МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ГРАНУЛОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ДНК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР Российский патент 2004 года по МПК C07K14/535 C12N15/27 C12N15/70 C12P21/00 

Описание патента на изобретение RU2232772C2

Область техники

Настоящее изобретение относится к модифицированному колониестимулирующему фактору гранулоцитов человека (hG-CSF), гену, кодирующему указанный пептид, вектору, содержащему указанный ген, микроорганизму, трансформированному указанным вектором, и способу получения модифицированного hG-CSF с использованием указанного микроорганизма.

Предпосылки изобретения

Термин "колониестимулирующий фактор" (CSF) включает колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF) и колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), продуцируемые Т-клетками, макрофагами, фибробластами и эндотелиальными клетками. GM-CSF стимулирует стволовые клетки гранулоцитов или макрофагов, вызывая их дифференцировку и пролиферацию колоний гранулоцитов или макрофагов. M-CSF и G-CSF индуцируют соответственно образование колоний макрофагов и гранулоцитов. In vivo G-CSF вызывает дифференцировку лейкоцитов костного мозга и усиливает функцию зрелых гранулоцитов и, следовательно, определяет их клиническую значимость при лечении лейкоза.

G-CSF человека (hG-CSF) представляет собой белок, состоящий из 174 или 177 аминокислот, причем разновидность, включающая 174 аминокислоты, обладает более высокой активностью, стимулирующей нейтрофилы (Morishita, К. et al., J. Biol. Chem., 262, 15208-15213 (1987)). Аминокислотная последовательность hG-CSF, состоящая из 174 аминокислот, показана на фиг.1. Были выполнены многочисленные исследования по массовому продуцированию hG-CSF при помощи гена, кодирующего указанный hG-CSF.

Например, компанией Chugai Pharmaceuticals Co., Ltd (Япония) была представлена аминокислотная последовательность hG-CSF и кодирующий ее ген (корейская патентная публикация №91-5624 и 92-2312) и описан способ получения белков, обладающих активностью hG-CSF, методом генетической рекомбинации (патенты Кореи №47178, 53723 и 57582). В соответствии с описанным способом в клетке млекопитающего продуцируют гликозилированный hG-CSF, используя геномную ДНК или кДНК, содержащую полинуклеотид, кодирующий hG-CSF. Гликозилированный hG-CSF имеет цепь О-гликозидного сахара, но известно, что указанная цепь не нужна для обеспечения активности hG-CSF (Lawrence, M. et al., Science, 232, 61 (1986). Кроме того, хорошо известно, что продуцирование гликозилированного hG-CSF с использованием клеток млекопитающего требует использования дорогостоящих веществ и устройств, поэтому такой способ является неприемлемым с экономической точки зрения.

Были предприняты попытки продуцировать негликозилированный hG-CSF, используя микроорганизмы, например Е. coli. В результате выполнения таких исследований получен hG-CSF, содержащий 175 или 178 аминокислот с остатком метионина, присоединенным у N-конца, благодаря использованию в микроорганизме инициирующего кодона ATG. Однако дополнительный остаток метионина вызывает нежелательные иммунные реакции в организме человека при введении рекомбинантного hG-CSF (европейская патентная публикация № 256843). Кроме того, большая часть метионинсодержащего hG-CSF, продуцированного в Е. coli, осаждается в клетках в виде нерастворимых телец включения, которые необходимо превратить в активную форму путем повторной укладки цепи при значительной потере выхода продукта. В этой связи следует отметить, что четыре из пяти остатков Cys, присутствующих в hG-CSF дикого типа, участвуют в образовании дисульфидных связей, в то время как последний остаток вызывает агрегацию продукта hG-CSF в процессе повторной укладки цепи, что уменьшает выход продукта.

Чтобы решить проблемы, связанные с продуцированием чужеродного белка в микробной клетке, недавно были предприняты попытки создать способ на основе эффективной секреции целевого белка через мембрану микробной клетки во внеклеточный домен.

Например, при осуществлении способа с использованием сигнального пептида требуемый белок экспрессирован в форме слитого белка, в котором сигнальный пептид присоединен к N-концу белка. При прохождении слитого белка через клеточную мембрану сигнальный пептид удаляется ферментом и требуемый белок секретируется в зрелой форме. Способ секреторного продуцирования является эффективным, так как продуцированная аминокислотная последовательность обычно идентична последовательности дикого типа. Однако выход продукта при осуществлении способа секреторного продуцирования часто оказывается довольно низким из-за недостаточно эффективного переноса через мембрану и последующей очистки. Это согласуется с известными данными о том, что выход белка млекопитающего, продуцированного секреторным способом в прокариотах, является очень низким, поэтому ни один из микробных способов не был признан пригодным для эффективной экспрессии и секреции растворимого hG-CSF, не имеющего дополнительного остатка метионина, присоединенного к N-концу.

Авторы настоящего изобретения ранее сообщали об использовании нового секреторного сигнального пептида, полученного путем модификации сигнального пептида терморезистентного энтеротоксина II Е. coli (открытая корейская патентная публикация № 2000-19788), при продуцировании hG-CSF. В частности, был получен экспрессирующий вектор, содержащий ген hG-CSF, присоединенный к 3'-концу модифицированного сигнального пептида терморезистентного энтеротоксина II Е. coli, и экспрессирован биологически активный, зрелый hG-CSF с использованием Е. coii, трансформированного вышеуказанным экспрессирующим вектором. Однако большая часть экспрессированного hG-CSF накапливается в цитоплазме, а не в периплазме.

Авторы настоящего изобретения предприняли попытку создать эффективный секреторный способ получения hG-CSF в микроорганизме и обнаружили, что модифицированный hG-CSF, полученный путем замены по крайней мере одного аминокислотного остатка, в частности 17-го остатка цистеина, hG-CSF дикого типа другой аминокислотой, позволяет сохранить биологическую активность белка дикого типа, при этом в микроорганизме можно эффективно экспрессировать и секретировать модифицированный hG-CSF, не имеющий остатка метионина у N-конца, используя соответствующий секреторный сигнальный пептид.

Краткое изложение существа изобретения

Целью настоящего изобретения является получение модифицированного колониестимулирующего фактора гранулоцитов человека (hG-CSF), который можно эффективно продуцировать при помощи микроорганизма.

Другой целью настоящего изобретения является получение гена, кодирующего указанный пептид, и вектора, содержащего указанный ген,

Другой целью настоящего изобретения является получение микроорганизма, трансформированного указанным вектором.

Еще одной целью настоящего изобретения является представление способа получения hG-CSF без остатка метионина, присоединенного к аминоконцу, с использованием указанного микроорганизма.

Одним объектом настоящего изобретения является модифицированный hG-CSF, отличающийся тем, что по крайней мере одна из 1-ой, 2-ой, 3-ей и 17-ой аминокислот hG-CSF дикого типа заменена другой аминокислотой.

Краткое описание чертежей

Вышеуказанные и другие цели и особенности настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания изобретения со ссылкой на прилагаемые чертежи, где:

На фиг.1 показаны нуклеотидная и аминокислотная последовательности колониестимулирующего фактора гранулоцитов человека дикого типа, состоящие из 174 аминокислотных остатков (SEQ ID NOS: 1 и 2).

На фиг.2 показан способ создания вектора pT-CSF.

На фиг.3 показан способ создания вектора pT14S1SG.

На фиг.4 показан способ создания вектора pT14SS1SG.

На фиг.5 показан способ создания вектора pT140SSG-4T22Q.

На фиг.6 показан способ создания вектора pT14SS1S17SEG.

На фиг.7 показан способ создания вектора pTO1SG.

На фиг.8 показан способ создания вектора pBADG.

На фиг.9 показан способ создания вектора pBAD2M3VG.

На фиг.10а и 10b приведены результаты анализов методом вестерн-блоттинга, которые подтверждают экспрессию hG-CSF и по-разному модифицированных hG-CSF в рекомбинантных линиях клеток, и указаны молекулярные массы экспрессированных белков.

На фиг.11 показана клеточная активность hG-CSF и модифицированного hG-CSF, продуцированного в рекомбинантных линиях клеток.

Подробное описание изобретения

Модифицированные hG-CSF по настоящему изобретению получают, заменяя одну или несколько аминокислот hG-CSF дикого типа (SEQ ID NO: 2), предпочтительно 1-ую, 2-ую, 3-ю и 17-ю аминокислоты другими аминокислотами. Более предпочтительные факторы получают, заменяя 17-ю аминокислоту hG-CSF аминокислотой, которая не заряжена при нейтральном рН. Конкретные примеры предпочтительных модифицированных hG-CSF имеют аминокислотную последовательность hG-CSF дикого типа за исключением того, что:

(a) 1-ая аминокислота является Ser;

(b) 1-ая аминокислота является Ser и 17-ая аминокислота является X;

(c) 2-ая аминокислота является Met и 3-я аминокислота является Val;

(d) 2-ая аминокислота является Met, 3-я аминокислота является Val и 17-ая аминокислота является X; или

(f) 17-ая аминокислота является X,

где Х означает аминокислоту, которая не заряжена при нейтральном рН, предпочтительно Ser, Thr, Ala или Gly, более предпочтительно Ser.

Четыре из пяти остатков Суs в hG-CSF участвуют в образовании дисульфидных связей, в то время как 17-ый остаток Cys остается несвязанным в естественном состоянии. Когда в рекомбинантных клетках экспрессировано большое количество hG-CSF, 17-ый остаток Cys принимает участие в образовании межмолекулярных дисульфидных связей, вызывая накопление агломерированного hG-CSF в цитоплазме. Однако в модифицированном hG-CSF по настоящему изобретению, имеющем в положении 17 не Суs, а другой аминокислотный остаток, такая проблема отсутствует, поэтому его можно эффективно продуцировать секреторным способом, используя должным образом трансформированный микроорганизм.

Модифицированный hG-CSF по настоящему изобретению может быть кодирован геном, содержащим нуклеотидную последовательность, выведенную из аминокислотной последовательности модифицированного hG-CSF в соответствии с генетическим кодом. Известно, что может быть несколько разных кодонов, кодирующих специфическую аминокислоту, вследствие вырожденности кодона, поэтому в объем настоящего изобретения входят все нуклеотидные последовательности, выведенные из аминокислотной последовательности модифицированного hG-CSF. Предпочтительно последовательность гена модифицированного hG-CSF включает один или несколько предпочтительных кодонов Е. coli.

Полученный таким образом ген можно вставить в обычный вектор, чтобы получить экспрессирующий вектор, который, в свою очередь, можно ввести в приемлемого хозяина, например Е. coli. Экспрессирующий вектор может дополнительно содержать сигнальный пептид. Типичными сигнальными пептидами являются сигнальный пептид терморезистентного энтеротоксина II Е. coli (SEQ ID NO: 53), модифицированный сигнальный пептид терморезистентного энтеротоксина II Е. coli (SEQ ID NO: 54), сигнальный пептид бета-лактамазы (SEQ ID NO: 24), сигнальный пептид Gene III (SEQ ID NO: 42) или их модифицированный пептид, но указанные пептиды не ограничивают число сигнальных пептидов, пригодных для использования в настоящем изобретении. Промотор, используемый для получения экспрессирующего вектора по настоящему изобретению, относится к типу, способному экспрессировать гетерологичный белок в микроорганизме-хозяине. В частности, lac, Tac и арабинозный промотор являются предпочтительными при экспрессии гетерологичного белка в Е. coli.

Экспрессирующими векторами по настоящему изобретению, использующимися в качестве примера, являются pT14SS1SG, PT14SS1S17SEG, pTO1SG, pTO1S17SG, pTО17SG, pTО17TG, pTО17AG, pTО17GG, pBAD2M3VG, pBAD17SG и pBAD2M3V17SG.

Экспрессирующие векторы по настоящему изобретению можно вводить в такие микроорганизмы, как, например, Е. coli BL21(DE3) (Novagen), Е. coli XL-1 синий (Novagen), путем обычной трансформации (Sambrook et al., см. выше), получая при этом трансформанты Е. coli BL21(DE3)/DT14SS1SG (НМ 10310), Е.coli BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG (HM 10311), E. coli BL21(DE3)/ pTO1SG (HM 10409), E. coli BL21(DE3)/pTО1S17SG (HM 10410), E. coli BL21(DE3)/pTО17SG (HM 10411), E. coli BL21(DE3)/pTО17TG (HM 10413), E. coli BL21 (DE3)/pTО17AG (HM 10414), E. coli BL21(DE3)/pTO17GG (HM 10415), E. coli BL21 (DE3)/ pBAD2M3VG (HM 10510), E. coli BL21 (DE3)/ pBAD17SG (HM 10511) и E. coli BL21 (DE3)/ pBAD2M3V17SG (HM 10512).

Среди трансформированных микроорганизмов предпочтительными являются трансформанты E. coli BL21(DE3)/ pT14SS1S17SEG (HM 10311), E. coli BL21(DE3)/ pTО1S17SG (HM 10410), E. coli BL21(DE3)/ pTО17SG (HM 10411) и E. coli BL21 (DE3)/ pBAD2M3VG (HM 10510), которые были задепонированы в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) (адрес: Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemungu, Seoul 120-749, Republic of Korea) 24 марта 1999 г. под номерами доступа КССМ-10154, КССМ-10151, КССМ-10152 и КССМ-10153 в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании регистрации микроорганизмов при проведении патентной экспертизы.

Модифицированный белок hG-CSF по настоящему изобретению можно получить, культивируя трансформированные микроорганизмы с целью экспрессии гена, кодирующего модифицированный белок hG-CSF, секреции модифицированного белка hG-CSF в периплазму и выделения модифицированного белка hG-CSF из периплазмы.

Трансформированный микроорганизм можно культивировать в соответствии с известным способом (Sambrook et al., см. выше). Культуру микроорганизмов центрифугируют или фильтруют, собирая таким образом микроорганизм, секретирующий модифицированный белок hG-CSF. Трансформированный микроорганизм можно разрушить обычным способом (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1989)) с получением раствора периплазмы. Например, микроорганизм можно разрушить в гипотоническом растворе, например дистиллированной воде, при помощи осмотического шока. Модифицированный hG-CSF может быть выделен из раствора периплазмы обычным способом (Sambrook et al., см. выше), например, при помощи ионообменной хроматографии, гель-фильтрационной хроматографии на колонках или иммуногель-хроматографии на колонках. Например, hG-CSF можно очистить, последовательно выполняя хроматографию на колонках с СМ-сефарозой и хроматографию на колонках с фенилсефарозой.

Модифицированный белок hG-CSF, полученный по настоящему изобретению, не имеет остатка метионина у N-конца и обладает биологической активностью, которая равна или выше активности hG-CSF дикого типа. Поэтому указанный белок можно использовать в разных областях применения.

Нижеследующие примеры приведены для более полной иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают его объем.

Пример 1. Получение гена, кодирующего hG-CSFГен кДНК, кодирующий hG-CSF, получают, выполняя полимеразную цепную реакцию (PCR) с использованием матрицы hG-CSF (R&D system, США). Использованные затравки описаны в патенте США NO: 4810643.

Чтобы получить ген кДНК, кодирующий зрелый hG-CSF, вектор pUC19-G-CSF (Biolabs, США) подвергают PCR, используя затравки SEQ ID NOS: 3 и 4. Затравка SEQ ID NO: 3 предназначена для получения сайта рестрикции NdeI (5'-САТАТС-3') вверху от кодона первой аминокислоты (треонин) зрелого hG-CSF, и затравка SEQ ID NO: 4 предназначена для получения сайта рестрикции BamHI (5'-GGATCC-3') внизу от кодона терминации.

Амплифицированный ген hG-CSF расщепляют при помощи NdeI и BamHI и получают ген, кодирующий зрелый hG-CSF. Ген hG-CSF вводят на участке NdeI/BamHI вектора pET14b (Novagen, США), получая при этом вектор pT-CSF.

На фиг.2 показан вышеописанный способ создания вектора pT-CSF.

Пример 2. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий сигнальный пептид энтеротоксина Е. coli и модифицированный hG-CSF

(Стадия 1) Клонирование гена сигнального пептида энтеротоксина II Е. coli

Чтобы получить ген сигнального пептида энтеротоксина II Е. coli, создают пару комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NOS: 5 и 6, на основе нуклеотидной последовательности сигнального пептида энтеротоксина II Е. coli, которые синтезируют в синтезаторе ДНК (модель 380В, Applied Biosystem, США).

Вышеуказанные олигонуклеотиды предназначены для получения сайта рестрикции BspHI (сайты, комплементарные сайтам рестрикции NcoI) вверху от инициирующего кодона энтеротоксина II Е. coli и сайта рестрикции MluI, вводимого путем молчащей замены у другого конца.

Оба олигонуклеотида отжигают при 95°С, получая при этом фрагменты ДНК с "тупыми" концами, имеющие нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид энтеротоксина II Е. coli (ген STII).

Ген STII вводят на сайте SmaI вектора pUC19 (Biolabs, США) и получают вектор pUC19ST.

(Стадия 2) Получение гена, кодирующего STII/hG-CSF

Чтобы получить ген, кодирующий STII/hG-CSF, вектор рТ-CSF, полученный в препаративном примере 1, подвергают PCR, используя затравки SEQ ID NOS: 7 и 8. Затравка SEQ ID NO: 7 предназначена для замены первого кодона hG-CSF кодоном Ser, и затравка SEQ ID NO: 8 предназначена для получения сайта рестрикции BamHI (5'-GGATCC-3') внизу от кодона терминации.

Амплифицированные фрагменты ДНК расщепляют при помощи MluI и BamHI и затем вводят на участке MluI/BamHI вектора pUC19ST, полученного на стадии 1, и получают вектор PUC19S1SG. Созданный таким образом вектор pUC19S1SG содержит ген, кодирующий STII/hG-CSF (именуемый геном STII-hG-CSF).

Вектор pUC19S1SG расщепляют при помощи BspHI и BamHI, получая при этом фрагмент ДНК (522 п.о.). Фрагмент ДНК вводят на участке NcoI/ BamHI вектора pET14b (Novagen, США), получая при этом вектор pT14S1SG.

На фиг.3 показан вышеописанный способ создания вектора PT14S1SG.

(Стадия 3) Присоединение последовательности Шайна-Дальгарно энтеротоксина II Е. coli к гену STII-hG-CSF

Вектор pT14S1SG, полученный на стадии 2, подвергают PCR, используя затравки SEQ ID NOS: 9 и 10. Затравка SEQ ID NO: 9 предназначена для получения последовательности Шайна-Дальгарно (именуемая последовательностью STII SD) энтеротоксина II Е. coli и сайта рестрикции XbaI, и затравка SEQ ID NO: 10 предназначена для получения сайта рестрикции BamHI внизу от кодона терминации зрелого hG-CSF с целью создания фрагмента ДНК (STII SD-STII-hCSF), содержащего ген STII SD и STII-hG-CSF.

Фрагмент STII SD-STII-hG-CSF расщепляют при помощи XbaI и BamHI и затем вводят на участке XbaI/BamHI вектора pET14b (Novagen, США), получая вектор pT14SS1SG.

На фиг.4 показан вышеописанный способ создания вектора PT14SS1SG.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pT14SS1SG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli HM 10310.

(Стадия 4) Создание вектора, содержащего ген, кодирующий слитый белок STII/hG-CSF

Первый кодон модифицированного гена hG-CSF плазмиды pT14SS1SSG, полученной на стадии 3, заменяют на Thr путем сайт-направленного мутагенеза (Papworth, С. et al., Strategies, 9, 3 (1996)), осуществляя PCR в отношении плазмиды с использованием смысловой затравки (SEQ ID NO: 12), содержащей модифицированную нуклеотидную последовательность, комплементарной антисмысловой затравки (SEQ ID NO: 13) и pfu (Stratagene, США).

Выделяют амплифицированный фрагмент ДНК и добавляют к нему рестрикционный фермент Dpnl, чтобы удалить нетрансформированные плазмиды.

E. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и таким образом получают плазмиду pT14SSG, которая содержит ген, имеющий Thr вместо первой аминокислоты hG-CSF (SEQ ID NO: 11).

E. coli BL21(DS3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pT14SSG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli HM 10301.

(Стадия 5) Создание вектора, содержащего ген, кодирующий модифицированный STII/hG-CSF

Вектор pT14SSG, полученный на стадии 4, подвергают PCR, используя комплементарные затравки SEQ ID NOS: 15 и 16, которые предназначены для замены 4-го кодона STII кодоном Thr в соответствии со способом, описанным на стадии 4, и получают модифицированную плазмиду.

E. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и получают таким образом плазмиду, которая содержит ген, имеющий Thr вместо 4-ой аминокислоты STII (SEQ ID NO: 14).

Полученную таким образом плазмиду расщепляют при помощи XbaI и MluI и вводят на участке XbaI/MluI вектора pT14SSG, полученного на стадии 4, получая вектор pT14SSG-4T.

(Стадия 6) Создание вектора, содержащего ген, кодирующий модифицированный STII/hG-CSF

Вектор pT14SSG-4T, полученный на стадии 5, подвергают PCR, используя комплементарные затравки SEQ ID NOS: 18 и 19, которые предназначены для замены 22-го кодона STII кодоном Gln в соответствии со способом, описанным на стадии 4, и получают модифицированную плазмиду.

Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и получают таким образом плазмиду pT14SSG-4T22Q, которая содержит ген, имеющий Gln вместо 22-ой аминокислоты STII (SEQ ID NO: 17).

(Стадия 7) Создание вектора, содержащего модифицированную последовательность STII SD и гена, кодирующего модифицированный STII/hG-CSF

Вектор pT14SSG-4T22Q, полученный на стадии 6, подвергают PCR, используя комплементарные затравки SEQ ID NOS: 20 и 21, в соответствии со способом, описанным на стадии 4, и получают вектор рТ14OSSG-4T22Q, имеющий шесть нуклеотидных последовательностей между последовательностью STII SD (GAGG) и инициирующим кодоном STII (модифицированная последовательность STII SD SEQ ID NO: 71).

На фиг.5 показан вышеописанный способ создания вектора pT14OSSG-4T22Q.

Е. coli BL21(DE3) трансформируют вектором рТ14OSSG-4T22Q и получают трансформант, обозначаемый как Е. coli HM 10302.

Пример 3. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий модифицированный hG-CSF

Чтобы получить ген модифицированного hG-CSF, олигомер S1 (SEQ ID NO: 22), имеющий предпочтительные для Е. coli кодоны и Ser вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF, и олигомер AS1 (SEQ ID NO:) синтезируют в синтезаторе ДНК (модель 380В, Applied Biosystem, США).

Олигонуклеотиды в количестве 0,5 мкл (50 пмоль) подвергают взаимодействию при 95°С в течение 15 минут и выдерживают в течение 3 часов до достижения температуры 35°С. Смесь осаждают в этаноле и подвергают гель-электрофорезу (SDS-PAGE), получая при этом двухцепочечный олигомер с "липкими" концами.

Плазмиду pT14SS1SG, полученную на стадии 3 примера 2, расщепляют при помощи ApaI и BstXI и затем лигируют с двухцепочечным олигомером с "липкими" концами, получая вектор PT14SS1S17SEG. Вектор pT14SS1S17SEG содержит ген, кодирующий hG-CSF, который имеет предпочтительные для Е. coli кодоны у аминоконца и Ser вместо 1-ой и 17-ой аминокислот hG-CSF.

На фиг.6 показан вышеописанный способ создания вектора pT14OSS1S17SEG.

Е. coli BL21(DE3) трансформируют вектором pT14SS1S173EG и получают трансформант, обозначаемый как Е. coli HM 10311, который задепонирован в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) 24 марта 1999 г. под номером доступа КССМ-10154.

Пример 4. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий сигнальный пептид OmpA E. coli и модифицированный hG-CSF

Вектор, содержащий ген, кодирующий промотор Тас и сигнальный пептид OmpA (SEQ ID NO: 24), а также ген, кодирующий модифицированный hG-CSF, получают следующим образом:

Сайт рестрикции HindIII

Вектор pT-CSF, полученный в примере 1, подвергают PCR, используя затравку (SEQ ID NO: 27), предназначенную для замены 1-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и другую затравку (SEQ ID NO: 28), предназначенную для получения сайта рестрикции EcoRI (5'-GAATTC-3') внизу от кодона терминации, и получают фрагмент ДНК, содержащий ген, кодирующий модифицированный hG-CSF.

Фрагмент ДНК расщепляют при помощи HindIII и EcoRI и затем вводят на участке HindIII/EcoRI вектора pFlag.CTS (Eastman, США), получая вектор pTО1SG, который содержит ген, кодирующий сигнальный пептид OmpA E. coli и модифицированный hG-CSF (SEQ ID NO: 29).

На фиг.7 показан вышеописанный способ создания вектора pTO1SG.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTOlSG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli НM 10409.

Пример 5. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий сигнальный пептид OmpA E. coli и модифицированный hG-CSF

Первый кодон гена модифицированного hG-CSF плазмиды pTO1SG, полученного в примере 4, заменяют Thr путем сайт-направленного мутагенеза (Papworth, С. et al., Strategies, 9, 3 (1996), выполняя PCR в отношении плазмиды pTO1SG, полученной в примере 4, с использованием смысловой затравки (SEQ ID NO: 30), предназначенной для замены 1-го кодона hG-CSF кодоном Thr, и комплементарной антисмысловой затравки (SEQ ID NO: 31).

E. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и получают таким образом плазмиду pTОG, которая содержит ген, имеющий Thr вместо первой аминокислоты hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTOG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli НМ 10401.

Пример 6. Получение модифицированных hG-CSF

(a) Получение [Ser1, Serl7] hG-CSF

Вектор pTO1SG, полученный в примере 4, подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 32), предназначенную для замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 33), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.

E. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получая таким образом плазмиду pTO1S17SG, которая содержит ген, имеющий Ser вместо 1-ой и 17-ой аминокислот hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTO1S17SG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli НМ 10410, который задепонирован в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) 24 марта 1999 г. под номером доступа КССМ-10151.

(b) Получение [Ser17] hG-CSF

Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 32), предназначенную для замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 33), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.

Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получая таким образом плазмиду pTO17SG, которая содержит ген, имеющий Ser вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.

Е. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTO17SG и получают трансформант, обозначаемый Е. coli HM 10411, который задепонирован в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) 24 марта 1999 г. под номером доступа КССМ-10152.

(с) Получение [Thrl7] hG-CSF

Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 34), предназначенную для замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Thr, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 35), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.

Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получая таким образом плазмиду pTO17TG, которая содержит ген, имеющий Thr вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.

Е. coli BL21(DE3) (Stratagen, США) трансформируют вектором pTO17TG и получают трансформант, именуемый Е. coli HM 10413.

(d) Получение [А1а17] hG-CSF

Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 36), предназначенную для замены 17-го кодона hG-CSF кодоном А1а, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 37), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.

Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получая таким образом плазмиду pTО17AG, которая содержит ген, имеющий Аlа вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.

Е. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTО17AG и получают трансформант, именуемый Е. coli HM 10414.

(e) Получение [Gly17] hG-CSF

Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 38), предназначенную для замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Gly, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 39), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.

Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получая таким образом плазмиду pTO17GG, которая содержит ген, имеющий Gly вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.

Е. coli BL21 (DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTO17GG и получают трансформант, именуемый Е. coli НМ 10415.

(f) Получение [Asp17] hG-CSF

Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 40), предназначенную для замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Asp, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 41), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.

Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получая таким образом плазмиду pTО17APG, которая содержит ген, имеющий Asp вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.

Е. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTО17APG и получают трансформант, именуемый Е. coli НМ 10416.

Пример 7. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий сигнальный пептид Gene III E. coli и модифицированный hG-CSF

(а) Создание вектора, содержащего ген, кодирующий арабинозный промотор и сигнальный пептид Gene III E. Coli.

Вектор, содержащий ген, кодирующий арабинозный промотор и сигнальный пептид Gene III E. coli (SEQ ID NO: 42), a также ген, кодирующий модифицированный hG-CSF, получают следующим образом:

Сайт рестрикции NcoI

Плазмиду pBAD gIIIA (Invitrogen, США), содержащую ген, кодирующий арабинозный промотор и сигнальный пептид Gene III, расщепляют при помощи NcoI, одноцепочечные ДНК удаляют при помощи ДНК-полимеразы Кленова и получают двухцепочечную ДНК с "тупыми" концами, которую затем расщепляют при помощи BgIII, получая при этом фрагмент вектора с "тупым" концом и "липким" концом.

Вектор pT-CSF, полученный в примере 1, подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 46), имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую со 2-ой по 9-ую аминокислоты hG-CSF (SEQ ID NO: 45), и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 47), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают фрагмент ДНК с "тупыми" концами, содержащий ген hG-CSF и сайт рестрикции BamHI у карбоксильного конца. Полученный фрагмент затем расщепляют при помощи BamHI, получая фрагмент гена hG-CSF с "тупым" концом и "липким" концом.

Фрагмент гена hG-CSF встраивают в созданный выше вектор, получая таким образом вектор pBADG, который содержит ген, кодирующий сигнальный пептид Gene III E. coli и hG-CSF (SEQ ID NO: 48).

На фиг.8 показан вышеописанный способ создания вектора pBADG.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pBADG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli НМ 10501.

(b) Получение [Met2, Val3] hG-CSF

Плазмиду pBAD gIIIA (Invitrogen, США) расщепляют при помощи NcoI и BgIII и получают фрагмент, имеющий два "липких" конца.

Вектор pT-CSF, полученный в примере 1, подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 50), имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую с 1-ой по 9-ую аминокислоты [Met2, Val3] hG-CSF (SEQ ID NO: 49), и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 51), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают фрагмент ДНК с "тупыми" концами, содержащий ген hG-CSF и сайт рестрикции BamHI у карбоксильного конца, который затем расщепляют при помощи NeoI и BamHI, получая таким образом фрагмент гена hG-CSF, имеющий два "липких" конца.

Сайт рестрикции NcoI

Фрагмент гена hG-CSF встраивают в созданный выше вектор и получают вектор pBAD2M2VG, содержащий ген, кодирующий сигнальный пептид Gene III E. coli, и Met и Val вместо 2-ой и 3-ей аминокислот hG-CSF (SEQ ID NO: 52).

На фиг.9 показан вышеописанный способ создания вектора pBAD2M3VG.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pBAD2M3VG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli HM 10510, который задепонирован в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) 24 марта 1999 г. под номером доступа КССМ-10153.

(с) Получение [Ser17] hG-CSF

Вектор pBADG, полученный в пункте (а), подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 32), предназначенную для замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 33), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.

Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получая таким образом плазмиду pBAD17SG, которая содержит ген, имеющий Ser вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.

Е. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pBAD17SG и получают трансформант, обозначаемый как Е. coli HM 10511.

(d) Получение [Met2, Val3, Serl7] hG-CSF

Bектор pBAD2M3VG, полученный в пункте (b), подвергают PCR, используя смысловую затравку (SEQ ID NO: 32), предназначенную для замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 33), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.

Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производят определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получая таким образом плазмиду pBAD2M3V17SG, которая содержит ген, имеющий Met, Val и Ser соответственно вместо 2-ой, 3-ей и 17-ой аминокислот hG-CSF.

E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pBAD2M3V17SG и получают трансформант, именуемый как E. coli HM 10512.

Пример 8. Получение hG-CSF

Трансформанты, полученные в примерах 2-7, культивируют в среде LB (1% бактотриптона, 0,5% бактодрожжевого экстракта и 1% NaCl) и затем инкубируют в присутствии индуктора экспрессии (IPTG) в течение 3 часов или культивируют без IPTG в течение более 15 часов. Все культуры центрифугируют со скоростью 6000 оборотов/мин в течение 20 минут для осаждения бактериальных клеток, после чего осадок суспендируют в 1/10 объема изотонического раствора (20% сахарозы, 10 мМ трис-Сl буферного раствора, содержащего 1 мМ EDTA, рН 7,0). Суспензию оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 30 минут, затем центрифугируют со скоростью 7000 оборотов/мин в течение 10 минут и собирают бактериальные клетки. Полученные клетки вновь суспендируют в дистиллированной воде при 4°С, центрифугируют со скоростью 7000 оборотов/мин в течение 10 минут и получают супернатант в виде раствора периплазмы. Содержание hG-CSF в растворе периплазмы определяют методом ELISA (Kato, К. et al., J. Immunol., 116, 1554 (1976)), используя антитело против hG-CSF (Aland, США), которое вычисляют в виде количества hG-CSF, продуцируемого в 1 л культуры. Результаты приведены в таблице.

Пример 9. Очистка hG-CSF

Трансформант Е. coli НМ 10411, полученный в примере 6(b), культивируют в среде LB, после чего культуру центрифугируют со скоростью 6000 оборотов/мин в течение 20 минут и собирают клетки. Выполняя способ по примеру 8, из клеток получают раствор периплазмы.

Раствор периплазмы доводят до рН 5,0-5,5, адсорбируют в колонке с СМ-сефарозой (Pharmacia Inc., Швеция), предварительно уравновешенной до рН 5,3, и промывают колонку 25 мМ NaCl. hG-CSF элюируют, последовательно добавляя в колонку буферные растворы, содержащие 50 мМ, 100 мМ и 200 мМ NaCl, и фракции, содержащие hG-CSF, собирают и объединяют.

Объединенные фракции подвергают хроматографии на колонках с фенилсефарозой (Pharmacia Inc., Швеция), получая при этом [Ser17] hG-CSF с чистотой 99%.

Далее вышеописанный способ выполняют, используя трансформанты Е. coli НМ 10311, НМ 10409, НМ 10411, НМ 10413, HМ 10414, НМ 10415, НМ 10510 и НМ 10512, полученные соответственно в примерах 3, 4, 6(b), 6(с), 6(d), 6(е), 7(b) и 7(d).

Каждую очищенную фракцию hG-CSF подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с целью определения чистоты и примерной концентрации hG-CSF и затем анализируют методом ELISA для определения точной концентрации hG-CSF в растворе периплазмы. В качестве контрольного вещества используют Met-hG-CSF (Kirin amgen).

На фиг.10а приведены результаты SDS-PAGE, где дорожка 1 соответствует Met-G-CSF, дорожка 2 соответствует раствору трансформанта Е. coli НМ 10411 в периплазме и дорожка 3 соответствует очищенному [Ser17] hG-CSF. Как показано на фиг.10b, молекулярная масса [Ser17] hG-CSF аналогична молекулярной массе hG-CSF дикого типа и раствор трансформанта Е. coli НМ 10411 в периплазме характеризуется высоким содержанием [Ser17] hG-CSF.

Кроме того, производят определение N-концевых аминокислотных последовательностей разных hG-CSF и нуклеотидных последовательностей, кодирующих с 1-ой по 32-ую аминокислоты, полученные с использованием трансформантов НМ 10311, НМ 10409, НМ 10411, НМ 10413, НМ 10414, НМ 10415, НМ 10510 и НМ 10512, приведенных соответственно в SEQ ID NOS: 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 и 70. Полученный результат показывает, что модифицированный hG-CSF по настоящему изобретению не имеет остатка метионина у N-конца.

Нитроцеллюлозный фильтр (Bio-Rad Lab., США) смачивают буферным раствором для блоттинга (170 мМ глицина, 25 мМ трис HCl (рН 8), 20% метанола) и белки, отделенные на геле, анализируют методом вестерн-блоттинга на нитроцеллюлозном фильтре (Bio-Rad Lab., США) в течение 3 часов. Фильтр выдерживают в 1% казеине в течение 1 часа и трижды промывают PBS, содержащим 0,05% Tween 20. Фильтр помещают в раствор козьего анти-G-CSF антитела (R&D System, AB-214-NA, США), разведенный PBS, и подвергают взаимодействию при комнатной температуре в течение 2 часов. После окончания реакции фильтр трижды промывают раствором PBST, чтобы удалить непрореагировавшее антитело. Добавляют конъюгированный с пероксидазой хрена кроличьего антикозьего IgG(Bio-Rad Lab., США), разведенный PBS, и подвергают взаимодействию при комнатной температуре в течение 2 часов. Фильтр промывают PBST и добавляют раствор пероксидазы из набора веществ (Bio-Rad Lab., США) для осуществления окрашивания. Результаты вышеописанного вестерн-блоттинга приведены на фиг.10b, где дорожка 1 соответствует положительному контролю, Met-G-CSF, и дорожка 2 соответствует очищенному [Ser17] hG-CSF. Как показано на фиг.10b, молекулярная масса [Ser17] hG-CSF равна молекулярной массе hG-CSF дикого типа.

Пример 10. Клеточная активность hG-CSF и модифицированного hG-CSF

Линию клеток HL-60 (ATCC CCL-240, полученную из костного мозга белой 36-летней женщины, страдающей промиелоцитарным лейкозом) культивируют в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, доводят до 2,2×105 клеток/мл и добавляют DMSO (диметилсульфоксид, со степенью чистоты для культивирования/SIGMA) до концентрации 1,25% (об./об.). В 96-луночный планшет (Corning/96-луночный планшет с низкой степенью испарения) добавляют 90 мкл полученного раствора в количестве 2×104 клеток/лунку и инкубируют при 37°С и 5% СО2 в течение 48 часов.

Все модифицированные [Ala17] hG-CSF, [Gly17] hG-CSF, [Ser17] hG-CSF и [Thr17] hG-CSF разводят в средах RPMI 1640 до концентрации 500 нг/мл и 10 раз последовательно разводят двукратным количеством среды RPMI 1640.

Полученный раствор добавляют в лунки в количестве 10 мкл/лунку и инкубируют при 37°С в течение 48 часов. В качестве положительного контроля используют коммерчески доступный hG-CSF (Jeil Pharmaceutical).

Увеличенную концентрацию линии клеток определяют, используя коммерчески доступный титр клеток CellTiter96™ (№ по каталогу G4100, Promega), на основании измеренной оптической плотности при 670 нм.

Как показано на фиг.11, клеточная активность модифицированных hG-CSF аналогична или выше, чем у положительного контрольного вещества, hG-CSF дикого типа.

Очевидно, что помимо описанных и проиллюстрированных вариантов осуществления данного изобретения возможны разные изменения и модификации в пределах настоящего изобретения, которые ограничиваются только объемом прилагаемой формулы изобретения.

Будапештский договор о международном признании регистрации микроорганизмов при проведении патентной экспертизы приведен в конце описания.

Список последовательностей приведен в конце описания.

Похожие патенты RU2232772C2

название год авторы номер документа
ВЕКТОР ДЛЯ ЭКСПРЕСИИ И СЕКРЕЦИИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА(HIFNα), ШТАММ ESCHERICHIA COLI ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ И СЕКРЕЦИИ HIFNα(ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ HIFNα 2001
  • Квон Се Чанг
  • Дзунг Сунг Юб
  • Чой Ки Доо
  • Ким Ча Соон
  • Бае Сунг Мин
  • Ли Гван Сун
RU2230116C2
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД ЭНТЕРОТОКСИНА - II E. COLI И МИКРООРГАНИЗМ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ БЕЛОК СЛИЯНИЯ УПОМЯНУТОГО ПЕПТИДА С ГЕТЕРОЛОГИЧНЫМ БЕЛКОМ 1999
  • Квон Се Чанг
  • Дзунг Сунг Йоуб
  • Схин Хоон
  • Чой Дзай До
  • Чой Ки Доо
  • Ли Гван Сун
RU2198179C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ЧЕЛОВЕКА (G-CSF) И РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА рAS017, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ G-CSF В КЛЕТКАХ Escherichia coli 2011
  • Шульга Алексей Анатольевич
RU2529363C2
СПОСОБ МАССОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ОБЛАСТИ Fc ИММУНОГЛОБУЛИНА С УДАЛЕННЫМИ НАЧАЛЬНЫМИ МЕТИОНИНОВЫМИ ОСТАТКАМИ 2006
  • Дзунг Сунг Юб
  • Ким Дзин Сун
  • Шин Дзин Хван
  • Квон Се-Чанг
  • Ли Гван-Сун
  • Сонг Дае Хае
RU2428430C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ БАРНАЗЫ В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI, ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ БАРНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАРНАЗЫ. 2017
  • Деев Сергей Михайлович
  • Шульга Алексей Анатольевич
  • Лукьянова Тамара Ивановна
  • Коновалова Елена Валерьевна
RU2650871C1
ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТКАНЕВОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА (ТАП) ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ) ИЛИ [-1]МЕТИОНИЛ-ФРАГМЕНТ ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ) 2011
  • Орлова Надежда Александровна
  • Воробьев Иван Иванович
RU2495933C2
ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ ИЗ Xanthomonas rubrilineans И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ НА ОСНОВЕ ЭТОГО ШТАММА 2012
  • Березина Оксана Валентиновна
  • Скляренко Анна Владимировна
  • Абешева Заян Андреевна
  • Сатарова Дженни Эрнстовна
  • Яроцкий Сергей Викторович
  • Тишков Владимир Иванович
  • Федорчук Владимир Витальевич
  • Федорчук Елена Александровна
  • Савин Святослав Сергеевич
RU2502797C1
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПЛАЗМИДНЫЕ ДНК, КОДИРУЮЩИЕ ГИБРИДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ СО СВОЙСТВАМИ КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА mCherry, ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ В Escherichia coli 2013
  • Петровская Лада Евгеньевна
  • Шингарова Людмила Николаевна
  • Гапизов Султан Шахбанович
  • Крюкова Елена Александровна
  • Болдырева Елена Филипповна
  • Якимов Сергей Александрович
  • Долгих Дмитрий Александрович
  • Кирпичников Михаил Петрович
RU2527171C1
ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА 2011
  • Орлова Надежда Александровна
  • Воробьев Иван Иванович
  • Мацкевич Виктор Александрович
  • Звягин Иван Владимирович
RU2495934C2
СЛИТЫЙ БЕЛОК ТИОРЕДОКСИНА И ДОМЕНА 4 ИНФЕСТИНА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, И БАКТЕРИЯ РОДА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ ТАКОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК 2012
  • Воробьев Иван Иванович
  • Орлова Надежда Александровна
  • Колядко Владимир Николаевич
RU2528251C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 232 772 C2

Реферат патента 2004 года МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ГРАНУЛОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ДНК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР

Изобретение относится к биотехнологии, в частности генной инженерии, и может быть использовано для получения секретируемого модифицированного колониестимулирующего фактора гранулоцитов человека (hG-CSF). Модифицированный hG-CSF получают путем замены в аминокислотной последовательности hG-CSF дикого типа 1-ой аминокислоты на Ser или 1-ой и 17-ой – на Ser, 2-ой аминокислоты на Met и 3-ей на Val, или 2-ой на Met, 3-ей на Val и 17-ой на Ser, или 17-ой на Thr. Клетки микроорганизма, трансформированные вектором, содержащим ДНК, кодирующую модифицированный hG-CSF, культивируют с получением и секрецией в периплазму hG-CSF. Изобретение позволяет эффективно экспрессировать и секретировать в микроорганизме hG-CSF, сохраняющий биологическую активность белка дикого типа. 4 с. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл.

Формула изобретения RU 2 232 772 C2

1. Модифицированный колониестимулирующий фактор гранулоцитов человека (hG-CSF), аминокислотная последовательность которого соответствует таковой дикого типа (SEQ ID NO:2), за исключением того, что (а) 1-я аминокислота является Ser; (b) 1-я аминокислота является Ser и 17-я аминокислота является Ser; (с) 2-я аминокислота является Met и 3-я аминокислота является Val; (d) 2-я аминокислота является Met, 3-я аминокислота является Val и 17-я аминокислота является Ser; или (f) 17-я аминокислота является Thr.2. ДНК, кодирующая модифицированный hG-CSF, имеющая нуклеотидную последовательность, определяющую аминокислотную последовательность модифицированного hG-CSF по п.1.3. ДНК по п.2, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность 1-60 ДНК модифицированного hG-CSF соответствует нуклеотидной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO:55, 57, 61, 67 и 69.4. Экспрессирующий вектор для Е.coli, содержащий ДНК по п.2, и полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид, выбранный из группы, состоящей из сигнального пептида терморезистентного энтеротоксина II Е.coli, модифицированного сигнального пептида терморезистентного энтеротоксина II Е.coli, сигнального пептида бета-лактамазы Е.coli, модифицированного сигнального пептида бета-лактамазы Е.coli, сигнального пептида Gene III Е.coli или модифицированного сигнального пептида Gene III Е.coli, присоединенный по 5’-концу к ДНК, кодирующей модифицированный hG-CSF.5. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что сигнальный пептид терморезистентного энтеротоксина II Е.coli имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:53.6. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что модифицированный сигнальный пептид терморезистентного энтеротоксина II Е.coli имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:54.7. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что дополнительно включает модифицированную последовательность Шайна-Дальгарно энтеротоксина II Е.coli, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:71.8. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что сигнальный пептид бета-лактамазы Е.coli имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24.9. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что сигнальный пептид Gene III Е.coli имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:42.10. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что представляет собой pT14SS1SG, pT14SS1S17SEG, pTО1SG, pTО1S17SG, pTО17SG или pBAD2M3V17SG.11. Экспрессирующий вектор по п.4, отличающийся тем, что его используют для встраивания в микроорганизм.12. Экспрессирующий вектор по п.11, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой трансформированную Е.coli.13. Экспрессирующий вектор по п.12, отличающийся тем, что трансформированная Е.coli представляет собой Е.coli BL21(DE3)/pT14SS1SG(HM 10310), Е.coli BL21 (DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311, КССМ-10154), Е.coli BL21(DE3)/pTО1SG (HM 10409), Е.coli ВL21 (DE3)/pTО1S17SG (HM 10410, КССМ-10151), Е.coli BL21(DE3)/pTО17SG (HM 10411, КССМ-10152), Е.coli ВL21 (DE3)/pTO17TG (HM 10413), Е. coli BL21 (DE3)/pTО17AG (НМ 10414), Е.coli BL21 (DE3)/pTО17GG (НМ 10415), Е.coli ВL21 (DE3)/pBAD2M3VG (НМ 10510, КССМ-10153), Е.coli ВL21(DE3)/pBAD17SG (НМ 10511) или Е.coli ВL21 (DE3)/pBAD2M3V17SG (НМ 10512).14. Способ получения модифицированного hG-CSF в микроорганизме, включающий культивирование микроорганизма, трансформированного вектором по п.4, с получением и секрецией в периплазму модифицированного hG-CSF.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2004 года RU2232772C2

US 5795968, 18.08.1998
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
US 4810643, 07.03.1989
JOBLING MG et al., Construction and characterization of versatile cloning vectors for efficient delivery of native foreign proteins to the periplajm of Escherichia coli, Plasmid, 1997, v.38, p.158-73
PILLAND et al., Production of the beta-subunit of human chorionic gonadotropin in Escherichia coli and its export mediated by the heat – labile enterotoxin chain – B signal sequence
Gene, 1996, v.173, p.271-274.ROBINSON AS et al., Constitutive over expression of secreted heterologous proteins decreases extractable BiP and protein disulfide isomerase levels in saecharomyces cerevisiae, Biotechnol Prog., 1995, v.II, р.171-177.

RU 2 232 772 C2

Авторы

Квон Се Чанг

Дзунг Сунг Юб

Бае Сунг Мин

Ли Гван Сун

Даты

2004-07-20Публикация

2000-07-07Подача