СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОЛЕРАНТНОСТИ ЖИВОТНЫХ К ТРОМБИНУ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Способ относится к биохимии, точнее к способам оценки толерантности экспериментальных животных к тромбину и влияния на толерантность различных воздействий, и может быть использован научно-исследовательскими учреждениями медико-биологического профиля для изучения эффекта воздействий, меняющих устойчивость организма к тромбину.

Известны способы определения толерантности организма к тромбину, характеризующиеся использованием большого количества экспериментальных животных и длительностью наблюдений.

Так, известен способ определения толерантности животных к тромбину, требующий большого количества лабораторных крыс для оценки влияния одного вида воздействий, или одной дозы какого-либо соединения на это свойство организма (Л. В.Михайлова "Состояние системы свертывания крови при воздействии звука в эксперименте". Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. Запорожье, 1970. - С. 130-134). Сущность способа заключается в том, что после изучаемого воздействия на организм подопытных животных, им инъецируют в яремную вену тромбин и затем в течение 24 ч учитывают частоту и динамику гибели животных. Этот способ мы рассматриваем в качестве аналога заявляемого способа. Его недостатки: 1) необходимость использовать около 100 особей (примерно по 50 в контрольной и подопытной группах) для оценки влияния одного вида воздействия на толерантность к тромбину, 2) длительность наблюдений до 24 ч.

Известен способ оценки толерантности к тромбину (Р.Ф.Каптюх "Влияние пангамата на некоторые компоненты гемокоагуляции". Диссертация на соискание степени канд. биол. наук. Запорожье, 1970. C. 121-126), который мы рассматриваем в качестве прототипа предлагаемого изобретения. Сущность способа-прототипа заключается в том, что после изучаемого воздействия (воздействий) контрольным и подопытным животным инъецируют раствор тромбина и через 0,5 ч после этого отбирают пробы крови, определяя в полученной плазме 1) время рекальцификации, 2) толерантность к гепарину, 3) уровень гепарина, 4) антитромбиновую активность, 5) уровень антитромбина III, 6) антифибринолитическую активность, 7) активность фибриногенолиза, 8) протромбиновое время, 9) потребление протромбина, 10) активность антиплазмина. Сопоставляя степень изменений всех этих величин в контрольной и подопытной группах, устанавливают, отличается ли сдвиг каждого из 10-ти показателей в контрольной и подопытной группах, составляют суждение о толерантности к тромбину, выражая ее изменения качественно - "выше или ниже, чем в контроле".

Недостатками способа являются:
1) неспецифичность отобранных показателей [З.С.Баркаган "Геморрагические заболевания и синдромы". М. : Медицина. - 1988. 528 с; В.П.Балуда и др., Физиология системы гемостаза. М., 1995. С. 216-220];
2) значительная продолжительность времени, затрачиваемого на определение 10 показателей и их математической обработки: при оценке воздействия одного фактора на толерантность требуется 2 группы животных (5 и 5) и выполнение способа требует до 24 ч (определения фибринолиза и фибриногенолиза) и еще около 3-4 ч (математический анализ результатов) всего около 28 ч;
3) неоднозначность ответа, так как одни из перечисленных 10-ти показателей могут уменьшаться, другие увеличиваться;
4) качественный характер ответа: "толерантность уменьшилась или увеличилась".

Сущность изобретения
Цель изобретения - количественное определение толерантности экспериментальных животных к тромбину и ее изменений при разнообразных воздействиях.

Технический результат изобретения заключается в следующем:
1. Контрольным и подвергнутым изучающемуся воздействию (подопытным) крысам, фиксированным на препаровальном столике, после выхода из эфирного наркоза вводят в яремную вену слева раствор тромбина из расчета 1 мл/кг массы тела (активность тромбина устанавливается по времени свертывания 0,2% раствора фибриногена - 25±1,0 с).

2. В шприц объемом 1 мл набирают 0,1 мл раствора 3,8% трехзамещенного лимоннокислого натрия и через 30 мин после инъекции тромбина берут в этот же шприц 0,9 мл крови из яремной вены справа.

3. Отделяют плазму центрифугированием в течение 10 мин, при ускорении 250 g. В пробирку, установленную на водяной бане при 37^oС, вносят 0,1 мл плазмы и добавляют 0,1 мл раствора тромбина активностью 25 с, через 10 мин отделяют сгусток фибрина стеклянной палочкой, ополаскивают в 0,14 М растворе NaCl, осушивают фильтровальной бумагой и вносят в 1 мл 0,5 М раствора NaOH, нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин, охлаждают и определяют оптическую плотность при длине волны 280 нм. Устанавливают с помощью калибровочного графика содержание фибриногена, выражая его в г/л.

4. У части крыс содержание фибриногена определяют до введения тромбина.

5. По степени изменения содержания фибриногена через 30 мин после инъекции тромбина судят о толерантности к тромбину, для количественного выражения которой предложена математическая формула.

Существенные признаки изобретения заключаются в следующем:
1. Тромбин заданной активности вводится в яремную вену фиксированного животного после пробуждения от наркоза в количестве, определяемом массой тела животного (активность - 25 с по времени свертывания 0,2% раствора фибриногена, 1 мл/кг массы крысы);
2. Отбор пробы крови производится через 30 мин в малом объеме (0,9 мл) в шприц с 0,1 мл 3,8% раствора трехзамещенного цитрата натрия;
3. В плазме крови определяют единственный показатель - содержание фибриногена, свертываемого тромбином, и рассчитывают результат по формуле:
D%=(С_о/С_к)•100
где D - остаточная концентрация фибриногена в %; С_к - концентрация фибриногена у крыс, которым тромбин не вводили и воздействиям не подвергали; С_о - концентрация фибриногена у крыс, которым ввели тромбин на фоне изучающегося воздействия; затем значение остаточной концентрации у крыс, которым тромбин ввели без предварительных воздействий, принимают за 100-процентную толерантность к тромбину, и устанавливают (в процентах) изменение толерантности при изучаемом воздействии по формуле:
Х%=(D_o/D_к)•100,
где Х% - толерантность к тромбину в %;
D_o - остаточная концентрация фибриногена в % у группы, подвергавшейся изучаемому воздействию;
D_к - остаточная концентрация фибриногена в % у группы, не подвергавшейся изучаемому воздействию (контрольная группа).

Положительный эффект заявляемого способа по сравнению со способом-прототипом заключается:
1) в уменьшении числа определяемых показателей с 10 до 1-го;
2) уменьшении числа используемых реагентов и препаратов;
3) сокращении затрачиваемое на определение времени в 10-12 раз при сохранении высокой специфичности определения.

Сохранение специфичности обусловлено тем, что фибриноген - основной субстрат тромбина в процессах свертывания [Д.М.Зубаиров. Биохимия свертывания крови. М., 1978. - 175 с.; А.Ш.Бышевский и др. Биохимические компоненты свертывания крови. - Свердловск, 1991. - 211 с.], тем, что изменения уровня реагирующего на тромбин фибриногена при экзогенной гипертромбинемии, положенной в основу способа, зависят от результативности работы всех систем, обеспечивающих выживание организма при ускоренном тромбинообразовании [З.С.Баркаган "Геморрагические заболевания и синдромы". М.: Медицина. 1988. - 528 с.; В.П.Балуда и др., Физиология системы гемостаза. М., 1995. - С. 216-220];
4) в том, что способ позволяет количественно оценивать степень изменения толерантности к тромбину при каком-либо воздействии по сравнению с контрольной группой животных.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
1. Партию животных, близких по массе тела, разделили на четыре одинаковые группы (6 особей в каждой):
- группа 1-я контрольная (животные никаким дополнительным воздействиям не подвергались);
- группа 2-я (животным вводили в составе рациона ацетилсалициловую кислоту в дозе 4 мг/кг в день в течение 3 дней);
- группа 3-я (животным вводили активатор тромбинообразования L-тироксин в дозе 35 мг/кг в день в течение 3 дней);
- группа 4-я (крысы никаким воздействиям не подвергались).

2. На 4-й день животным групп 1-й, 2-й и 3-й ввели в яремную вену слева раствор тромбина (1 мл/кг, активность 25 с) и через 30 мин взяли по 0,9 мл крови из яремной вены справа в шприц, содержащий 0,1 мл 3,8% раствора цитрата натрия, смешали, отделили плазму центрифугированием в течение 10 мин при 250 g.

3. Крысам 4-й группы ввели в яремную вену слева 0,1 мл 0,14 М раствора NaCl и через 30 мин из яремной вены справа взяли 0,9 мл крови в шприц с 0,1 мл 3,8% цитратом натрия.

4. Определили содержание фибриногена во всех пробах, осадив его добавлением к плазме равного объема тромбина (0,1 мл и 0,1 мл) и экспозицией на водяной бане при 37^oС в течение 10 мин. Сгусток фибриногена извлекли, промыли в 0,14 М растворе хлорида натрия, осушили фильтровальной бумагой, поместили в 1 мл 0,5 М раствора едкого натра и после инкубации на водяной бане при 60^oС, охладив, определили оптическую плотность при 278 мкм. Содержание фибриногена установили по калибровочной кривой, построенной с растворами фибриногена разных концентраций.

Результаты: у крыс группы 4-й - концентрация фибриногена - 2,2±0,04 г/л;
- у крыс, которым ввели тромбин без предварительного воздействия - 1,0±0,03 г/л;
- у крыс, получивших ацетилсалициловую кислоту - 1,4±0,02 г/л;
- у крыс, получавших тироксин, - 0,3±0,008 г/л.

Рассчитали остаточную концентрацию фибриногена к найденной у интактных крыс по формуле:
D%=(С_о/С_к)•100
где D - остаточная концентрация фибриногена в %; С_к - концентрация фибриногена у крыс группы 4-й (тромбин не вводили и воздействиям не подвергали); С_о - концентрация фибриногена у крыс, получивших тромбин на фоне воздействия (в данном случае - введение ацетилсалициловой кислоты или тироксина). При подстановке значений концентрации фибриногена у крыс экспериментальных групп нашли остаточные концентрации фибриногена в %:
- у крыс, которым ввели тромбин без предварительных воздействий:
D%=(1,0/2,2)•100=45,6%;
- у крыс, которым вводили тромбин на фоне ацетилсалициловой кислоты:
D=(1,4/2,2)•100=63,6%;
- у крыс, которым вводили тромбин на фоне тироксина: (0,3/2,2)•100= 13,6%.

Остаточная концентрация является характеристикой толерантности к тромбину, ее значения у крыс, которым тромбин ввели без предварительных воздействий, принимали за 100-процентную толерантность к тромбину. Это позволяет рассчитать изменения толерантности в процентах:
- остаточная концентрация фибриногена (в % к исходной) у крыс 1-й группы = 100% толерантности, у животных сравниваемой группы - Х%.

Согласно этой пропорции у крыс 2-й группы (ацетилсалициловая кислота+тромбин):
45,6 = 100%,
63,6 = Х%,
Х=139%.

Таким образом, величина "X" (толерантность к тромбину у крыс, получавших ацетилсалициловую кислоту) увеличилась до 139%.

У крыс 3-й группы (получали тироксин) - толерантность (Х%) снизилась до 29,8%:
45,6 = 100%,
13,6 = Х,
Х=29,8%.

Сведения, подтверждающие специфичность результатов. получаемых заявляемым способом
Эксперимент выполнили способом, который мы рассматриваем как аналог заявляемого нами. Этот эксперимент по схеме идентичен представленному выше, однако согласно аналогу в нем определяли частоту гибели (выживания) крыс в течение 24 ч, что потребовало включить для получения достоверных данных по 50 крыс в группу (всего 150 крыс).

Группа 1-я (контроль) - животные до введения тромбина воздействиям не подвергались.

Группа 2-я - крысы получали ацетилсалициловую кислоту по 4 мг/кг в течение 3 дней.

Группа 3-я - крысы получали тироксин (35 мг/кг) в течение трех дней.

На 4-й день всем крысам ввели тромбин (по 1 мл/кг, активность 25 с) и в течение 24 ч учитывали гибель животных. В контроле выжило 47,3% крыс, при введении тромбина на фоне ацетилсалициловой кислоты - 59,2%, а на фоне тироксина - 29,9%.

Эти наблюдения свидетельствуют, что способ, заявляемый нами, отражает именно толерантность к тромбину, т.е. способность выживать при внезапном повышении уровня тромбина в кровотоке, а не какие-либо иные свойства организма: по результатам заявляемого способа толерантность возросла или уменьшилась при тех воздействиях, которые повысили или уменьшили выживаемость крыс. Однако при использовании заявляемого способа изменения толерантности выражены количественно.

Приведенная таблица характеризует заявляемый способ в сравнении со способом-прототипом.

Таким образом, цель достигается в сроки, сокращенные по сравнению со способом-прототипом, в пересчете на минимальное число групп (контроль и опыт) в 9-10 раз, требует в 3,5 раза меньше наименований препаратов и в 2 раза меньше наименований химических реагентов. Результаты, в отличие от способа-прототипа, имеют количественное выражение.

Способ относится к биохимии, точнее к способам оценки толерантности организма экспериментальных животных к тромбину, и может быть использован научно-исследовательскими учреждениями медико-биологического профиля для изучения эффекта воздействий, меняющих устойчивость организма к тромбину. Способ включает внутривенное введение экспериментальным крысам (не подвергавшихся и подвергавшихся изучаемым воздействиям) раствора тромбина определенной активности и объема, отбор проб крови через 30 мин после его инъекции, определение в плазме отобранной пробы крови остаточного количества фибриногена, реагирующего на тромбин, сопоставление этого количества с содержащимся в плазме интактных крыс и расчет остаточной концентрации фибриногена по формуле D%=(С_о:С_к)•100, где D - остаточная концентрация фибриногена, %; С_к - концентрация фибриногена у крыс, которым тромбин не вводили; С_о - концентрация фибриногена у крыс, которым ввели тромбин на фоне какого-либо изучающегося воздействия. Толерантность к тромбину рассчитывается по формуле Х%=(D_o:D_к)•100, где Х% - толерантность к тромбину, %; D_o - остаточная концентрация фибриногена у группы, подвергавшейся изучаемому воздействию, %; D_к - остаточная концентрация фибриногена у группы, не подвергавшейся изучаемому воздействию (контрольная группа), %. Способ обеспечивает снижение трудозатрат и времени исследований. 1 табл.

Способ определения толерантности к тромбину и влияния на толерантность каких-либо воздействий путем введения в яремную вену интактным и подвергшимся изучаемому воздействию крысам раствора тромбина и оценки (через 30 мин) изменения уровня компонентов системы плазмокоагуляции в их крови, отличающийся тем, что для количественной оценки результатов в плазме крови определяют содержание остаточного фибриногена, свертываемого тромбином, и рассчитывают результат по формуле

D%=(С_о/С_к)×100,

где D - остаточная концентрация фибриногена, %;

С_к - концентрация фибриногена у крыс, которым тромбин не вводили и воздействиям не подвергали;

С_о - концентрация фибриногена у крыс, которым ввели тромбин на фоне изучающегося воздействия,

а затем значение остаточной концентрации у крыс, которым тромбин ввели без предварительных воздействий, принимают за 100-процентную толерантность к тромбину и устанавливают (в процентах) изменение толерантности при изучаемом воздействии по формуле

Х%=(D_o/D_к)×100,

где Х% - толерантность к тромбину, %;

D_o - остаточная концентрация фибриногена у группы, подвергавшейся изучаемому воздействию, %;

D_к - остаточная концентрация фибриногена у группы, не подвергавшейся изучаемому воздействию (контрольная группа), %.