ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE КМ207 КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА СЕРОВАРА ИНАБА - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/21 A61K39/106 C12N1/21 C12R1/63 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара серовара Инаба, эффективно продуцирующего основные протективные антигены - холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и белок внешней мембраны OmpU, и может быть использовано в производстве для создания высокоэффективных химических холерных вакцин нового поколения, получение очищенных препаратов указанных антигенов, предназначенных для дальнейшего приготовления диагностических тест-систем, а также для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.

Известен штамм V. cholerae 2414 серовара Огава (патент РФ 2169187 МКИ: С 12 N 1/20), эффективно продуцирующий в среду выращивания холерный токсин (XT), В-субъединица которого является основным иммуногеном (по данным GM₁ELISA 48-60 мкг/мл), синтезирует на поверхности клеток основной колонизирующий фактор холерного вибриона токсин-корегулируемые пили адгезии (ТКПА) и имеющий белок внешней мембраны OmpU.

Однако указанный штамм относится к другому серовару, содержит плазмиду, несущую гены устойчивости к антибиотикам, и для эффективной экспрессии протективных антигенов при выращивании этого штамма необходимо добавлять антибиотики в среду выращивания.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм V. cholerae 569B Инаба, который используется в зарубежной и отечественной медицине в качестве производственного для получения вакцин (патент РФ 2076734, А 61 К 39/00, 35/76; Ketley J. et all. Infect. Immun., 1990, v.141, p.893-899). Однако указанный штамм по данным GM₁ELISA продуцирует только 9 мкг/мл холерного токсина в среду выращивания и небольшое количество токсин-корегулируемых пилей адгезии, выявляемых лишь высокочувствительным методом иммуноблота, но не в реакции самоагглютинации, а также не продуцирует мощный фактор адгезии холерного вибриона, находящийся на поверхности белок OmpU.

Для создания более эффективных химических вакцин, а также дешевых диагностических тест-систем необходимы штаммы холерного вибриона с высокой продукцией основных протективных антигенов: холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU.

Задача изобретения - получение штамма холерного вибриона классического биовара серовара Инаба с высокой продукцией основных протективных антигенов.

Сущность изобретения заключается в том, что получен штамм классического биовара V. cholerae серовара Инаба, являющийся продуцентом основных протективных антигенов: холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, белка внешней мембраны - OmpU.

Заявляемый штамм сконструирован путем конъюгативного введения в клетки природного штамма V. cholerae 569B Инаба, рекомбинантной плазмиды рСТ105 (Km^rTc^r), с клонированными генами холерного токсина, и последующей элиминации указанной плазмиды из клеток. При введении плазмиды происходит одновременное увеличение продукции трех основных протективных антигенов (XT, ТКПА, белка OmpU), обусловленное, видимо, повышением за счет плазмидно-хромосомных взаимоотношений активности гена toxR, который является общим регуляторным геном для структурных генов ctxAB, tcp, ompU, которое не снижается при элиминации плазмиды.

В результате получен штамм классического биовара серовара Инаба, у которого уровень продукции холерного токсина возрос в 2,6 раза, значительно увеличился синтез токсин-корегулируемых пилей адгезии и появился белок OmpU. Для выращивания указанного штамма не требуется добавление антибиотиков в среду выращивания, как в случае плазмидных штаммов, что упрощает процесс выращивания культуры, уменьшает себестоимость, а также не загрязняет антибиотиками готовый продукт.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб" (г. Саратов) под номером КМ207.

Основные свойства штамма V. cholerae KM207:
- высокий уровень продукции в среду выращивания (23,4 мкг/мл), холерного токсина, В-субъединица которого является основным иммуногеном;
- образование токсин-корегулируемых пилей адгезии, основного колонизирующего фактора холерного вибриона;
- синтез белка внешней мембраны OmpU, обладающего протективными и иммуногенными свойствами.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение этой среды. Штамм растет на простых средах. Прототроф.

Патогенные свойства - вирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10⁵ м.т. /мл.

Физиологические свойства.

Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками О и Инаба. Чувствителен к холерному диагностическому фагу С. Не ферментирует лактозу и арабинозу. До кислоты без газа ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.

Пример 1, иллюстрирующий высокую продуктивность штамма.

Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae KM207 засевают на агар Хоттингена рН 7,6 и инкубируют 18 ч при 37^oС. Выросшую культуру рассевают на LB-агар для получения изолированных колоний и последующей проверки наличия токсин-корегулируемых пилей адгезии методом самоагглютинации культуры в бульоне [Chiang S.L. et al. Molecular Microbiology, 1995, v.17, p.1133-1142]. Через 18 ч ресуспендируют одну выросшую колонию в 1 мл LB бульона и как инокулят вносят 7 мкл этой суспензии в 10 мл казаминового бульона, содержащего 3% казаминовых кислот и 0,5% дрожжевого экстракта, рН 7,6. Культуру выращивают 17-18 ч в шейкере при 30^oС. Степень агглютинации учитывают визуально. Штамм KM207 вызывает видимую самоагглютинацию бактериальных клеток в бульоне за счет синтеза значительного количества находящихся на поверхности токсин-корегулируемых пилей адгезии.

Клетки после самоагглютинации используют для определения синтеза белка OmpU методом электрофореза, а в бульоне определяют холерный токсин иммуноферментным методом [Svennerholm A.M. et al. J. Clin. Microbiol., 1983, v.17, р. 596-601]. Пробы бульона инкубируют в течение двух часов при 37^oС в лунках микроплат, затем блокируют неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 1 ч при 37^oС. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных конъюгатов, которые представляют собой меченые пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере рН 4,0 с 0,1% ABTS [2,2 azino-di-(3-thylbenzthiazoline sulphonate)] . Чувствительность метода ELISA составляет в данной серии опытов 1 мкг/мл. Количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма рассчитывают в соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших микробных клеток. Штамм V. cholerae КМ207 продуцирует 23,4 мкг/мл токсина.

Пример 2, подтверждающий синтез белка внешней мембраны OmpU.

Культуру холерного вибриона штамма КМ207 после самоагглютинации исследуют методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия для изучения белкового состава [Laemmli U.K. Nature, 1970, v. 227, p.680-685]. Клетки ресуспендируют в дистиллированной воде, приливают равный объем "буфера образца", кипятят на водяной бане в течение 5-7 мин. Электрофорез проводят до вхождения образца в гель при токовой нагрузке 10 мА и далее при 20 мА. Используют электродный буфер, содержащий 0,195 М глицина/0,025 М трис/0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3. Фиксацию белков в полиакриламидном геле после проведения электрофореза осуществляют в течение часа или ночи в растворе, содержащем изопропанол, окрашивают фиксированные белки кумасси R-250 в течение часа. Избыток красителя из геля вымывают диффузией в растворе 7% уксусной кислоты. Наличие белка OmpU в заявляемом штамме выявляют, сравнивая белковый профиль клеточных лизатов штамма КМ207 с исходным природным штаммом V. cholerae 569B Инаба, не содержащим этого белка, и с известными маркерами молекулярных масс.

Таким образом, заявляемый штамм Vibrio cholerae KM207 обладает высоким уровнем продукции холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, белка OmpU и для его выращивания в среду не требуется добавление антибиотиков. Штамм может быть использован в производстве для получения более эффективной холерной вакцины холероген - анатоксин, содержащей новые протективные антигены, которая применяется для профилактики холеры; приготовления дешевых очищенных антигенов, используемых при разработки диагностических тест-систем для выявления природных штаммов с продукцией холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии; для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения вакцин и диагностических тест-систем. Сущность изобретения заключается в получении штамма Vibrio cholerae KM207 классического биовара серовара Инаба - продуцент протективных антигенов (В-субъединицы в составе холерного токсина, основного колонизирующего фактора холерного вибриона - токсин-корегулируемых пилей адгезии, протективного и иммуногенного белка внешней мембраны - OmpU), путем конъюгативного введения в клетки природного токсигенного штамма Vibrio cholerae 569B классического биовара серовара Инаба рекомбинантной плазмиды рСТ105 (Кm^rТс^r), с клонированными генами холерного токсина, и последующей элиминации плазмиды. Уровень продукции холерного токсина в штамме возрос в 2,6 раза (23,4 мкг/мл), увеличился синтез токсин-корегулируемых пилей адгезии и появился белок OmpU, для выращивания штамма не требуется добавление в среду антибиотиков как в случае плазмидных штаммов. Использование штамма позволяет повысить уровень продукции холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии (вызывает видимую самоагглютинацию клеток в бульоне) и синтезирует белок внешней мембраны OmpU.

Штамм бактерий Vibrio cholerae KM207 классического биовара серовара Инаба - продуцент протективных антигенов.