СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, биологии, к патофизиологии и лабораторной диагностике.

Синдром гиперпролактинемии обусловлен патологическими состояниями (заболеваниями, для которых характерно выделение молока из молочных желез у женщин и мужчин).

Причины, приводящие к гиперсекреции пролактина, разнообразны в зависимости: от механизмов нарушения функции гипофиза, гипоталамуса (опухоли), заболеваний гипоталамо-гипофизарной системы (инфекции, травмы мозга), опухолей кишечника, легких, болезней щитовидной железы (гипотиреоз), болезней печени, почек, (цирроз), при наличии синдрома поликистозных яичников, от приема фармпрепаратов (нейролептики, антидепрессанты, блокаторы кальциевых каналов, эстрогены, контрацептивы, опиаты, кокаин), саркоидоз. Изменение концентрации гормона пролактина в сыворотке крови - главный этап лабораторной диагностики. Для диагностики гиперпролактинемии используют биохимические, химические, радиоиммунологические, иммуноферментные, иммунометрические способы (А. Г. Резников. Методы определения гормонов: Справочное пособие. - Киев., Наукова Думка. ) Наиболее распространенным способом является радиоиммунологический способ (РИА) определения пролактина, основанный на законе действия масс, в соответствии с которым определяемое вещество будет конкурировать со своим меченым аналогом (антиподом) за ограниченное число связывающих мест антитела до достижения химического равновесия всех компонентов реакционной смеси (У. Г. Вуд, Г. Соколовский. Теория и практика радиоиммунологического анализа. Руководство для персонала лабораторных служб. Глобус. Вена., 1981. А.Г. Таранов. Лабораторная диагностика: иммуноферментный и радиоммунологические методы анализа. Новосибирск., 1995).

Основные этапы определения пролактина (РИА)
1. Приготовление стандартных разведений пролактина для построения калибровочной кривой (последовательное разведение основного раствора стандарта пролактина фосфатным буферным раствором).

2. В тест пробирки вносят 0,1 мл стандартного раствора или исследуемой плазмы, 0,1 мл буферного раствора, 0,1 мл раствора меченого гормона и 0,1 мл антисыворотки к пролактину. Для контроля связывающей способности готовят пулевые пробы и пробы на общую радиоактивность.

3. Инкубация при комнатной температуре 18-20^o.

4. Добавление иммуносорбента, перемешивание во вращающемся штативе 5 часов при комнатной температуре.

5. Центрифугирование 10 минут при 2500g.

6. Суперпатант отбирают и промывают фосфатным буферным раствором.

7. Центрифугирование и удаление суперпатанта.

8. Радиоактивность осадков и пробы на общую радиоактивность измеряют в сцинтилляционном гамма-счетчике.

Недостатки способа РИА
1. Исследования должны проводиться только в специализированной лаборатории со специально обученным персоналом.

2. Применение специфических веществ, меченных изотопом ¹²⁵J, что требует соблюдения определенных норм радиационной безопасности.

3. Невозможность длительного хранения наборов (2 месяца), что затрудняет, а иногда и полностью исключает экспресс-диагностику.

4. Проблемы в обработке и хранении больших объемов радиоактивного отброса проб.

Нами в качестве прототипа использован иммунометрический способ, основанный на усиленной люминесценции (набор "Амерлайт", Пролактин-30. Великобритания. Дистрибьютор Америкад, Россия, Москва, 121552, ул. 3-я Черенковская, 15а)
Определение пролактина производят на анализаторе "Амерлайт". Это автономный, управляемый микрокомпьютерный прибор, предназначенный для измерения люминесцентного свечения и обработки полученных данных при проведении твердофазного иммуноферментного анализа.

Основные этапы определения
1. В полиэстероловые лунки, на которые нанесены мышиные моноклональные антитела против пролактина, последовательно вносят стандарты, контроли и образцы сыворотки крови (СК) исследуемого лица. Стандарты содержат пролактин с различной концентрацией, контроли - пролактин в низких, средних и высоких значениях, образцы СК-человека.

2. Дозированно диспенсером вносят коньюгат (мышиные моноклональные тела к пролактину, меченные пероксидазой и хреном).

3. Инкубируют и встряхивают лунки с образцами, контролями и стандартами в течение 30 минут при T=37^oC.

4. Несвязавшийся материал удаляют при помощи промывающего устройства.

5. При помощи диспенсора вносят сигнальный реагент (солилюминол и перкислота, замещенный фенол).

6. После внесения сигнального реагента измеряют световой люминесцентный сигнал при помощи анализатора-микрокомпьютера.

7. Затем компьютер распечатывает результаты исследований (калибровочная кривая, концентрация пролактина в исследуемых образцах).

Недостатки прототипа
1. Сложность приготовления стандартов из пролактина и контроля. Трудоемкость способа.

2. Использование системы закрытого типа фирмы "Амерлайт".

3. Наличие дорогостоящего оборудования и реактивов, утрата аналитической значимости (при использовании отечественных тест-систем).

4. Нерентабельное проведение единичных исследований.

5. Общая стоимость оборудования, реактивов для СНГ - свыше 40000 фунтов стерлингов.

Задачи предлагаемого изобретения.

1. Повышение достоверности показателей контроля за стимуляцией пролактина.

2. Повышение информативности.

3. Упрощение способа, снижение себестоимости.

4. Экспресс-диагностика активации пролактинсекретирующих клеток (гипофиз, гипоталамус, эндометрий, плацента, эпителий тонкой кишки, клетки легких, печени, почек).

Задачи.

Сущность изобретения заключается в том, что для определения гиперпролактинемии сыворотку крови наносят на предметное стекло, накрывают покровным, сушат при температуре 37-38^oC на протяжении 1,5-2 час, выдерживают на открытом воздухе 0,5-1 час, затем исследуют в проходящем свете (микроскопируют в биологическом микроскопе) и при наличии в препарате кристаллов в форме ветвящихся ламелей и/или сплошной сетки из ветвящихся ламелей диагносцируют гиперпролактинемию.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Для забора берут периферическую кровь из пальца.

2. Капилляром Панченкова набирают кровь 0,06-0,1 мл.

3. Полученный объем центрифугируют для получения сыворотки.

4. Сыворотку в виде капель объемом 0,01-0,2 мл каждая наносят тарированной пипеткой на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

5. Высушивают в термостате при T=37-38^oC на протяжении 1,5-2 час, выдерживают на открытом воздухе 0,5-1 час.

6. Под микроскопом в проходящем свете изучают картину кристаллизации и при наличии в препарате кристаллов в виде ветвящихся ламелей и/или сплошной сетки из ветвящихся ламелей диагносцируют гиперпролактинемию.

Нами предварительно были смоделированы эталоны кристаллограмм (КГ), приготовленные из СК здорового человека, обогащенной пролактином ранее известной концентрации, содержавшимся в эталонных ампулах, взятых из набора "Амерлайт", "Пролактин-30".

Эталонные КГ сравнивали с КГ сыворотки крови подозреваемых в заболевании больных.

На фиг. 1а-в представлены КГ, полученные из матричных эталонных стандартных наборов (ампулы) с высокой концентрацией пролактина (набор "Амерлайт", "Пролактин-30", Великобритания), соответственно - 758, 1890, 4456 м МЕ/л; нормальная концентрация пролактина равнялась 343⁺ 1,6 м МЕ/л.

КГ были представлены кристаллами в виде ступенчатых агрегатов - мелкие пластинчатые призматические (фиг. 1а, концентрация пролактина 758 м МЕ/л), пластинчатые призматические средней величины (фиг. 1б, концентрация пролактина 1890 м МЕ/л), крупные, в виде плато, пластинчатые призматические агрегаты средней величины (фиг. 1в, концентрация пролактина 4456 м МЕ/л).

Варианты КГ, приготовленные из стандартных наборов, приведены на фиг. 9.

На фиг. 2 а-в представлены эталонные КГ, приготовленные из СК здорового человека, обогащенной пролактином с заранее известной высокой концентрацией, взятого из эталонных ампул набора "Амерлайт", "Пролактин-30".

КГ были представлены кристаллами в виде ветвящихся ламелей (главный морфотип) и призматических, субпараллельно расположенных, находившихся по краю препарата, (дополнительный морфотип) фиг. 2 а-в; концентрация пролактина в образцах соответственно равнялась - 758, 1890 и 4456 м МЕ/л.

Фиг. 2а - призматические, субпараллельно расположенные кристаллы (по краю препарата) и ветвящиеся ламели (по центру препарата), концентрация пролактина - 758 м МЕ/л;
Фиг. 2б - зачатки призматических кристаллов у 4 края препарата, ветвящиеся ламели в виде сетки по центру препарата, концентрация пролактина 1890 м МЕ/л.

Фиг. 2в - сплошная сетка из ветвящихся ламелей, концентрация пролактина - 4456 м МЕ/л.

Таким образом, повышение концентрации пролактина приводило к формированию сплошной сетки, выполнявшей препарат. Варианты КГ сыворотки крови здорового человека, обогащенного пролактином, приведены на фиг. 10.

Схематическое изображение главного морофотипа, представленного ветвящимися ламелями и сплошной сеткой из ветвящихся ламелей, показано на фиг. 3, ламелярная структура блоксополимерных систем в смектической мезофазе (Джейл Ф.Х. Полимерные монокристаллы. Л., 1968).

Апробация способа подтверждена на 1800 больных.

Примеры.

Пример 1, фиг. 4. Больная И., 31 г., история болезни N 2129. Диагноз: гипотиреоз, нарушение мензес, бесплодие. Подозрение на избыточный выброс пролактина. На 2-ой день поступления в клинику, из пальца капилляром Панченкова взята кровь 0,06 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл нанесены на предметное стекло (4 капли), каждая накрыта покровным стеклом. Препарат поместили в термостат и подвергли сушке на протяжении 1,5 час при T= +38^oC, затем выдержали его на открытом воздухе - 0,5 час и исследовали в проходящем свете (биологический микроскоп). На фиг. 4 видны ветвящиеся ламели в центре препарата, призматические субпараллельно расположенные кристаллы, находящиеся по краю образца. Одновременно определили уровень пролактина в СК больной иммунометрическим способом. Пролактин оказался высоким - 789 м МЕ/л, при норме 343 м МЕ/л. Диагностика гиперпролактинемии подтверждена.

Пример 2, фиг. 5. Больная К., 28 лет, история болезни N 2139. Диагноз: поликистоз яичников, бесплодие, дисменорея. Подозрение на гиперпролактинемию.

В 1-й день поступления в клинику из пальца больной капилляром Панченкова взята кровь - 0,08 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,02 мл каждая (4) нанесены на предметное стекло, каждая покрыта покровным стеклом. Пробу поместили в термостат на 2 час при T=37^oC, затем выдержали на открытом воздухе 1 час, исследовали в проходящем свете. Обнаружены ветвящиеся ламели средней величины и крупные (в центре препарата) и удлиненные призматические субпараллельно ориентирующие (по краю препарата), переходящие в центре препарата в крупные ветвящиеся ламели, фиг. 5. Одновременно иммунометрическим способом определен уровень пролактина (10011 м МЕ/л, при норме 343 м МЕ/л). Диагноз предполагаемой гиперпролактинемии подтвержден.

Пример 3, фиг. 6. Больная Л., 25 лет. История болезни N 14915. Диагноз: галакторея, подозрение на микроаденому гипофиза, на выброс пролактина.

При поступлении больной из пальца капилляром Панченкова взята кровь - 0,1 мл; отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,02 мл каждая (4) нанесены на предметное стекло, каждая накрыта покровным. Пробу поместили в термостат при R= +38^oC, затем выдержали на открытом воздухе 1 час и исследовали в проходящем свете. Найдена сплошная сетка из ветвящихся ламелей и единичные призматические субпараллельно ориентированные кристаллы. Одномоментно иммунометрическим способом определен высокий уровень пролактина - 2130 м МЕ/л, норма 343 м МЕ/л. Предполагаемый диагноз гиперпролактинемии подтвердился. Компьютерным исследованием головного мозга у этой же больной обнаружена микроаденома гипофиза.

Пример 4, фиг. 7. Больная 3., 39 лет, история болезни N 2014. Диагноз: эндометриоз матки, склерокистоз яичников, дисменоррея, подозрение на гиперпролактинемию.

При поступлении в клинику больной из пальца капилляром Панченкова взята кровь - 0,06 мл, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,01 мл каждая (5) нанесены на предметное стекло, каждая накрыта предметным стеклом. Препарат поместили в термостат на 1,5 час. При T=37^oC, затем выдержали на открытом воздухе и исследовали в проходящем свете. Найдена сетка, выполненная из крупных ламелей. Одномоментно определили уровень пролактина в исследуемой СК, он оказался равны 4389 м МЕ/л. Предполагаемая гиперпролактинемия подтвердилась.

Пример 5, фиг. 8. Больная Н., 36 лет, история болезни N 2241. Диагноз: аутоиммунный тиреоидит, гипотиреоз, подозрение на гиперпролактемию.

Кровь из пальца в 1-й день пребывания в стационаре капилляром Панченкова - 0,08 мл взята, отцентрифугирована. Капли СК объемом 0,02 мл каждая нанесены на предметное стекло (4), каждая покрыта покровным стеклом. Пробу поместили в термостат на 2 час при T=+37^oC, затем выдержали на открытом воздухе 1 час и исследовали в проходящем свете. Найдена сплошная сетка из ветвящихся ламелий. Фиг. 8. Одномоментно в СК определили высокий уровень пролактина, который оказался равен 3489 м МЕ/л, при норме 343. Предполагаемая гиперпролактинемия подтвердилась.

Преимущество предлагаемого способа:
1. Упрощение операции подготовки биологического материала для исследования.

2. Отсутствие применения сложного дорогостоящего компьютерного устройства.

3. Отсутствие приготовления реактивов, стандартов.

4. Экономическая выгода.

Предлагаемый способ апробирован в клинических условиях (1800 наблюдений). Впервые выделены образцы, приготовленные из СК подозреваемых больных на наличие синдрома гиперпролактинемии. Характерным явилось наличие специфических кристаллов - ветвящихся ламелей и/или сплошной сетки из ветвящихся ламелей, что может быть использовано как скрининг-тест для диагностики гиперпролактинемии.

Медико-социальный эффект.

Применение способа позволяет диагностировать на ранних стадиях наличие синдрома гиперпролактинемии, значительно снизить трудозатраты, проводить экспресс-диагностику.

Способ может быть использован в медицине, а именно для экспресс-диагностики. Кристаллизуют сыворотку крови. При наличии в препарате кристаллов в форме ветвящихся ламелей и/или сплошной сетки из ветвящихся ламелей диагносцируют гиперпролактинемию. Способ позволяет упростить исследование и снизить себестоимость диагностики. 10 ил.

Способ диагностики гиперпролактинемии, отличающийся тем, что кристаллизуют сыворотку крови и при условии наличия кристаллов в форме ветвящихся ламелей и/или сплошной сетки из ветвящихся ламелей определяют гиперпролактинемию.