет ген устойчивости к тетрациклину, который встроен между его IS-элементами, а Tn5 несет гены, кодирующие полипептиды, придающие устойчивость к канамицину, стрептомицину и блеомицину. Другие подходящие гены устойчивости включают гены, содержащие хлорамфеникол- ацетилтрансферазу (придающую устойчивость к хлорамфениколу).

Конечно, возможно создавать новые транспозоны путем встраивания разных комбинаций генов устойчивости к антибиотикам между IS-элементами или путем встраивания комбинаций генов устойчивости к антибиотикам между мозаичными концами транспозонов (предпочтительно), или путем изменения полинуклеотидной последовательности транспозона, например путем создания замены избыточных оснований или замены оснований другого типа, которые не влияют на транспозицию или характеристики устойчивости к антибиотикам, присущие транспозону, в кодирующей области гена устойчивости к антибиотику или еще где-либо в транспозоне. Такие транспозоны включены в область настоящего изобретения.

Согласно многим вариантам реализации для создания совокупности мутантов применяют единственный транспозон. Однако, как объяснялось выше, количество мутантов с встраиванием Τn (т.е. размер совокупности мутантов), которое нужно для достижения всеобъемлющей совокупности или библиотеки, зависит, в том числе, и от смещения сайта встраивания Τn. Таким образом, в тех случаях, когда возникает смещение сайта встраивания транспозона, можно применять два или более разных транспозона, чтобы уменьшить или исключить смещение сайта встраивания. Например, можно применять комбинацию из двух разных транспозонов на основе Tn5 и Τn10.

Системы транспозонов, подходящие для применения при реализации способов, основанных на феномене иммунитета к транспозиции (описанных выше), включают транспозоны на основе Tn3 или близких ему форм. Например, плазмида для доставки транспозона pAMICS2 (см. Фигуру 2) содержит целую основанную на Tn3 транспозон-генерирующую систему (включая гены, кодирующие ферменты резолвазу и транспозазу, TnpR и TnpA) и точку начала репликации (oriR6K), которая активна только тогда, когда она дополнена геном pir, что препятствует размножению бактерии-реципиента после транспозиции. Также указанная плазмида содержит точку мобилизации (mobRP4), которая создает возможность переноса из подходящего штамма донора, который является разрешающим сигналом для репликации плазмиды (т.е. содержит ген pir). Самопроизвольное воспроизведение плазмиды можно выявить по наличию гена устойчивости к тобрамицину (аасА4).

Таким образом, согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ идентификации гена (например, жизненно важного гена), который служит мишенью для действия антибиотика у бактерии, способ, включающий этапы:

(а) трансформации бактерии при помощи внехромосомного элемента (например, плазмидного или ВАС), содержащего: (i) один или более жизненно важных генов указанной бактерии; и (ii) одну или более последовательность транспозонных повторов, с получением совокупности бактерий, которые меродиплоидны по указанному одному или более жизненно важным генам; и

(б) трансформации меродиплоидов в соответствии с этапом (а) плазмидой для доставки транспозона, содержащей: (i) ген, кодирующий транспозазу и резолвазу; и (ii) сайты распознавания транспозазы обратных повторов;

причем указанная одна или более последовательность транспозонных повторов для указанного внехромосомного элемента в соответствии с этапом (а) придает свойство иммунитета к транспозиции в отношении транспозона, доставляемого плазмидой в соответствии с этапом (б).

Согласно данному аспекту настоящего изобретения система доставки транспозона предпочтительно основана на Tn3, например, содержит гены Tn3 tnpA и tnpR. Предпочтительны плазмиды для доставки транспозона, которые дополнительно содержат один или более генов устойчивости к антибиотикам.

Определение распределения вставок транспозонов

Распределение вставок транспозонов предпочтительно определяют посредством секвенирования бактериальной ДНК, примыкающей или расположенной рядом с (5′ и/или 3′) с сайтом встраивания (например, посредством секвенирования ДНК, которая содержит соединения транспозон-ДНК). Обычно секвенируют бактериальную ДНК, фланкирующую или примыкающую с одним или более концами транспозона.

Длина секвенируемой соседней ДНК не должна быть избыточной, и предпочтительно она должна быть короткой (например, менее 200 пар оснований).

Для определения распределения вставок транспозонов можно применять разные способы с применением секвенирования ДНК: такие способы недавно получили названия процедур Tn-seq (van Opijnen et al. (2009) Nat. Methods 6: 767-772). Например, процедуры Tn-seq включают аффинную очистку амплифицированных участков соединения (Gawronski et al. (2009) PNAS 106: 16422-16427); сшивку адаптеров в геномные последовательности, расположенные дистально на конце транспозона, с применением специализированного сайта рестрикции (Goodman et al. (2009) Cell Host Microbe 6: 279-289; van Opijnen ef al. (2009) Nat. Methods 6: 767-772); селективную амплификацию (Langridge et al. (2009) Genome Research 19: 2308-2316) и получение колец одноцепочечной ДНК, несущих соединения Τn, которые служат матрицами для амплификации и секвенирования после исключения геномной ДНК путем расщепления экзонуклеазами (Gallagher et al. (2011) mBio 2(1):e00315-10).

Можно применять любые подходящие высокопроизводительные технологии, и существует множество коммерческих платформ для секвенирования, которые подходят для применения при реализации способов согласно настоящему изобретению. Особенно для применения при реализации способов согласно настоящему изобретению подходят платформы секвенирования на основе SBS (секвенирования путем синтеза): например, система Illumina™ генерирует миллионы относительно коротких считываний последовательностей (54, 75 или 100 по) и является особенно предпочтительной.

Другие подходящие технологии включают способы, основанные на обратимых красителях-теминаторах. При реализации таких способов молекулы ДНК сначала присоединяют к праймерам на предметном стекле и амплифицируют так, чтобы образовались локальные клональные колонии (мостовая амплификация). Добавляют четыре типа ddNTP, а нуклеотиды, не включившиеся в цепь, отмывают. В отличие от пиросеквенирования, указанную ДНК можно за один раз увеличить только на один нуклеотид. Камера создает изображения нуклеотидов с флуоресцентной меткой, затем краситель вместе с 3′-концевым блокатором отщепляют от ДНК химическим путем, и становится возможен следующий цикл.

Другие системы, способные к считыванию коротких последовательностей, включают SOLiD™ и технологии ионного Торрента (обе от компании «Applied Biosystems™»). Технология SOLiD™ основана на секвенировании путем сшивания. При реализации данного способа совокупность всех возможных олигонуклеотидов фиксированной длины метят в зависимости от секвенированного положения. Олигонуклеотиды отжигают и сшивают; предпочтительно сшивание при помощи ДНК-лигазы для соответствующих друг другу последовательностей приводит к получению сигнала, информативного в отношении нуклеотида в таком положении. Перед секвенированием ДНК амплифицируют при помощи эмульсионной ПЦР (полимеразной цепной реакции). На предметном стекле откладывается полученная в результате гранула, причем каждая гранула содержит копии только одной и той же молекулы ДНК. Результатом является секвенирование таких количеств и длин последовательностей, которые сопоставимы с секвенированием по технологии Illumina.

Компания «Ion Torrent Systems Inc.» разработала систему на основе применения стандартной химии секвенирования, но с применением новой системы детекции, основанной на полупроводниках. Данный способ секвенирования основан на детекции ионов водорода, которые выделяются во время полимеризации ДНК, в противоположность оптическим способам, применяемым в других системах секвенирования. Микролунку, содержащую нить ДНК-матрицы, которую требуется секвенировать, заливают нуклеотидом одного типа. Если введенный нуклеотид комплементарен лидирующему нуклеотиду матрицы, он включается в растущую комплементарную цепь. Это приводит к высвобождению иона водорода, который инициирует гиперчувствительный ионный сенсор, который показывает, что реакция прошла. Если в последовательности матрицы присутствует гомополимерные повторы, в 35 одном цикле будут включено несколько нуклеотидов. Это приведет к выделению соответствующего числа ионов водорода, и будет получен пропорционально высокий электронный сигнал.

Функциональная оценка предполагаемых жизненно важных генов

Предполагаемые жизненно важные гены, идентифицированные путем сравнения распределения вставок транспозонов между исследуемыми культурами, также можно охарактеризовать при помощи разных технологий, которые позволяют прямо или косвенно оценить их функцию. Таким путем можно однозначно приписать определенную жизненно важную функцию указанному предполагаемому жизненно важному гену.

Подходящие технологии включают способы биоинформатики, в которых последовательность (полную или частичную) предполагаемого жизненно важного гена применяют для запросов в базах данных последовательностей, содержащих информацию, полученную при анализе бактерий и/или других видов, чтобы идентифицировать гены (например, ортологичные гены у другого вида), для которых жизненно важная биохимическая функция (функции) уже была определена, и/или для которого уже было показано, что он является жизненно важным геном.

Подходящие бионформационные программы хорошо известны специалистам в данной области техники и включают программу «Средство поиска основного локального выравнивания (BLAST)» (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402). Подходящие базы данных включают, например, EMBL, GENBANK, TIGR, EBI, SWISS-PROT и trEMBL.

В качестве альтернативы, или как дополнение, последовательность (полную или частичную) предполагаемого жизненно важного гена применяют для запросов в базах данных последовательностей, содержащих информацию, касающуюся идентичности жизненно важных генов, которые ранее были сконструированы при помощи традиционных способов Tn-seq, описанных на предыдущем уровне техники (например, как описано у Gawronski et al. (2009) PNAS 106: 16422-16427; Goodman et al. (2009) Cell Host Microbe 6: 279-289; van Opijnen et al. (2009) Nat. Methods 6: 767-772; Langridge et al. (2009) Genome Research 19: 2308-2316; Gallagher et al. (2011) mBio 2(1): e00315-10) и/или технологий, описанных в WO 01/07651 (содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки).

В качестве альтернативы, или как дополнение, значимость можно приписать путем исключения возможности того, что предполагаемый жизненно важной ген выступает в роли гена устойчивости к антибиотикам. Например, последовательность (полную или частичную) предполагаемого жизненно важного гена применяют для запросов в базах данных последовательностей, содержащих информацию о последовательностях генов, ранее идентифицированных в качестве генов устойчивости к антибиотикам при помощи способов Tn-seq, описанных например у Gawronski et al. (2009) PNAS 106: 16422-16427; Goodman et al. (2009) Cell Host Microbe 6: 279-289; Langridge et al. (2009) Genome Research 19: 2308-2316 or Gallagher et al. (2011) mBio 2(1):e00315-10. При помощи таких способов гены устойчивости к антибиотикам можно идентифицировать как класс нише-специфичных/условно жизненно важных генов.

Вспомогательные способы анализа

Способы согласно настоящему изобретению можно применять в сочетании с другими, дополняющими их, технологиями для идентификации жизненно важных, условно жизненно важных, жизненно неважных и/или жизненно важных генов, служащих мишенями для действия антибиотиков, как описано ниже:

(а) Секвенирование активирующих транспозонов (Tn-seq):

Способ согласно настоящему изобретению может необязательно включать этапы:

(а) создания совокупности бактерий-мутантов путем транспозонного мутагенеза с применением активирующего транспозона (Tn_A), причем указанный Tn_A содержит промотор, такой, чтобы встраивание транспозона в ДНК бактерии повышало транскрипцию гена близи сайта встраивания;

(б) выращивания бактерий из совокупности мутантов в присутствии разных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и

(в) сравнения распределения вставок Tn_A между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика в указанной бактерии.

Применение активирующего транспозона гарантирует, что встраивание транспозона в жизненно важные гены представлено в исходной совокупности мутантов, поскольку встраивание транспозонов может теперь приводить к активации генов, а не к инактивации следствии встраивания. Таким образом, можно изучать влияние присутствия антибиотика во время последующего культивирования совокупности мутантов на распределение транспозонов (и идентифицировать гены-мишени, определяемые при этом).

В настоящей заявке термин «активирующий транспозон» (здесь и далее обозначается сокращенно «Tn_A») относится к транспозону, который содержит промотор, такой, что встраивание транспозона усиливает транскрипцию гена в сайте встраивания или поблизости от него. Примеры таких транспозонов описаны у Troeschel et at. (2010) Methods Mol Biol. 668:117-39 и Kim et al. (2008) Curr Microbiol. 57(4): 391-394.

Активирующий транспозон/транспосому можно встраивать в хромосомную ДНК и/или ДНК плазмид при помощи любого из широкого спектра стандартных способов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, транспосомы Tn_A можно вводить посредством электропорации (или любого другого подходящего способа трансформации).

При реализации способов согласно настоящему изобретению можно применять любой транспозон. Подходящие транспозоны включают транспозоны на основе Tn3 и Tn3-подобных транспозонов (II класса), включая γδ (Tn1000), Tn501, Tn2501, Tn21, Tn917 и их производные. Также подходят Τn10, Tn5, TnphoA, Tn903, бактериофаг мю и родственные транспонируемые бактериофаги. Также разнообразные подходящие транспозоны можно получить из коммерческих источников, включая, например, транспозон EZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>.

Предпочтительны транспозоны, которые несут в себе гены устойчивости к антибиотикам (которые могут быть полезны при идентификации мутантов, несущих транспозон), включая Τn5, Τn10 и TnphoA. Например, Τn10 несет ген устойчивости к тетрациклину, который встроен между его IS-элементами, а Tn5 несет гены, кодирующие полипептиды, придающие устойчивость к канамицину, стрептомицину и блеомицину. Другие подходящие гены устойчивости включают гены, содержащие хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (придающую устойчивость к хлорамфениколу).

Конечно, можно создавать новые транспозоны путем встраивания разных комбинаций генов устойчивости к антибиотикам между IS-элементами или путем встраивания комбинаций генов устойчивости к антибиотикам между мозаичными концами транспозонов (предпочтительно), или путем изменения полинуклеотидной последовательности транспозона, например путем создания замены избыточных оснований в кодирующей области гена устойчивости к антибиотику или еще где-либо в транспозоне, или замены оснований другого типа, которая не влияет на транспозицию или характеристики устойчивости к антибиотикам, присущие транспозону, в кодирующей области гена устойчивости к антибиотику или еще где-либо в транспозоне. Такие транспозоны включены в область настоящего изобретения.

Согласно многим вариантам реализации для создания совокупности мутантов применяют единственный транспозон. Однако, как объяснялось выше, количество мутантов с встраиванием Τn (т.е. размер совокупности мутантов), которое нужно для достижения всеобъемлющей совокупности или библиотеки, зависит, в том числе, и от смещения сайта встраивания Τn. Таким образом, в тех случаях, когда возникает смещение сайта встраивания транспозона, можно применять два или более разных транспозона, чтобы уменьшить или исключить смещение сайта встраивания. Например, можно применять комбинацию из двух разных транспозонов на основе Tn5 и Tn10.

Промоторы, применяемые для активирующих транспозонов

Природа промоторов, присутствующих в Tn_A, зависит от природы указанного транспозона и от конечной бактерии-хозяина. Как правило, выбирают эффективный, ориентированный на внешнюю работу промотор, который запускает транскрипцию на высоком уровне ДНК, расположенной рядом или поблизости от сайта встраивания. Промотор может включать: (а) рамку Прибноу (элемент -10); (б) элемент -35 и/или (в) UP-элемент.

Например, промотор lac можно применять с транспозоном EZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>, и такие конструкции применимы для анализа, например, видов Escherichia coli, Enterobacter и других членов семейства Enterobacteriaceae, таких как виды Klebsiella. Другие подходящие промоторы включают: rplJ (белок большой субъединицы рибосомы; промотор средней силы); tac (искусственный гибрид lacltrp; сильный промотор) и rrnB (промотор гена рибосомальной РНК; очень сильный промотор). Последовательности последних из перечисленных промоторов показаны ниже:

На необязательных последующих этапах, описанных выше:

- совокупность мутантов может содержать по меньшей мере 0,5×10⁵ мутантов, например по меньшей мере 1×10⁵ мутантов;

- совокупность мутантов может содержать по меньшей мере 5×10⁵ мутантов;

- совокупность мутантов может содержать по меньшей мере 1×10⁶ мутантов;

- совокупность мутантов может содержать от 0,5×10⁶ до 2×10⁶ мутантов;

- совокупность мутантов может содержать приблизительно 1×10⁶ мутантов;

- трансформация с применением транспозона на этапе (б) может приводить к проценту встраивания по меньшей мере один транспозон на 50 пар оснований бактериальной ДНК, по меньшей мере один транспозон на 30 пар оснований бактериальной ДНК, по меньшей мере один транспозон на 25 пар оснований бактериальной ДНК, по меньшей мере один транспозон на 15 пар оснований бактериальной ДНК или по меньшей мере один транспозон на 10 пар оснований бактериальной ДНК;

- бактериальная ДНК в соответствии с этапом (б) может быть геномной ДНК, плазмидной ДНК или смесью геномной и плазмидной ДНК;

- транспозонный мутагенез в соответствии с этапом (а) может происходить in vivo или in vitro;

- указанной бактерией может быть грамположительная бактерия;

- указанная бактерия может быть выбрана из: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и Neisseria gonorrhoeae;

- указанной бактерией может быть грамотрицательная бактерия;

- указанная бактерия может быть выбрана из: Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, штаммов Ε. coli ST131, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes и Neisseria gonorrhoeae;

- указанная бактерия может быть выращена из совокупности мутантов на этапе (б) путем посева на питательную среду от 10⁷ до 10⁹, например приблизительно 10⁸ КОЕ из указанной меродиплоидной совокупности;

- указанная бактерия может быть выращена из совокупности мутантов на этапе (б) в присутствии антибиотика в концентрации приблизительно 0,5, приблизительно 1 и приблизительно 2 × MIC (минимальная ингибирующая концентрация)) с получением по меньшей мере трех культур для тестирования;

- указанное распределение встраивания Tn_A между культурами для тестирования можно сравнивать путем секвенирования ДНК, примыкающей или расположенной поблизости от указанного сайта встраивания транспозона Tn_A;

- секвенирование ДНК, примыкающей или расположенной поблизости от указанного сайта встраивания Tn_A, может включать селективную амплификацию участков соединения транспозон-бактериальная ДНК;

- указанное секвенирование может включать биохимический способ секвенирования путем синтеза (SBS);

- можно секвенировать приблизительно 25, 50, 75, 100 или более 100 пар оснований, примыкающих или расположенных поблизости от указанного сайта встраивания;

- секвенированная ДНК может быть расположена с 5′ и/или 3′-стороны от указанного сайта встраивания Tn_A;

(б) Tn-seq

Способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать необязательный этап анализа на основе Tn-seq, который описан, например, у Gawronski et al. (2009) PNAS 106: 16422-16427; Goodman et al. (2009) Cell Host Microbe 6: 279-289; Langridge et al. (2009) Genome Research 19: 2308-2316 или Gallagher et al. (2011) mBio 2(1):e00315-10. При применении в сочетании с анализом на основе Tn-seq настоящее изобретение позволяет дополнительно идентифицировать: (а) жизненно важные гены; (б) гены, благоприятствующие росту (но нежизненно важные); (в) гены, неблагоприятные для роста при конкретных условиях; и (г) гены, участвующие в придании устойчивости к определенным условиям («нише-специфичные» жизненно важные гены), наряду с жизненно важными генами, которые служат мишенями для действия антибиотиков.

Примеры

В данном разделе настоящее изобретение описано применительно к специфическим примерам. Они выступают исключительно в качестве примеров и только с целью иллюстрирования; предполагается, что они никоим образом не должны ограничивать область заявленной монополии или описанного изобретения. Указанные примеры представляют собой наилучший предполагаемый в настоящее время вариант реализации изобретения.

Этап 1: Получение клонов мутантов, устойчивых к антибиотику (мутантов Ab^R)

Для рассматриваемой бактерии определяют MIC антибиотика, который требуется анализировать. Затем провоцируют относительную нечувствительность бактерий к антибиотику при помощи одного из перечисленных ниже способов:

Способ 1

Бактерии выращивали в 100 мл культур путем серийных пассажей при концентрации антибиотика 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 и 32х MIC, до тех пор, пока не будут отобраны бактерии, которые растут при значительно более высоких концентрациях антибиотика, чем исходные культуры дикого типа.

Способ 2

Бактерии, выращенные до логарифмической фазы, отбирали и повторно суспендировали с разной плотностью клеток (т.е. 1×10⁷, 1×10⁸, 1×10⁹, 1×10¹⁰ и 1×10¹¹ клеток/мл) в бульоне, содержащем антибиотик в концентрациях 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 и 32х MIC, перед засеванием их на чашки Петри с агаром, содержащим те же концентрации антибиотика. Бактериальные клоны со сниженной чувствительностью к антибиотику обладали собственным профилем резистентности, который подтверждался в ходе дальнейшего роста при высоких концентрациях антибиотика.

Затем для транспозонного мутагенеза выбирают несколько разных нечувствительных к антибиотику клонов, полученных в соответствии либо со способом 1, либо способом 2, либо сочетанием способа 1 и 2, и каждый из них выращивают отдельно на бульоне 2 × ΤΥ, поддерживая концентрации антибиотиков, чтобы оптическая плотность OD₆₀₀ составляла 0,3-0,5. Затем клетки собирают и промывают три раза в 10% глицерине (½ объема исходной культуры), повторно суспендируют в 10% глицерине (1/1000 объема исходной культуры) и хранят при -80°С.

Этап 2: Получение транспосом

ДНК транспозона (ΕΖ-Τn5™<R6Κγοri/ΚΑΝ-2>) амплифицировали с применением олигонуклеотидов 5′-CTGTCTCTTATACACATCTCCCT и 5′-CTGTCTCTTATACACATCTCTTC и с применением Pfu Ultra Fusion II («Stratagene»). Полученный ампликон затем фосфорилировали с применением полинуклеотидкиназы («New England Biolabs»). Затем двести нанограмм указанной ДНК инкубировали с транспозазой EZ-Tn5™ («Epicenter Biotechnologies») при 37°С в течение 1 часа, затем хранили при -20°С при концентрации ДНК 20 нг/мкл.

Этап 3: Получение вектора, содержащего жизненно важные гены

На основании данных, полученных при предшествующем анализе Tn-seq, проводимом при помощи TraDIS (см. Langridge et al. (2009) Genome Research 19: 2308-2316), или на основании опубликованных данных создают бактериальную самореплицирующуся плазмиду, содержащую ген устойчивости к ампициллину и также содержащую жизненно важные гены дикого типа. Очищенную ДНК-плазмиду разводят до концентрации 20 нг/мкл и хранят при -80°С.

Этап 4: Получение меродиплоидной совокупности мутантов Tn:Ab^R

Меродиплоидную совокупность мутантов Tn:Ab^R получают из каждого из нескольких нечувствительных к антибиотику клонов. В каждом случае:

шестьдесят микролитров мутантов Ab^R (ранее хранимых на Этапе 1 при -80°С) смешивают с 0,2 мкл (4 нг) транспосом (полученных на Этапе 2) и 1 мкл (20 г) вектора экспрессии (полученного на Этапе 3) и проводят электротрансформацию в кювете с расстоянием между электродами 2 мм с применением установки Bio-Rad GenePulser II, установленным на 2,4 кВ, 25 мкФ и 200 Ом.

Трансформированные клетки повторно суспендируют в 1 мл среды SOC («Invitrogen») и инкубируют при 37°С в течение 2 часов, затем распределяют на бактериологической питательной среде с L-агаром с добавлением 50 нг/мл ампициллина и 7,5 нг/мл канамицина.

После инкубации в течение ночи при 37°С оценивают количество колоний в нескольких чашках Петри путем подсчета доли колоний, а на основании нее консервативным способом оценивают общее количество колоний во всех чашках. Устойчивые к канамицину/ампициллину колонии отбирают путем повторного суспендирования в стерилизованной деионизированной воде при помощи микробиологического распределителя.

Затем повторно суспендированные клетки, полученные в ходе 10-20 процедур электропорации, объединяют и создают совокупность меродиплоидных транспозонных мутантов Ab^R (мутанты Tn:Ab^R), которые по оценкам содержат свыше 1 миллиона транспозонных мутантов. Эффективность трансформации, проводимой при помощи данной технологии, снижается при увеличении размера плазмиды экспрессии, и это означает, что при очень больших плазмидах экспрессии может потребоваться более 20 процедур электропорации.

Альтернативным способом трансформации для введения ДНК в бактериальные клетки является конъюгация. Конъюгацию можно применять для введения ДНК-вектора, содержащего транспозон, упоминаемый на Этапе 2, и ДНК-вектор, содержащий один или более жизненно важных генов, упоминаемый на Этапе 3. Штаммы-доноры и штаммы-реципиенты смешивают, либо посредством нанесения поперечных штрихов на твердой питательной среде, либо посредством смешивания соответствующих объемов жидких сред на основе бульона, которые могут составлять 0,5 мл, со штаммами-донорами и штаммами-реципиентами. После инкубации в течение нескольких часов, а именно от 1 до 16 часов, при соответствующей температуре, а именно комнатной температуре (20-24°С), 30°С или 37°С, бактерии распределяют на твердой питательной среде с добавлением антибиотика, который позволяет провести отбор на ДНК штамма-донора, и антибиотика, который позволяет провести отбор на штамм бактерии-реципиента. Температуру инкубации для конъюгации определяют в зависимости от ДНК, которую вводят; более низкая температура подходит для ДНК, содержащей транспозон, если транспозиция транспозона оптимальна при данной температуре. Подходящие штаммы, которые могут выступать в качестве донора при конъюгации, включают штамм E.coli SM10λpir, который содержит ген pir, опосредующий репликацию любого ДНК-вектора, содержащего точку начала репликации oriR6K, такого как ДНК-вектор, содержащий транспозон, а также обладает функциями переноса из плазмиды RP4, которая опосредует перенос любого ДНК-вектора, содержащего точку мобилизации mobRP4.

Этап 5: Определение гена (генов)-мишеней для действия антибиотиков

Подготавливают четыре культуры, состоящие из 100 мл бульонной питательной среды, две из которых содержат добавки анализируемого антибиотика в концентрациях 1-4 × MIC (это зависит от нечувствительности к антибиотику исходного клона бактерий)). В предположении, что библиотека транспозонных мутантов составляет 1 миллион, для засевания каждой культуры применяют ~10⁸-10⁹ КОЕ из указанной меродиплоидной совокупности мутантов Tn:Ab^R в соответствии с Этапом 4.

Культуры выращивают до наступления стационарной фазы, и клетки отбирают с целью экстракции геномной ДНК. Также готовят свежие культуры и засевают их 10⁸-10⁹ КОЕ из первичных культур. Их выращивают до наступления стационарной фазы, и клетки отбирают с целью экстракции геномной ДНК. Геномную ДНК секвенируют с применением способа TraDIS (см. Langridge et al. (2009) Genome Research 19: 2308-2316) и получают считывание последовательностей, инициируемое с сайтов встраивания транспозонов.

Затем считывание последовательностей вносят в карту последовательностей генома бактерии и сравнивают с аннотацией генома, определяя число считываний последовательностей, которые картированы для каждого гена для 4 указанных культур (2 тестовых и 2 контрольных). Сравнение комплектов контрольных данных друг с другом и комплектов анализируемых данных друг с другом позволяет оценить степень разброса между экспериментами. Сравнение контрольных данных с комплектами анализируемых данных позволяет оценить воспроизводимость экспериментов и выявить ген (гены) - мишени для действия антибиотика. Считывание последовательностей системой Illumina™ с вставки транспозона в пределах жизненно важного гена-мишени для действия антибиотиков может происходить в клетках, выращенных в отсутствие антибиотика, но не в клетках, выращенных в присутствии антибиотика.

Гены устойчивости к антибиотику, идентифицированные при помощи «стандартной» библиотеки TraDIS дикого типа, выращенной при субоптимальных концентрациях антибиотика, можно исключить из потенциальных кандидатов в гены-мишени для действия антибиотиков (см. ниже).

Если вместо плазмиды, обеспечивающей комплементацию, содержащей жизненно важные гены, применяют плазмиды, содержащие специфические ряды жизненно важных генов или фрагментов хромосом, то для идентификации мишени антибиотика для действия требуется более крупная биоинформационная статистическая деконволюция. Предполагаемая сущность комплементирующих генов и генов-мишеней для действия антибиотика можно определить посредством подробного анализа плотностей считывания транспозона в присутствии и в отсутствии антибиотика.

Исключение генов устойчивости к антибиотикам

Для идентификации генов устойчивости к антибиотикам, которые не являются жизненно важными для роста в нормальных условиях, но которые придают устойчивость к антибиотикам (т.е. класс «нише-специфичных» жизненно важных генов, обсуждаемых у Langridge et al. (2009)) можно применять традиционное транспозон-направленное секвенирование сайтов встраивания TraDIS - см. Langridge et al. (2009) Genome Research 19: 2308-2316). Это позволяет исключить гены устойчивости к антибиотикам из числа кандидатов на мишени для действия антибиотиков, как описано ниже.

Для рассматриваемой бактерии определяют MIC антибиотика, который требуется анализировать. Подготавливают четыре культуры, состоящие из 100 мл бульонной питательной среды, две из которых содержат добавки анализируемого антибиотика в концентрациях 0,5-0,75×MIC (т.е. чуть ниже MIC). В предположении, что совокупность транспозонных мутантов составляет 1 миллион, для засевания каждой культуры применяют 10⁸-10⁹ КОЕ из указанной совокупности. Культуры выращивают до наступления стационарной фазы, и клетки отбирают с целью экстракции геномной ДНК.

Также готовят свежие культуры и засевают их 10⁸-10⁹ КОЕ из первичных культур. Их выращивают до наступления стационарной фазы и клетки отбирают с целью экстракции геномной ДНК. Геномную ДНК секвенируют с применением платформы Illumina™, включая модификацию TraDIS, и получают считывание последовательностей, инициируемое с сайтов встраивания транспозонов. Затем считывание последовательностей вносят в карту последовательностей генома бактерии и сравнивают с аннотацией генома, определяя число считываний последовательностей, которые картированы для каждого гена для 4 указанных культур (2 тестовых и 2 контрольных).

Сравнение комплектов контрольных данных друг с другом и комплектов анализируемых данных друг с другом позволяет оценить степень разброса между экспериментами. Сравнение контрольных данных с комплектами анализируемых данных позволяет оценить воспроизводимость экспериментов и выявить гены, которые вносят вклад в устойчивость.

На Фигуре 1 показаны результаты поискового исследования, направленного на идентификацию генов, которые вносят вклад в устойчивость Salmonella Typhi к ципрофлоксацину. На графике представлены данные для каждого нежизненно важного гена в геноме указанной бактерии. Библиотеку мутантов с встроенными транспозонами культивировали при 4 вариантах условий: 2 контрольные культуры (без антибиотика) и 2 культуры с концентрацией ципрофлоксацина ниже MIC. Каждая точка соответствует гену, и каждый ген отложен на графике 3 раза (ctrl1 и ctrl2; CIP1 и CIP2 = черный, и указана степень разброса между экспериментами; среднее значение CIP и среднее значение Ctrl = серый; серые точки показывают, что график выше кластера черных точек соответствует генам, данные для которых демонстрируют значимые различия). Такое сравнение позволяет измерить объем экспериментальной изменчивости. Серые точки представляют собой среднее значение для контрольных данных в сравнении с анализируемыми данными. На Фигуре 1 серые точки ниже диагонального кластера соответствуют генам, которые вносят вклад в устойчивость. Чем дальше от кластера черных точек расположены серые точки, тем более значимые данные. Гены, которые, как известно, вносят вклад в устойчивость к ципрофлоксацину у сальмонеллы, находятся в данной области графика, как и гены, для которых вклад в устойчивость ранее был неизвестен. Серые точки выше кластера черных точек соответствуют генам, которые вносят вклад в чувствительность. Опять же, гены, которые, как известно, вносят вклад в чувствительность, находятся в данной области графика, и эти данные позволяют идентифицировать гены, для которых вклад в чувствительность ранее был неизвестен. В целом данные достаточно наглядные и, следовательно, не требуют статистического анализа.

Эквиваленты

В приведенном выше описании подробно изложены предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения. Ожидается, что на практике, при рассмотрении данного описания специалистами в данной области техники возникнет целый ряд модификаций и вариантов. Подразумевается, что такие модификации и варианты должны быть включены в пункты формулы изобретения, прилагаемой ниже.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ идентификации жизненно важного продукта гена, который служит мишенью для антибиотика в бактерии. Способ включает этапы: создания устойчивого к антибиотику мутанта указанной бактерии при помощи способа, включающего этап отбора на основании способности к росту в присутствии указанного антибиотика для получения клона устойчивого к антибиотикам мутанта (мутант Ab^R); трансформации мутанта Ab^R: (i) одним или более жизненно важными генами указанной бактерии; и (ii) транспозоном, который при встраивании инактивирует ДНК бактерии, с получением совокупности транспозонных мутантов, которые меродиплоидны по указанному одному или более жизненно важным генам; выращивания бактерий из указанной меродиплоидной совокупности в присутствии различных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и сравнения распределения вставок транспозонов между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика в указанной бактерии. Изобретение позволяет идентифицировать мишени-кандидаты для антибиотиков. 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Способ идентификации жизненно важного гена, продукт которого служит мишенью для антибиотика в бактерии, указанный способ включает этапы:
(а) создания устойчивого к антибиотику мутанта указанной бактерии при помощи способа, включающего этап отбора на основании способности к росту в присутствии указанного антибиотика для получения клона устойчивого к антибиотикам мутанта (мутант Ab^R);
(б) трансформации мутанта Ab^R: (i) одной или более копиями жизненно важного гена дикого типа указанной бактерии; и (ii) транспозоном, который при встраивании инактивирует жизненно важные гены в ДНК указанного мутанта, с получением совокупности транспозонных мутантов, которые меродиплоидны по указанному одному или более жизненно важным генам;
(в) выращивания бактерий из указанной меродиплоидной совокупности в присутствии различных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования, в которых встраивание транспозона в указанный жизненно важный ген, который служит мишенью для антибиотика, представлено при неселективных условиях, когда копия жизненно важного гена дикого типа комплементирует мутантную копию указанного гена, которая инактивирована в результате указанного встраивания, а не при селективных условиях, когда не происходит комплементация мутантной копии указанного гена, которая инактивирована в результате указанного встраивания, копией жизненно важного гена дикого типа;
(г) сравнения распределения вставок транспозонов между культурами для тестирования с целью идентификации продукта предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика в указанной бактерии; и
(д) идентификации продукта предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика в указанной бактерии.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что:
(а) указанная меродиплоидная совокупность содержит: (i) по меньшей мере 0,5×10⁵ мутантов, например по меньшей мере 1×10⁵ мутантов; (ii) по меньшей мере 5×10⁵ мутантов; (iii) по меньшей мере 1×10⁶ мутантов; (iv) от 0,5×10⁶ до 2×10⁶ мутантов; или (v) приблизительно 1×10⁶ мутантов; и/или
(б) трансформация транспозоном на этапе (б) приводит к уровню встраивания, равному по меньшей мере: (i) одному транспозону на 50 пар оснований бактериальной ДНК; (ii) одному транспозону на 30 пар оснований бактериальной ДНК; (iii) одному транспозону на 25 пар оснований бактериальной ДНК; (iv) одному транспозону на 15 пар оснований бактериальной ДНК; или (iv) одному транспозону на 10 пар оснований бактериальной ДНК.

3. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что бактериальная ДНК на этапе (б) представляет собой: геномную ДНК; плазмидную ДНК; или смесь геномной и плазмидной ДНК.

4. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что мутант Ab^R получают при помощи способа, который дополнительно включает мутагенез указанной бактерии перед отбором на основании способности к росту в присутствии указанного антибиотика, при этом указанный этап мутагенеза может представлять собой (i) химический мутагенез; и/или (ii) радиационный мутагенез.

5. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что указанная бактерия представляет собой: (i) грамположительную бактерию, которая в некоторых случаях может быть выбрана из: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и Neisseria gonorrhoeae; или (ii) грамотрицательную бактерию, которая в некоторых случаях может быть выбрана из: Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, штаммов E. coli ST131, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes и Neisseria gonorrhoeae.

6. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что: (i) указанную бактерию выращивают из меродиплоидной совокупности на этапе (в) путем посева на питательную среду от 10⁷ до 10⁹, например, приблизительно 10⁸ КОЕ из указанной меродиплоидной совокупности; и/или (ii) на этапе (в) получают по меньшей мере две культуры для тестирования и одну из них выращивают в отсутствии антибиотика, а другую - в присутствии антибиотика, например, при концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 4×MIC (минимальная ингибирующая концентрация).

7. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что указанное распределение вставок транспозонов между культурами для тестирования сравнивают путем секвенирования ДНК, примыкающей или расположенной поблизости от указанного сайта встраивания транспозона, при этом, в некоторых случаях: (i) указанное секвенирование ДНК, примыкающей или расположенной поблизости от указанного сайта встраивания, включает селективную амплификацию участков соединения транспозон-бактериальная ДНК; и/или (ii) указанное секвенирование включает биохимический способ секвенирования путем синтеза (SBS); и/или (iii) секвенируют приблизительно 25, 50, 75, 100 или более 100 пар оснований ДНК, соседствующих или расположенных поблизости от указанного сайта встраивания; и/или (iv) секвенированная ДНК расположена с 5′ и/или 3′-стороны от указанного сайта встраивания.

8. Способ по любому из пп. 1-2, дополнительно включающий этап приписывания определенной жизненно важной функции указанному предполагаемому жизненно важному гену путем: (i) сравнения последовательностей с одним или более жизненно важными генами указанной бактерии, причем указанные жизненно важные гены идентифицируют путем транспозон-направленного секвенирования сайтов встраивания; и/или (ii) определения того, что он не является геном устойчивости к антибиотику, например, когда указанный этап определения включает идентификацию гена устойчивости к антибиотику путем транспозон-направленного секвенирования сайтов встраивания с применением транспозона, который при встраивании оказывает инактивирующее действие.

9. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов в соответствии с этапом (б) представлены: (i) в составе линейной ДНК, например, фрагментов геномной ДНК указанной бактерии; (ii) в составе вектора экспрессии, например: (1) в составе интегрирующегося вектора экспрессии, который встраивается в бактериальную хромосому после трансформации; или (2) в составе однокопийного вектора экспрессии или вектора экспрессии с малым числом копий, отличающегося тем, что он стабильно сохраняется во внехромосомных элементах после трансформации, например, когда указанный вектор экспрессии представляет собой комбинацию плазмид, содержащих фрагменты нативной хромосомы указанной бактерии или искусственную бактериальную хромосому (ВАС).

10. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов на этапе (б) включают: (i) все или одну определенную подгруппу жизненно важных генов указанной бактерии; и/или (ii) включают по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250 или по меньшей мере 300 жизненно важных генов указанной бактерии; и/или (iii) получены при помощи способа, включающего идентификацию одного или более жизненно важных генов указанной бактерии путем транспозон-направленного секвенирования сайтов встраивания; и/или (iv) выбраны из генов, участвующих в:
(а) делении клеток; и/или
(б) репликации ДНК (включая полимеризацию и суперспирализацию); и/или
(в) транскрипции (включая праймирование, элонгацию и терминацию); и/или
(г) трансляции (включая гены, кодирующие рибосомальные компоненты, гены, участвующие в инициации, элонгации и высвобождении); и/или
(д) путях биосинтеза (например, обмен пептидогликанов и/или жирных кислот);
(е) «привыкании» к плазмидам (например, сохранение последовательностей плазмид в клетке бактерии).

11. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что на этапе (б): (i) мутант Ab^R трансформируют одновременно одним или более жизненно важными генами указанной бактерии и транспозоном; или (ii) мутант Ab^R трансформируют сначала транспозоном, а затем одним или более жизненно важными генами указанной бактерии; или (iii) мутант Ab^R трансформируют сначала одним или более жизненно важными генами указанной бактерии, а затем транспозоном, причем в некоторых случаях мутант Ab^R трансформируют сначала внехромосомным элементом (например, плазмидой или ВАС), содержащим: (1) один или более жизненно важных генов указанной бактерии; и (2) одну или более последовательность транспозонных повторов; и затем трансформируют (например, путем конъюгации с бактерией-донором) плазмидой для доставки транспозона, содержащей (1) ген, кодирующий транспозазу; и (2) сайты распознавания транспозазы обратных повторов; где одна или более последовательностей транспозонных повторов указанного внехромосомного элемента придают иммунитет к транспозиции в отношении транспозона, доставляемого плазмидой для доставки транспозона.

12. Способ по любому из пп. 1-2, дополнительно включающий этапы:
(а) создания совокупности бактерий-мутантов посредством транспозонного мутагенеза с применением активирующего транспозона (Tn_A), отличающегося тем, что указанный Tn_A содержит промотор, такой что встраивание транспозона в бактериальную ДНК усиливает транскрипцию гена в сайте встраивания или поблизости от него;
(б) выращивания бактерий из совокупности мутантов в присутствии разных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и
(в) сравнения распределения вставок Tn_A между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика в указанной бактерии.