СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРГЛИКЕМИИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, биологии, биофизике и может быть использовано для диагностики гипергликемии различного генеза.

Глюкоза - один из важнейших компонентов крови, количество ее отражает состояние углеводного обмена.

При целом ряде состояний содержание глюкозы (гипергликемия) в крови повышается. Наиболее часто гипергликемия развивается у больных сахарным диабетом. Нормальная величина концентрации глюкозы в крови взрослого человека составляет 3,9-6,1 ммоль/л (Г.И. Назаренко, А.А. Кишкун. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М., 2000).

Гипергликемия наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях: сахарном диабете, дисфункции вегетативной нервной системы, повышении гормональной активности коры и мозгового слоя надпочечников, щитовидной железы, гипофиза, эпидемического энцефалита, сифилиса ЦНС, травмы и опухоли мозга, эпилепсии, отравлении окисью углерода, сильных эмоциональных и психических возбуждениях.

Существуют различные способы системы контроля за уровнем глюкозы в крови, использующие наборы реагентов и сложные автоматические анализаторы, например:

Технический способ

* Биохимический анализотор хитачи - 902 (Япония, “Cobas Mira” Инструкция к прибору, М., 2002).

В основе способа лежит энзиматический ультрафиолетовый (УФ) метод для сыворотки крови.

Принцип способа:

- Глюкоза + АТФ → глюкоза - 6-фосфат + АДФ (катализатор -гексокиназа)

- Глюкоза - 6 - фосфат + НАДФ - глюконат - 6-фосфат + НАДФ + Н

Способ включает: приготовление и стабильность регентов:

R₁ – реагент

R₂ - реагент

- Приготовление материала: сыворотка, гепаринизированная

- Проведение калибровки. Контроль сыворотки PRECINORMV, PRECIPATHV.

Недостатки способа

1. Использование дорогостоящего автоматического анализотора.

2. Приготовление реагентов.

3. Приборная регистрация и линейность способа.

Известен также способ контроля уровня глюкозы в крови аппаратом Уан Тач Бэйсик Плюс, 113191 Москва А/я 10, отдел “Лайф СКЭН”, Компания “Джонсон и Джонсон” (095.755.8353).

В основе способа лежит определение уровня глюкозы по изменению цвета теста-полосок при нанесении на них капли крови.

Принцип способа:

- подготовка аппарата к работе,

- взятие капли крови из пальца,

- нанесение капли крови на тест-полоску,

- автоматическое определение в капле крови концентрации глюкозы.

Недостатки способа:

1. Дороговизна аппарата.

2. Постоянная очистка аппарата.

3. Применение тест-полосок.

4. Высокая чувствительность аппарата к изменению температуры и влажности.

5. Ошибки в определении концентрации глюкозы.

В качестве прототипа использован глюкозооксидазный способ определения глюкозы в сыворотки крови (Н.И. Журавлева, В.Н. Титов. Инструкция по применению набора реагентов для определения глюкозы глюкозооксидазным методом. М., 2001. Лаборатория ИКК РКНПК МЗ РФ). В основе способа лежит биохимическая реакция: при окислении β-Д0глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы *ГО) образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы (ПО) перекись водорода окисляет 4-аминоактипирин (4-ААП) в присутствии фенольных соединений в окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемом образце и измеряется фотографически при длине волны 500 нм.

Недостаток способа:

1. Нарушение нативности сыворотки крови.

2. Использование спектрофотометра.

3. Дороговизна осуществления способа.

Техническим решением задачи является:

- Повышение достоверности контроля за содержанием глюкозы в организме человека.

- Экспрессности и чувствительности.

- Упрощение и дешевизна способа.

Поставленная задача достигается тем, что способ диагностики гипергликемии включает определение глюкозы в сыворотке крови посредством нанесения на предметное стекло с лункой сыворотки крови, заселение биотестера - вольфии бескорневой, выдерживание 40-50 мин, затем микроскопируют в проходящем свете и при наличии изменения формы листеца вольфии и обеднении его хлорофиллом определяют количество глюкозы в сыворотке крови, по которой диагностируют гипергликемию.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что биотестеры для тестирования различных патологий и нарушений обменных процессов в организме удобны из-за своей дешевизны, информативности и простоты в использовании. Виды семейства рясковых интенсивно используются как биотестеры различных токсикантов, а вольфия бескорневая - для очистки крови от токсинов [Цаценко Л.В., Малюга Н.Г. Рясковые - биоиндикаторы агроценоза. Краснодар, 2000].

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фиг.1 представлен контроль. Общий вид биотестера - вольфии бескорневой при нормальном уровне глюкозы 4,8±0,9 ммоль/л. Сферическая форма вольфии, интенсивно зеленой окраски с хлорофиллом по всему листецу; на фиг.2 - уровень глюкозы 6,3 ммоль/л. Присутствуют сморщенные формы с хлорофиллом в центре листеца вольфии; фиг.3 - уровень глюкозы 7,0 ммоль/л. Присутствуют единичные сморщенные листецы, лишенные хлорофилла, и обилие листецов шаровидно-овальной формы с хлорофиллом в центре; фиг.4 - уровень глюкозы 7,6 ммоль/л. Присутствует обилие сморщенных листецов, лишенных хлорофилла, и единичные листецы с хлорофиллом в центре; фиг.5 - уровень глюкозы 8,1 ммоль/л. Присутствует обилие сморщенных форм, обедненных хлорофиллом, и единичные формы с хлорофиллом по периферии; фиг.6 - уровень глюкозы 9,1 ммоль/л. Присутствуют сморщенные формы, разорванной формы, лишенные хлорофилла и единичные овально-сморщенные с хлорофиллом в центре; фиг.7 - уровень глюкозы 10,0 ммоль/л. Обилие листецов сморщенной формы с мелкими вкраплениями хлорофилла и листецов без хлорофилла; фиг.8 - уровень глюкозы 11,0 ммоль/л. Преобладают единичные листецы невыдержанной формы с хлорофиллом в центре.

Способ осуществляется следующим образом.

1. У исследуемого пациента берут 1,0 мл крови из вены, центрифигуруют и сыворотку крови наносят на предметное стекло с выемкой.

2. В сыворотку крови расселяют шпателем вольфию бескорневую, которую выдерживают 40-50 мин.

3. Приготовленный препарат микроскопируют в проходящем свете.

4. Наличие гипергликемии осуществляют по двум тест-функциям:

- форме листеца вольфии и присутствию хлорофилла в листеце.

Форма листеца вольфии может представлена следующими показателями: - сморщенная;

- разорванная;

- невыдержанная.

Наличие хлорофилла: - его присутствие в центре листеца;

- его присутствие по периферии,

- его отсутствие в листеце.

Апробация способа подтверждена на 365 больных.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА

Пример 1, фиг.2. Больная У., история болезни (ИБ) №218. Диагноз (Д-з): Ожирение II степени, подозрение на гипергликемию. На фиг.2. представлены сморщенные формы вольфии с хлорофиллом в центре листеца. Технология: из вены больной взято 1,0 мл крови, которая отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. Шпателем произведено расселение биотестера и через 40 мин препарат микроскопирован в проходящем свете. Видно, что преобладают сморщенные формы вольфии с хлорофиллом в центре листеца, одновременно в сыворотке крови (СК) определен уровень глюкозы, который показал ее превышение и составил 6,3 ммоль/л (норма 4,8±0,9 ммоль/л). Гипергликемия подтвердилась.

Пример 2, фиг.3. Больная С., ИБ №35. Д-з: Синдром вегетососудистой дистании с преобладанием тонуса симпатической нервной системы. Подозрение на гипергликемию. На фиг.3. присутствуют единичные сморщенные листецы вольфии, лишенные хлорофилла, и обилие листецов шаровидно-овальной формы с хлорофиллом в центре.

Технология: из вены больной взято 1,0 мл крови, которая отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. Шпателем произведено расселение биотестера и через 45 мин препарат микроскопирован в проходящем свете. Видно, что преобладают сморщенные формы вольфии с хлорофиллом в центре листеца, одновременно в сыворотке крови (СК) определен уровень глюкозы, который показал ее превышение и составил 7,0 ммоль/л (норма 4,8±0,9 ммоль/л). Гипергликемия подтвердилась.

Пример 3, фиг.4. Больной З., ИБ №501. Д-з: Подозрение на сахарный диабет 2 типа (гипергликемия). На фиг.4. отмечено обилие сморщенных листецов вольфии, лишенных хлорофилла, и единичных листецов с хлорофиллом в центре.

Технология: из вены больного взято 1,0 мл крови, которая отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. Шпателем произведено расселение биотестера и через 50 мин препарат микроскопирован в проходящем свете. Видно, что преобладает обилие сморщенных листецов вольфии, лишенных хлорофилла, и единичных листецов с хлорофиллом в центре, одновременно в СК определен уровень глюкозы, который показал ее превышение и составил 7,6 ммоль/л (норма 4,8±0,9 ммоль/л). Гипергликемия подтвердилась.

Пример 4, фиг.5. Больной А., ИБ №345. Д-з: Симпатоадреналовые кризы. Подозрение на гипергликемию. На фиг.5. отмечено обилие сморщенных листецов, обедненных хлорофиллом, и единичных листецов с хлорофиллом по периферии.

Технология: из вены больного взято 1,0 мл крови, которая отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. Шпателем произведено расселение биотестера и через 40 мин препарат микроскопирован в проходящем свете. Видно, что преобладает обилие сморщенных листецов, обедненных хлорофиллом, и единичных листецов с хлорофиллом по периферии, одновременно в СК определен уровень глюкозы, который показал ее превышение и составил 8,1 ммоль/л (норма 4,8±0,9 ммоль/л). Гипергликемия подтвердилась.

Пример 5. фиг.6. Больной Б., ИБ №589. Д-з: Болезнь Иценко-Кушинга. Подозрение на гипергликемию. На фиг.6 присутствуют сморщенные листецы разорванной формы, лишенные хлорофилла, и единичные овально-сморщенные с хлорофиллом в центре.

Технология: из вены больного взято 1,0 мл крови, которая отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. Шпателем произведено расселение биотестера и через 40 мин препарат микроскопирован в проходящем свете. Видно, что присутствуют сморщенные листецы разорванной формы, лишенные хлорофилла, и единичные овально-сморщенные с хлорофиллом в центре, одновременно в СК определен уровень глюкозы, который показал ее превышение и составил 9,1 ммоль/л (норма 4,8±0,9 ммоль/л). Гипергликемия подтвердилась.

Пример 6, фиг.7. Больной М., ИБ №802. Д-з: Акромегалия. Подозрение на гипергликемию. На фиг.7 присутствует обилие листецов сморщенной формы с мелкими вкраплениями хлорофилла и листецов без хлорофилла.

Технология: из вены больного взято 1,0 мл крови, которая отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. Шпателем произведено расселение биотестера и через 50 мин препарат микроскопирован в проходящем свете. Видно, что присутствует обилие листецов сморщенной формы с мелкими вкраплениями хлорофилла и листецов без хлорофилла, одновременно в СК определен уровень глюкозы, который показал ее превышение и составил 10,0 ммоль/л (норма 4,8±0,9 ммоль/л). Гипергликемия подтвердилась.

Пример 7, фиг.8. Больной Т., ИБ №787. Д-з:. Подозрение на сахарный диабет. Mody - диабет. На фиг.8 преобладают единичные листецы невыдержанной формы с хлорофиллом в центре.

Технология: из вены больного взято 1,0 мл крови, которая отцентрифугирована и нанесена на предметное стекло с лункой. Шпателем произведено расселение биотестера и через 45 мин препарат микроскопирован в проходящем свете. Видно, что преобладают единичные листецы невыдержанной формы с хлорофиллом в центре, одновременно в СК определен уровень глюкозы, который показал ее превышение и составил 11,0 ммоль/л (норма 4,8±0,9 ммоль/л). Гипергликемия подтвердилась.

Преимуществами предлагаемого способа являются:

- Упрощение операции подготовки биологического материала для исследования.

- Интегральная характеристика плазмы крови по нескольким тест-функциям биотестера.

- Отсутствие применения сложных химических реактивов и технических устройств.

- Простота в выполнении и возможность экспресс-диагностики.

- Широкая тиражируемость.

- Воспроизводимость результатов.

Изобретение относится к области медицины. Способ определения гипергликемии основан на качественной оценке содержания глюкозы в сыворотке крови по тест-функции биотестера вольфии бескорневой. При изменении формы листеца вольфии и обеднении его хлорофиллом диагностируют гипергликемию. Способ обеспечивает простоту и быстроту определения, дешев. 8 ил.

Способ диагностики гипергликемии путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови наносят на предметное стекло с лункой, заселяют вольфией бескорневой, выдерживают 40-50 мин, затем микроскопируют в проходящем свете и при наличии изменения формы листеца вольфии и обеднении его хлорофиллом диагностируют гипергликемию.