СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТОКСЕМИИ И СЕПТИЦЕМИИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно, к диагностике инфекционно-воспалительных заболеваний.

В клинической практике о наличии синдрома токсемии судят по комплексу субъективных (головные боли, головокружение, слабость, недомогание, потливость), а также объективных (повышение СОЭ, количественные и качественные сдвиги лейкоцитарной формулы, а также белков плазмы) симптомов. В то же время известно, что эти критерии не являются строго специфичными только для токсемии; их определенные сочетания имеют место и при септицемии.

С целью диагностики септицемии в настоящее время используются бактериологические методы с использованием ряда сред: по Хью-Лейфсону; Гисса (для идентификации стафилококка), по Аронс Р.М. Колкер И.И. (для идентификации синегнойной палочки) и др.

В качестве прототипа взят бактериологический метод с использованием среды Хью-Лейфсона (В. С. Матковский и др. Инфекционные болезни. Л. 1977, с. 108-112).

Состав среды: пептон 0,2% NaCl 0,5% K₂HPO₄ 0,03% глюкоза 1% агар 0,3% бромтимол синий (индикатор) 0,003% Готовую среду разливают по 5 мл в пробирки. Непосредственно перед посевом пробирки со средой помещают на 15 мин в кипящую водяную баню для удаления кислорода. Суточную агаровую культуру исследуемого штамма сеют петлей в столбик среды уколом до дна пробирки, затем поверхность агара заливают стерильным вазелиновым маслом для создания анаэробных условий. Посев инкубируют при 37^oC в течение 5 суток, ежедневно регистрируя результаты. Реакцию расценивают как положительную если не менее 2/3 столбика среды окрашивается в желтый цвет.

Однако методы посева крови на стерильность используются в клиниках относительно редко в виду их технической сложности и длительности времени проведения. Следует также отметить, что бактериологический анализ обнаруживает наличие микробов в крови лишь в 10-18% случаев сепсиса (А.Д.Островский, А.С. Воробьев, 1985). Этот процент несколько возрастает при многократных исследованиях. И если к этому добавить известный факт, что даже при тяжелых формах сепсиса не всегда удается выделить возбудителя вследствие кратковременности бактеримии, то следует согласиться с мнением отрицательный результат бактериологического исследования не является достаточным основанием для исключения диагноза "сепсис".

Целью настоящего изобретения является повышение достоверности диагностики токсемии и септицемии, а также их сочетание у детей.

Предлагаемый способ основан на выявление в мазках лейкоконцентрата при постановке реакции на миелопероксидазу характерных клеточных форм:
при токсемии сочетание дегранулированных нейтрофилов с незрелыми формами (при- и миелоцитами, насыщенными пероксидазосодержащими гранулами)(ПО-гранулами).

при септицемии сочетание атипичных бластных клеток (паралейкобластов) миелоидного ряда с незрелыми формами, насыщенными ПО-гранулами при отсутствии дегранулированных нейтрофилов.

при комбинации токсемии и септицемии сочетание признаков, характерных для первых двух вариантов, т.е. наличие в мазках дегранулированных клеток, паралейкобластов и незрелых форм нейтрофильного ряда, чрезмерно насыщенных ПО-гранулами.

Описание предлагаемого в качестве изобретения способа.

1. Получение лейкоконцентрата. Гепаринизированная венозная кровь в количестве 3-5 мл отстаивается в течение 20-30 мин для осаждения эритроцитов. Надосадок со взвешенными лейкоцитами переносится в другую пробирку и отстаивается повторно 20-25 мин. После удаления плазмы из осадка готовят тончайшие мазки. Недопустимо встряхивание, центрифугирование или применение веществ, ускоряющих осаждение эритроцитов.

2. Активность миелопероксидазы в мазках лейкоконцентрата выявляется усовершенствованным бензидиновым методом: тонкие мазки из лейкомассы высушивают в течение не менее чем 40-60 мин и фиксируют в свежеприготовленном спирт-формоле (1: 9). После промывки проточной водой мазки инкубируют в среде, содержащей 2,5 мл насыщенного при комнатной температуре раствора бензидина в трис-буфере (pH 7,2), 2,5 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,03% раствора перекиси водорода в течение 5 мин. Насыщенный раствор бензидина в трис-буфере готовится следующим образом: к 90 мл трис-буфера, подогретом до 70^oC, добавляют 90 мг бензидина и тщательно смешивают в течение 5-10 мин. Далее после фильтрации через ватный фильтр раствору дают остыть до комнатной температуры. При этом на дно пробирки оседают кристаллы бензидина, что является показателем насыщенности раствора. Использование такого раствора мы считаем существенным как для стандартизации концентрации субстрата, так и для последующего получения стабильных результатов. Раствор стоек в течение 2-3 месяцев при хранении в темном месте.

Докрашивание ядер проводят гематоксилином Эрлиха. Для этого к 10 мл дистиллированной воды добавляют 10 капель гематоксилина и после фильтрации через бумажный фильтр наносят несколько капель на 2-3 мин. При этом достигается и фоновое докрашивание цитоплазмы, что существенно для характера распределения гранул в клетках.

Примеры конкретного выполнения способа:
1. Больной ребенок А. 4 года (и.б. N 2694) поступил в соматическое отделение детской многопрофильной больницы с диагнозом: острая пневмония. Болен две недели, началось заболевание с кашля, одышки, высокой температуры (38,8^oC).

Объективно: правая половина грудной клетки несколько отстает в акте дыхания. Перкуторно справа ниже угла лопатки отмечается притупление. Аускультативно там же звучные крепитирующие хрипы. Анализ крови: Нв 72 Ед, ЦП 0,9, СОЭ 17 мм/час, Л 4600.

На рентгенограмме средняя и нижняя доли левого легкого затемнены. Клинический диагноз: полисегментарная пневмония, среднетяжелой формы. Посев крови на стерильность, проведенный дважды, рост микробов не дал.

При исследовании описанным способом выявлено следующее:
Более 60% нейтрофилов имеют признаки дегрануляции выраженная изреженность гранул особенно на периферии клеток, неравномерность их расположения в средних отделах цитоплазмы. В мазках единичные незрелые формы (по- и миелобласты) насыщенные ПО-гранулами (фиг. 1). Картина характерна для токсемии. Даны рекомендации.

2. Ребенок Гусейнов М. 6 мес. (и.б. N 6350(527)) поступил в грудное отделение детской многопрофильной больницы г. Махачкалы. С 3-х месячного возраста у ребенка периодически повышалась температура до 38-39^oC. Пупочная рана долго не заживала. Через месяц после начала заболевания на коже появились везикуло-пустулезные высыпания с жидким содержимым. Состояние ребенка при поступлении тяжелое беспокойный, капризный, плохо берет грудь. Умеренный цианоз. В легких везикулярное дыхание. Печень увеличена на 3 см. Гепатолиенальный синдром.

Анализ крови: Л 13,3•10⁹, СОЭ 55 мм/час. Предварительный диагноз: стафилококковый сепсис? Посев крови на стерильность, проведенный на третьи сутки, рост микробов не дал.

При исследовании описанным способом выявлено следующее: большинство сегментоядерных нейтрофилов имеет высокую и умеренную активность, отсутствуют признаки их дегрануляции. На мазках не мало (2%) атипичных бластных клеток-паралейкобластов слегка сегментированных ядром и следами диффузной или гранулярной активности (фиг.2). Указанные формы чередуются с незрелыми клетками миелоидного ряда (промиелоциты и миелоциты), насыщенные пероксидазосодержащими гранулами. Заметный полиморфизм нейтрофилов по размерам. Картина характерна для септицемии.

Даны рекомендации. При повторном (через 10 сут.) бактериологический анализ высеян.

3. Больной, 7 лет (и. б. N 4449) поступил в хирургическое отделение детской многопрофильной больницы с диагнозом: деструктивная пневмония. Общее состояние при поступлении тяжелое, стонет, выраженная одышка, температура - 38^oC.

В легких справа укорочение перкуторного звука. Аускультативно дыхание с бронхиальным оттенком.

Рентгеноскопия органов грудной клетки: справа от VIII ребра до диафрагмы интенсивное равномерное затемнение легочного поля с горизонтальной меткой.

Анализ крови: СОЭ 66 мм/час, Л 14,5•10⁹, миел 7, ю 10, п -13, с 42.

Посев крови на стерильность дал рост.

Клинический диагноз: острая бактериальная деструкция правого легкого. Сепсис.

При исследовании описанным способом выявлено: нейтрофилы с признаками дегрануляции (45% ) чередуются с незрелыми клетками (про- и миелоцитами), насыщенными ПО-гранулами (3%) и паралейкобластными формами малых размеров со слабой диффузной ферментной активностью в цитоплазме (4%) (фиг. 3).

Картина характерна для токсемии и септицемии.

При повторном бактериологическом анализе также высеян.

С целью проверки достоверности полученных на клиническом материале результатов произведены эксперименты с воспроизведением септицемии и токсемии. Сепсис у крыс получен по методу Л.Л.Шимкевича путем однократного внутримышечного введения суточной культуры, содержащей 1•10⁵ микробных тел в 1 мл. У всех животных при бактериологическом анализе в первые 1-3 дня высеян.

В мазках лейкоконцентрата после постановки реакции на миелопероксидазу обнаружены: паралейкобластные формы (1%) с резким полиморфизмом размеров и следами гранулярной активности, единичные незрелые формы (промиелоциты) насыщенные ПО-гранулами. Зрелые формы нейтрофилов без признаков дегрануляции.

При введении микробных тел в 10% растворе CaCl₂, вызывающих как правило местный некроз тканей, в мазках наряду с паралейкобластами и незрелыми формами миелоидного ряда обнаруживается большой процент (55-65%) дегранулированных сегментоядерных нейтрофилов.

Отличительные признаки от прототипа:
ставят реакцию на миелопероксидазу (а по прототипу делают посев штамма в столбик среды и инкубируют при 37^oC в течение 5 сут.);
при появлении в мазках дегранулированных нейтрофилов в сочетании с незрелыми формами (про- и миелоциты), насыщенные ПО-гранулами, диагностируют токсемию;
при появлении в мазках атипичных бластных форм (паралейкобластов) с резким полиморфизмом размеров, а также форм ядер в сочетании с незрелыми клетками миелоидного ряда и нейтрофилами без признаков дегрануляции, диагностируют сепсис;
при появлении в мазках дегранулированных клеток паралейкобластов и незрелых форм нейтрофильного ряда, чрезмерно насыщенных ПО-гранулами, диагностируют токсемию и септицемию;
раствор готовят следующим образом: к 2,5 мл насыщенного при комнатной температуре раствора бензидина в трис-буфере (pH 7,2) добавляют 2,5 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,03% раствора перекиси водорода. Для получения насыщенного раствора бензидина к 90 мл трис-буфера, подогретом до 70^oC, добавляют 90 мг бензидина и тщательно смешивают. Далее после фильтрации через ватный фильтр раствору дают остыть до комнатной температуры. При этом на дно пробирки оседают кристаллы бензидина, что является показателем насыщенности раствора.

Использование: в области медицины, в частности в диагностике инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: выявляют в мазках лейкоконцентрата при постановке реакции на миелопероксидазу характерных форм клеток, при этом появление в мазках паралейкобластных форм, незрелых клеток миелоидного ряда, насыщенных ферментосодержащими гранулами и нейтрофилов с заметным полиморфизмом по размерам, является специфичным признаком сепсиса септицемической формы. При наличии воспалительного очага без септицемии незрелые формы обычно сочетаются с дегранулированными клетками. Способ позволяет четко разграничить наличие синдромов септицемии и токсемии, а также их сочетание, и установить бактеримию в первые 1-3 дня заболевания. 1 з. п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ дифференциальный диагностики токсемии и септицемии, включающий исследование крови больного, отличающийся тем, что из крови больного готовят мазки лейкоконцентрата и ставят реакцию на миелопероксидазу и при наличии в мазках дегранулированных нейтрофилов (50 70%) в сочетании с незрелыми формами (про- и миелоциты), насыщенными пероксидазосодержащими гранулами (2 - 4%), диагностируют токсемию, при наличии атипичных бластных форм (парлейкобластов) с резким полиморфизмом размеров, а также форм ядер (3 5%) в сочетании с незрелыми клетками миелоидного ряда (про- и миелоциты) в количестве 1 3% и нейтрофилами без признаков дегрануляции диагностируют септицемию, а при наличии дегранулированных нейтрофилов, паралейкобластов и незрелых форм миелоидного ряда, насыщенных пероксидазосодержащими гранулами, диагностируют сочетание токсемии и септицемии. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор для постановки реакции на миелопероксидазу готовят при комнатной температуре, приливая к 2,5 мл насыщенного раствора бензидина в трис-буфере (pH 7,2) 2,5 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода, при этом насыщенный раствор бензидина получают путем смешивания подогретого до 70^oС 90 мл трис-буфера с 90 мг бензидина и последующей фильтрацией его через ватный тампон.