Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае сноLеRае серовара Огава-продуцент холерного токсина Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N15/00 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/63 

I

Изобретение относится к микробиологии., а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара,серовара Огава, продуцирующего и секретирующего холерный токсин.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Штамм V. cholerae cholerae КМ68 создан путем конъюгативного введения гибридной плазмиды pCOtp7-2 в клетки вьщеленного от человека про- тотрофного штамма V.cholerae cholerae Дакка 35 серовара Огава. Ппазми- да рСО107-2 содержит оперон vet, де- терминирукяций синтез холерного токсина, и является производной плазми- ды рС0107, содержащей мини-транспо- зон, определякщий резистентность к канамицину. В результате введения в клетки штамма Дакка 35 плазмиды рС0107-2 получены клоны, устойчивые

(Л

к тетрациклину и канамицину, выра- батывакщие заметно большее количество токсина по сравнению с исходным штаммом. Штамм депонирован под номером КМ68 рС0107-2 и характеризуется 1 следующими признаками.

Культурально- морфологические. признаки. Подвижные, слегка изогнутые палочки.

На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний. При посеве в бульон вызывает равномерное помутнение этой среды.

Прототроф. Физислого-биохимичес- кие свойства.

Ферментирует до кислоты без газа маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу. Не ферментирует лактозу и арабинозу. Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты.

Не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина.

Чувствителен к холерному диагностическому фагу С.

Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками 0(1:3200) и Огава (1:1600).

Патогенные свойства.

Вирулентен для кроликов-сосунков в весьма небольших дозах 10 - 10 м.г./мл.

Пример. Высушенную ампульную культуру штамма V.cholerae cholerae КМ68 засевают на агар Хоттингера рН 7,6, содержащий 5 мкг/мл тетрациклина или.50 мкг/мл канамицина и инкубируют 18 ч при 37 С.

Для количественного определения холерного экзотоксина используют иммуноферментный метод Gm rELISA. В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина Клетки штамма КМ68 и исходного штамма Дакка 35 в объеме 10 мл выращивают 18 ч при в 0,1 л колбах в среде, содержащей 3% казаминовых кислот и 0,5% дрожжевого экстракта при рН 7,6. Клетки осаждают центрифугированием, в супернатанте определяют экзотоксин. Пробы инкубирут в течени часа в сенсибилизированной глнглио- зидами поверхности, лунок микроплат. Инкубацию с антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 18 ч при комнатной температуре. После промывания 0,05 М. фосфатным буфером рН 7,2 в лунки добавляют по 0,2 мп раствора иммуноферментных конъюра-,, тов в разведении. 1:150. Конъюгаты состоят из А-белка стафилококка и пероксидазы. Реакцию учитывают через 30 мин после добавления субстрата - 0,003% перекиси водорода в 0,15 М NaCl и п-фенилендиамина. Чувствительность метода в данной серии опытов составляет 1 нг/мп. Штамм КМ68

продуцирует 35-45 мг токсина на 1 л культурального фильтрата, исходный штамм Дакка 35-6-8 мг/л, а известный

штамм - 12 мг/л. Для получения экзотоксина и титрации его в кожной пробе по Крейгу агаровые культуры штаммов V.cholerae cholerae КМ68 и V.cholerae cholerae Дакка 35 засевают в

пробирки казаминового (казаминовые кислоты 30. г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, рН 7,6) или казеинового бульона с 2-3 мкг/мл тетрациклина или с 25 мкг/мп канамицина и выращивают при

интенсивной аэрации 16-18 ч при

. Затем культуру центрифугируют при 400 g 15 мин, к супернатанту добавляют мертиолат натрия в конечной концентрации 1:5000. Полученный экзотоксин титруют в кожной пробе по Крейгу на трех кроликах. Препарат раститровывают двукратно, начиная с концентрации 1:100, и вводят внутри- кожно в количестве 0,1 мл. Учет проводят через 24 ч.

В случае штамма КМ68 положительная реакция зарегистрирована в разведении токсина 1:6000 - 1:8000, у ис- . ходного штамма Дакка 35 - 1:16001:1800, у известного штамма - 1:800- 1:1300.

Таким образом, созданный штамм V.cholerae cholerae КМ68 рС0107-2 серовара Огава является гиперпроДУЦентом специфического холерного экзотоксина, секретирующегося во внешнюю среду, и может быть исполЬ- зован в качестве производственного штамма для получения холерного токсина и его В-субъединичного комплекса, также для создания синтетических противохолерных вакцин.

45

Формулаизобретеиия

Штамм .бактерий Vibrio cholerae cholerae серовара Огава КМ68 рС0107-2-продуц нт холерного токсина.

Изобретение относится к области микробиологии. Цель изобретения - повьштение выхода целевого продукта. Штамм V.cholerae cholerae серовара Огава получен путем конъюгативного введения гибридной плазмиды в клетки штамма Дакка 35, депонирован под номером КМ68 рС0107-2. Характерная особенность штамма - прототроф. Продуцирует в питательную среду 35-45 мг токсина на 1 л культурального фильтрата.