Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае сноLеRае серовара Инаба,используемый в качестве продуцента холерного токсина Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/63 

I

Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара серовара Инаба, продуцирующего токсин.

Цель изобретения - повьшение про- дукдии токсина.

Штамм холерного вибриона классического биовара серовара Инаба получают путем введения гибридной плаз- миды РС0107-2, содержащей оперой vet, контролирующий синтез холерного токсина, в клетки Vibrio cholerae cho- lerae 569 В Инаба. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института Микроб под номером КМ 76/ /РС0107-2. «.

Характеристика штамма V. cholerae cholerae КМ76 рС0107-2 Инаба.

Культурально-мо рфологические признаки. Подвижные грамотрицательные палочки. Хорошо растет на простых полноценных средах и на средах с тетрациклином (5-10 мкг/мл) и канами- Цином (50 MKr/Nui), Формируя на плотных средах типичные для холерного вибриона колонии.

При посеве в жидкие среды вызывает равномерное помутнение бульона.

Прототроф.

Физиологические свойства. Относят- ся к 1 группе Хейберга, ферментируя до кислоты без газа маннозу, сахарозу, маннит и мальтозу. Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мп полимиксина.

4

о:

О ел

Чувствителен к холерному диагностическому фагу С.

Агглютинируется до титра холерными сыворотками О и Инаба.-s

Патогенные свойства. Вирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10 микр. тел.

Пример. Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae cholerae I(M76 засевают на агар Хоттингера рН 7,6, содержащий 5 мкг/мл тетрациклина или 50 мкг/мл канамицина, и инкубируют 18 ч при 37 С.

Для сопоставления способности про дуцировать экзотоксин штаммом КМ76 и исходным штаммом 569 В используют метод пассивного иммунного гемолиза. Колонии штамма КМ76 и 569 В переносят методом реплик на чашки с 1%-ным синказным агаром, содержащим IX отмытых в синказном бульоне эритроцитов барана. Посевы инкубируют 18 ч при , заливают слоем 0,5%-ного син- казного агара, содержащего азид натрия, комплемент морской свинки и мо- норецепторную антитоксическую сыворотку, инкубируют 1-2 ч при 37°С и. наблюдают зону гемолиза вокруг макроколоний, продуцирующих токсин во внешнюю среду. Исходный штамм V. cholerae cholerae 569 В продуцирует меньше экзотоксина, поэтому зона гемолиза вокруг макроколоний этого штамма меньшего размера, .чем у штамма КМ7 6 РС0107-2.

Для количественного определения холерного экзотоксина используют им- муноферментньй метод C,ELISA и мето титрации токсина на кроликах - кожную пробу по Крейгу.

При иммуноферментном методе СП,,ЕЫЗА в. качестве контроля, и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина. Чувствительность метода C ELISA составляет в данной серии опытов 1 нг/мл. В соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших, в процессе культивирования микробных клеток расчитывают количество продуцируемого холерного токсина исследуемым штаммом КМ76. Штамм V. cholerae cholera

10

20

-15д

4600754

КМ76 продуцирует 30-40 мг токсина на 1 л культурального фильтрата, тогда как у исходного штамма 569,В продукция токсина составляет 8-10 мг/л.

Для получения экзотоксина и титрации его в кожной пробе по Крейгу агаровые культуры штаммов V. cholerae. cholerae КМ76 и V. cholerae cho- .lerae 569В, взятого в качестве эталонного штамма - продуцента токсина, засевают в пробирки ка- заминового (казаминовые кислоты 30 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, рН 7,6) бульона с 2 мкг/л тетрациклина или с 20-50 мкг/мл канамицина. Культуру, вьфащенную при интенсивной аэрации () , центрифугируют. Полученный супернант (экзотоксин) титруют в кожной пробе по Крейгу на трех кроликах. Препарат раститровы- вают двукратно, начиная с концентрации 1:100, и вводят внутрикожно в количестве 0,1 мл. Учет проводят через 25 24 ч. В случае штам1 1а КМ76 положительная реакция зарегистрирована в разведении 1:5000-1:6000, у штамма 569В 1:1600 - 1:2000.

Полученные пробы экзотоксина про- ДХДИруемого штаммом КМ76, испытывают на наличие холерогенного эффекта на крольчатах-сосунках: 10-12 дневным крольчатам весом 130-160 г внутрики- шечно вводят препарат экзотоксина в объеме 1 мл. Через 24 ч у крольчат наблюдают полоядательный холерогенный эффект.

Изучение стабильности свойств штамма КМ76 продуцировать повьш1енное количество токсина показало, что добавление в среду выраш 1вания канамицина (20 мкг/мл) ири тетрациклина (2 мкг/мл) обеспечивает 100% стабильность данного признака у штамма КМ76.

Таким образом, использование нового штамма позволяет стабильно получать холерный токсин.

30

35

40

45

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae cholerae серовара Инаба КМ76 р СО107-2, используемый в качестве продуцента холерного токсина.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении холерного токсина. Цель изобретения - повьш1ение продукции токсина. Новый штамм - продуцент токсина, получают путем введения гибридной плазмиды в клетки высокотокси- генного штамма V. cholerae cholerae 569 В Инаба. Штамм депонирован под номером КМ76 рС0107-2. При вьфащива- нии штамма в питательной среде получают 30-40 мг TOKCHHa.l1 л культураль- ного фильтрата. а (Л