ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE КМ206 КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА СЕРОВАРА ОГАВА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/21 A61K39/106 C12N1/21 C12R1/63 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара серовара Огава, эффективно продуцирующего основные протективные антигены - холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и белок внешней мембраны OmpU, и может быть использовано в производстве для создания высокоэффективных химических холерных вакцин нового поколения, получения очищенных препаратов указанных антигенов, предназначенных для дальнейшего приготовления диагностических тест-систем, а также для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.

Известен штамм классического биовара V. cholerae KM68 серовара Огава (авторское свидетельство СССР 1456468 МКИ: С 12 N 1/20, 15/00, A 61 K 35/74//(C 12 N 1/20, C 12 R 1:63)), продуцирующий в среду выращивания холерный токсин (по данным GM₁ELISA 35-45 мкг/мл), В-субъединица которого является основным иммуногеном.

Однако продукция основного фактора колонизации холерного вибриона - токсин-корегулируемых пилей адгезии, а также иммуногенного и протективного белка внешней мембраны - OmpU у этого штамма неизвестна.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм V. cholerae 2414, классического биовара серовара Огава - продуцент холерного токсина (XT) и токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА) (патент РФ 2169187, МКИ: C 12 N 1/20), эффективно продуцирующий в среду выращивания холерный токсин (по данным GM₁ELISA 48-60 мкг/мл), синтезирующий на поверхности клеток токсин-корегулируемые пили адгезиии и имеющий белок OmpU.

Однако указанный штамм содержит плазмиду, несущую гены устойчивости к антибиотикам, и для эффективной экспрессии протективных антигенов выращивание этого штамма необходимо производить на средах с добавлением тетрациклина или канамицина, что усложняет процесс выращивания, повышает себестоимость, а также загрязняет антибиотиками готовый продукт.

Для создания более эффективных химических вакцин, а также дешевых диагностических тест-систем необходимы штаммы холерного вибриона с высокой продукцией и стабильно сохраняющие основные протективные антигены: холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и белок внешней мембраны OmpU, и не требующие для экспрессии протективных антигенов использования сред с антибиотиками.

Задача изобретения - получение штамма холерного вибриона классического биовара серовара Огава, характеризующегося высокой продуктивностью и стабильно экспрессирующего основные протективные антигены на средах без антибиотиков.

Сущность данного изобретения в том, что получен штамм классического биовара серовара Огава - Vibrio cholerae, продуцирующий основные протективные антигены (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и белок внешней мембраны OmpU) на обычных средах.

Заявляемый штамм сконструирован путем конъюгативного введения в клетки природного классического штамма V. cholerae Дакка35 Огава, продуцирующего 10-13 мкг/мл холерного токсина, рекомбинантной плазмиды рСТ105 (Кm^rТс^r), с клонированными генами холерного токсина, и последующей элиминацией указанной плазмиды из клеток. При введении плазмиды происходит одновременное увеличение продукции трех основных протективных антигенов (XT, ТКПА, белка OmpU), обусловленное, видимо, повышением за счет плазмидно-хромосомных взаимоотношений активности гена toxR, который является общим регуляторным геном для структурных генов ctxAB, tcp, ompU, которое не снижается при элиминации плазмиды.

В результате получен штамм, который на обычных средах для выращивания холерного вибриона продуцирует в 3,8 раза больше холерного токсина, значительное количество токсин-корегулируемых пилей адгезии и синтезирует белок OmpU.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб" (г. Саратов) под номером КМ206.

Основные свойства штамма V. cholerae KM206:
- высокий уровень продукции холерного токсина в среду выращивания, В - субъединица которого является основным иммуногеном;
- образование поверхностных токсин-корегулируемых пилей адгезии, являющихся основным колонизирующим фактором холерного вибриона;
- синтез белка-адгезина внешней мембраны OmpU.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение среды. Штамм растет на простых средах. Прототроф.

Патогенные свойства - вирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10⁵ м.т. /мл.

Физиологические свойства.

Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками О и Огава. Чувствителен к холерному диагностическому фагу С. Не ферментирует лактозу и арабинозу. До кислоты без газа ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.

Пример 1, иллюстрирующий высокую продуктивность штамма.

Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae KM206 засевают на агар Хоттингена рН 7.6 и инкубируют 18 ч при 37^oС. Выросшую культуру рассевают на LB-агар для получения изолированных колоний и последующей проверки наличия токсин-корегулируемых пилей адгезии методом самоагглютинации культуры в бульоне [Chiang S.L. et al. Molecular Microbiology, 1995, v.17, p.1133-1142]. Через 18 ч ресуспендируют одну выросшую колонию в 1 мл LB бульона и как инокулят вносят 7 мкл этой суспензии в 10 мл казаминового бульона, содержащего 3% казаминовых кислот и 0,5% дрожжевого экстракта, рН 7,6. Культуру выращивают 17-18 ч в шейкере при 30^oС. Степень агглютинации учитывают визуально. Штамм KM206 вызывает видимую самоагглютинацию бактериальных клеток в бульоне за счет синтеза значительного количества находящихся на поверхности токсин-корегулируемых пилей адгезии.

Клетки после самоагглютинации используют для определения наличия белка OmpU методом электрофореза, а в бульоне определяют холерный токсин иммуноферментным методом [Svennerholm A.M. et al. J. Clin. Microbiol., 1983, v.17, р. 596-601]. Пробы бульона инкубируют в течение двух часов при 37^oС в лунках микроплат, затем блокируют неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 1 ч при 37^oС. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных конъюгатов, которые представляют собой меченые пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата - 0,03% перекиси водорода в нитратном буфере рН 4,0 с 0,1% ABTS [2,2 azino-di-(3-thylbenzthiazoline sulphonate)] . Чувствительность метода ELISA составляет в данной серии опытов 1 мкг/мл. Количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма рассчитывают в соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших микробных клеток. Штамм V. cholerae КМ206 продуцирует 38,0 мкг/мл токсина.

Пример 2, подтверждающий синтез белка внешней мембраны OmpU.

Культуру холерного вибриона штамма КМ206 после самоагглютинации исследуют методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия для изучения белкового состава [Laemmli U.K. Nature, 1970, v. 227, p.680-685]. Клетки ресуспендируют в дистиллированной воде, приливают равный объем "буфера образца", кипятят на водяной бане в течение 5-7 мин. Электрофорез проводят до вхождения образца в гель при токовой нагрузке 10 мА и далее при 20 мА. Используют электродный буфер, содержащий 0,195 М глицина/0,025 М трис/0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3. Фиксацию белков в полиакриламидном геле после проведения электрофореза осуществляют в течение часа или ночи в растворе, содержащим изопропанол, окрашивают фиксированные белки кумасси R-250 в течение часа. Избыток красителя из геля вымывают диффузией в растворе 7% уксусной кислоты. Наличие белка OmpU в заявляемом штамме определяют, сравнивая белковый профиль клеточных лизатов штамма КМ206 с исходным природным штаммом V. cholerae Дакка35 Огава, не содержащим этого белка, а также с известными маркерами молекулярных масс.

Таким образом, заявляемый штамм Vibrio cholerae KM206 обладает высоким уровнем продукции холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, белка OmpU в сравнении со всеми известными природными и рекомбинантными штаммами холерного вибриона, но в отличие от последних не содержит плазмиды, несущей гены устойчивости к антибиотикам, что упрощает и удешевляет процесс выращивания данного штамма и улучшает экологические параметры. Штамм может быть использован в производстве для получения более эффективной холерной вакцины холероген-анатоксин, содержащей новые протективные антигены, которая применяется для профилактики холеры; приготовления дешевых очищенных антигенов, используемых при разработке диагностических тест-систем для выявления природных штаммов с продукцией холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии; проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения вакцин и диагностических тест-систем. Сущность изобретения заключается в получении штамма классического биовара серовара Огава Vibrio cholerae KM206 - продуцента основных протективных антигенов на обычных средах путем конъюгативного введения в клетки природного токсигенного штамма Vibrio cholerae Дакка35 классического биовара рекомбинантной плазмиды рСТ105 (Km^rTc^r), с клонированными генами холерного токсина, и последующей элиминации плазмиды. Уровень продукции холерного токсина в штамме возрос в более чем 3 раза (38,0 мкг/мл), значительно увеличился синтез токсин-корегулируемых пилей адгезии и появился белок OmpU и для выращивания штамма не требуется добавление в среду антибиотиков как в случае плазмидных штаммов. Использование штамма позволяет повысить уровень продукции холерного токсина, В-субъединица которого является основным иммуногеном, и тонксин-корегулируемых пилей адгезии (вызывает видимую самоагглютинацию клеток в бульоне), являющихся основным колонизирующим фактором холерного вибриона, а также штамм синтезирует протективный и иммуногенный белок внешней мембраны OmpU на средах без антибиотика.

Штамм бактерий Vibrio cholerae KM206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов.