СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТУЧНЫХ КЛЕТОК КОЖИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, лабораторному делу, конкретно к способам количественной оценки функциональной активности тучных клеток.

Известен способ количественной оценки функциональной активности тучных клеток, который заключался в заборе кусочка кожи, весом 5-10 г со спины животного, который фиксировали в жидкости Карнуа и готовили парафиновые срезы. Затем их окрашивали 0,1% раствором толуидинового синего. Под микроскопом (Х400) подсчитывали общее количество тучных клеток кожи в 30 полях зрения.

Все тучные клетки по сумме морфологических признаков делили на 3 типа:
1 тип - мелкие, чаще вытянутые клетки с неоформленной ортохроматической зернистостью и плохо различимым ядром (молодые, незрелые формы);
2 тип - крупные клетки овальной или неправильной формы с хорошо дифференцированной метахроматической гранулярностью в цитоплазме и отчетливо различимым ядром (зрелые формы);
3 тип - клетки дегранулирующие с явными признаками нарушения целостности клеточного тела и выделения в окружающее пространство цитоплазматических гранул (дегранулированные формы). Для оценки функциональной активности тучных клеток кожи вычисляли индекс активности (ИА) - отношение числа дегранулированных тучных клеток к количеству всех интактных (1). При величине индекса активности в пределах от 0,09 до 0,28 определяли нормальную функциональную активность, а при величине <0,28 - повышение функциональной активности.

Однако данный способ имеет недостатки:
недостаточная точность, т.к. способ оценки носит субъективный характер.

Новая техническая задача - повышение точности способа.

Указанную задачу решают применением нового способа количественной оценки функциональной активности тучных клеток кожи, заключающегося в заборе клеточного материала и последующем его исследовании, причем его гомогенизируют, трипсонизируют, термостатируют, затем центрифугируют и готовят контрольную пробу, добавляя в нее физиологический раствор, и пробу сравнения, добавляя в нес активатор дегрануляции, после пробы помещают в термостат и далее окрашивают 0,3% раствором нейтрального красного, фотоколориметрируют и вычисляют степень дегрануляции тучных клеток по формуле:
СДТК=D₂-D₁х100,
где СДTК степень дегрануляции тучных клеток, в усл.ед.;
D₁ - оптическая плотность пробы сравнения;
D₂ - оптическая плотность контрольной пробы.

Способ осуществляют следующим образом.

Из области спины животного берут кусочек кожи весом 0,5 г, промывают физиологическим раствором, помещают в фарфоровую ступку и измельчают ножницами. Измельченную дермальную ткань переносят в центрифужную пробирку, заливают 3 мл 0,12% раствора трипсина и оставляют на 60 мин при 37^oС, периодически тщательно перемешивая. После термостатирования в пробирку добавляют 3 мл 5% лошадиной сыворотки, чтобы остановить действие трипсина (2).

Взвесь центрифугируют в течение 10 мин при 600-700 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют 5 мл среды 199.

Из центрифужной пробирки по 2 мл полученной взвеси переносят в две новые пробирки, в одну из которых добавляют 2 мл 1% раствора активатора дегрануляции, например пирогенала (проба сравнения), а во вторую - 2 мл физиологического раствора (контрольная проба). Пробирки помещают в термостат на 30 мин при 37^oС. Затем их повторно центрифугируют в течение 20 мин при 600-700 об/мин. Сливают супернатант и ресуспендируют осадок средой 199, по 3 мл в каждую пробирку.

В обе пробы вносят по 1 капле 0,3% нейтрального красного и тщательно перемешивают. Содержимое пробирок фотоколориметрируют против воздуха при длине волны 490 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 мм, определяют оптическую плотность (3).

Под воздействием активатора происходит массивная дегрануляция тучных клеток в пробе с добавлением 1% раствора пирогенала. Дегранулированные тучные клетки, при окраске нейтральным красным, остаются менее прокрашенными по сравнению с тучными клетками в пробирке с добавлением физиологического раствора и соответственно оптическая плотность при фотоколориметрировании содержимого первой пробирки с пробой сравнения ниже. Степень функциональной активности тучных клеток прямо пропорциональна разнице между оптической плотностью пробы сравнения и контрольной пробы и вычислялась но формуле:
СДТК=D₂-D₁х100,
где СДТК - степень дегрануляции тучных клеток, в усл.ед.;
D₁ - оптическая плотность пробы сравнения;
D₂ - оптическая плотность контрольной пробы.

Обоснование способа.

1. Для выделения тучных клеток кожу гомогенизируют и тринсонизируют, термостатируют, центруфугируют, так как эти этапы являются необходимыми для приготовления клеточной взвеси (2). При приготовлении проб руководствуются тем, что они готовятся из одного кусочка кожи и в одних условиях, исходя из этого, предполагается, что в них содержится одинаковое количество тучных клеток. В качестве активатора дегрануляции используется, например, пирогенал, так как он является мощным неспецифичным активатором дегрануляции, апробированным во многих экспериментальных работах (4). Окраска нейтральным красным позволяет выявить тучные клетки и по интенсивности окраски можно судить о зрелости тучной клетки (5). Фотоколориметрирование является распространенным методом исследования в случае анализа растворов с разной интенсивностью окраски. Использование формулы позволяет охарактеризовать функциональную активность тучных клеток кожи в количественном значении, что удобно для интерпретации и статистической обработки результатов.

2. Количественные критерии оценки были получены после интерпретации результатов экспериментальных исследований, которые были проведены на 60 взрослых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г, разделенных на 2 группы: группа А с моделированным аллоксановым диабетом (45 крыс) и группа В - интактные животные (15 крыс). Для моделирования аллоксанового диабета у животных использовали 4% раствор аллоксангидрата ("Лахема-Хеманол", Чехословакия), который вводили подкожно однократно в дозе 400 мг/кг.

Животных забивали декапитацией согласно методическим рекомендациям МЗ СССР "Эвтаназия экспериментальных животных" [1985]. Исследуемым материалом являлись гистопрепараты кожи. Статистическую обработку данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента и определяли значимость различий (p). Разницу двух сравнимаемых величин считали достоверной при р<0,05.

Результаты исследования представлены в таблице, из которой видно, что при моделировании у животного патологического процесса происходит численное повышение показателей функциональной активности тучных клеток кожи. Для данной модели патологического процесса при значении ИА от 0,09 до 0,28 и СДТК от 2,1 до 2,5 определяют нормальную функциональную активность, а при значении ИА>0,28 и СДТК>2,5 определяют повышенную функциональную активность. Таким образом, предлагаемый способ, апробированный на модели аллоксанового диабета крыс, используется для количественной оценки функциональной активности тучных клеток кожи; значения активности будут определяться патологическим состоянием животного.

Данный способ может быть рекомендован для исследования функциональной активности тучных клеток кожи при различных патологиях, моделируемых на животных.

Список литературы
1. Соловьев Ю.Н. Действие холода и ультрафиолетовых лучей на синтез тучных клеток // Архив патологии, 1964. - 8. - с.63-68.

2. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина. - 1976 - 222 с.

3. Порядин Г. В., Зеличенко Л.И. Способ количественной оценки дегрануляции тучных клеток // Иммунология, 1991. - 3, с. 59-60.

4. Зеличенко Л. И., Ишимова Л.М. Пассивная анафилаксия тучных клеток и непрямой тест их дегрануляции // Тучные клетки соединительной ткани, - 1968. - С. 151.

5. Радунская С. Ф. Непрямой тест дегрануляции тучных клеток крыс как метод оценки специальной активности неинфекционными аллергенами. Автореф. дисс. кан. наук. М. - 1982. - 23 с.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для количественной оценки функциональной активности тучных клеток. Сущность изобретения состоит в том, что образец дермальной ткани измельчают, трипсонизируют, термостатируют, центрифугируют, готовят контрольную пробу путем добавления физиологического раствора и пробу сравнения добавлением раствора активатора дегрануляции, термостатируют, центрифугируют, окрашивают 0,3% раствором нейтрального красного, фотоколориметрируют при 490 нм, вычисляют степень дегрануляции тучных клеток (СДТК) и при значениях СДТК от 2,1 до 2,5 функциональная активность тучных клеток кожи соответствует норме. Техническим результатом является повышение точности способа оценки функциональной активности тучных клеток кожи. 1 табл.

Способ оценки функциональной активности тучных клеток кожи, заключающийся в исследовании дермальной ткани, отличающийся тем, что ее измельчают, добавляют 3 мл 0,12%-ного раствора трипсина, термостатируют 60 мин при 37°С, добавляют 3 мл 5%-ной лошадиной сыворотки, центрифугируют 10 мин при 600-700 об/мин, осадок ресуспендируют 5 мл среды 199, готовят контрольную пробу путем добавления к 2 мл полученной взвеси 2 мл физиологического раствора, и пробу сравнения добавлением к 2 мл взвеси 2 мл 1%-ного раствора активатора дегрануляции, например пирогенала, термостатируют 30 мин при 37°С, центрифугируют 20 мин при 600-700 об/мин, осадок ресуспендируют 3 мл среды 199, вносят по 1 капле 0,3%-ного нейтрального красного, фотоколориметрируют при 490 нм, вычисляют степень дегрануляции тучных клеток (СДТК) по формуле

СДТК=D₂-D₁ × 100,

где D₁ - оптическая плотность пробы сравнения;

D₂ - оптическая плотность контрольной пробы,

и значения СДТК от 2,1 до 2,5 свидетельствуют о нормальной функциональной активности тучных клеток кожи.