Мультирезистентный штамм бактерий Acinetobacter baumannii для стандартизации оценки эффективности разрабатываемых антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12Q1/18 C12R1/01 

Мультирезистентный штамм бактерий Acinetobacter baumannii для стандартизации оценки эффективности разрабатываемых антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств.

Изобретение относится к области микробиологии, дезинфектологии и биотехнологии, касается нового штамма Acinetobacter baumannii 5720, содержащего маркеры резистентности к антимикробным препаратам: аминогликозидам (aph(3'')-Ib; aph(6)-Id; aph(3')-Ia; aph(3')-Via; armA), бета-лактамам (blaOXA-23, blaOXA-66, bla ADC-73, blaTEM-ID), MLS-антибиотикам(mrs, mph), сульфонамиду (sul2), тетрациклину (tet(B)), и может использоваться для стандартизации оценки эффективности разрабатываемых лечебных антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств.

Микроорганизм Acinetobacter baumannii является одним из основных возбудителей инфекций связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), в первую очередь, в отделениях реанимации и интенсивной терапии. Проблема лечения таких инфекций заключается в защите микроорганизма от действия антимикробных и дезинфицирующих средств. Acinetobacter baumannii могут колонизировать желудочно-кишечный тракт, кожу пациента, рото- и носоглотку, конъюнктиву, влагалище и уретру, и являться причиной пневмонии, трахеобронхита, сепсиса, инфекций мочевыводящих путей, эндокардита, раневой и хирургической инфекции, инфекций кожи и мягких тканей, менингита, вентрикулита, абсцессов мозга, интраабдоминальных абсцессов, хориоамнионита, остеомиелита, артрита, синусита, перитонита [1, 2].

Одной из важных характеристик бактерий Acinetobacter baumannii является антибиотикорезистентность и устойчивость к дезинфицирующим средствам. Процент мультирезистентных штаммов, вызывающих инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи, растет в геометрической прогрессии, причем в самых разных регионах мира [3]. Принято считать, что критическое нарастание приобретенной антибиотикорезистентности Acinetobacter baumannii произошло в период с 1980 по 1990 г. Именно в эти годы штаммы Acinetobacter baumannii стали приобретать резистентность к ампициллину, карбенициллину, цефокситину, гентамицину, хлорамфениколу [4]. Примерно тогда же - в период с 1985 по 1999 г. - были зарегистрированы первые случаи резистентности Acinetobacter baumannii к карбопенемам и колистину [5]. В настоящее время доказано, что Acinetobacter baumannii могут продуцировать бета-лактамазы. Лактамазы типа D - ОХА-ферменты (от англ. oxacillinase - названия функционального класса лактамаз, гидролизирующих оксациллин и клоксациллин быстрее и глубже, чем пенициллин) - могут обеспечивать устойчивость не только к пенициллинам, но и к карбопенемам. К «профессиональным» ОХА-карбапенемазам Acinetobacter baumannii относят ОХА-23, содержащийся в предложенном нами штамме. Актуальными ферментами резистентности являются и аминогликозидазы, тетрациклиназы, хинолоназы, активирующие моно- и мультидрагэффлюксные механизмы, осуществляющие модификацию мишени макролидов путем рибосомального метилирования рРНК [6].

Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение ассортимента штаммов Acinetobacter baumannii, пригодных для разработки эффективных антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств.

Указанный технический результат изобретения достигается выделением мультирезистентного штамма Acinetobacter baumannii для стандартизации оценки эффективности разрабатываемых антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8561, содержащего маркеры резистентности к антимикробным препаратам: аминогликозидам (aph(3'')-Ib; aph(6)-Id; aph(3')-Ia; aph(3')-Via; armA), бета-лактамам (blaOXA-23, blaOXA-66, bla ADC-73, blaTEM-ID), MLS-антибиотикам(mrs, mph), сульфонамиду (sul2), тетрациклину (tet(B)). Указанный штамм изолирован из клинического материала больного, проживающего в северном регионе Западной Сибири.

Заявляемый штамм Acinetobacter baumannii 5720, содержащий маркеры резистентности к антимикробным препаратам: аминогликозидам (aph(3'')-Ib; aph(6)- Id; aph(3')-Ia; aph(3')-Via; armA), бета-лактамам (blaOXA-23, blaOXA-66, bla ADC-73, blaTEM-ID), MLS-антибиотикам(mrs, mph), сульфонамиду (sul2), тетрациклину (tet(B)) депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8561 от 23 ноября 2018 года. GenBank accession no VBX100000000.1; SRR8881948, 4,005,515. Полногеномное секвенирование штамма Acinetobacter baumannii осуществлено на платформе Illumina MiSeq, с использованием наборов Nextera DNA Library Preparation Kit и MiSeq Reagent Kits v3 (600-Cycle Kit), согласно рекомендациям производителя. Полученные единичные прочтения полногеномного секвенирования были собраны в контиги при помощи программы Newbler Assembler 3.0 и SPAdes 3.11.1. Общая длина полученных контигов (п.н.) и GC состав штамма соответствуют значениям размеров геномов и GC составу референсных штаммов Acinetobacter baumannii, находящихся в базе данных NCBI Genome.

Характеристика заявляемого штамма. По современным представлениям вид Acinetobacter baumannii входит в Acinetobacter calcoaceticus/baumannii complex, который относится к роду Acinetobacter, семейству Moraxellaceae, порядку Pseudomonadales, классу Gamma proteobacteria, типу Proteobacteria, домен - бактерии.

Культуральные свойства штамма Acinetobacter baumannii 5720. Неферментирующие грамотрицательные неподвижные бактерии прототрофы, форма которых в зависимости от фазы и условий роста может быть кокковидной либо коккобациллярной (длина до 1,5 мкм). Биохимические свойства штамма Acinetobacter baumannii 5720 определяли с помощью тест-системы NEFERMtest-24 (Erba LaChema s.r.o., Karasek, Brno, CZ) и постановкой дополнительных тестов (индол, окси-тест, каталаза, подвижность, рост при 42°С, образование желтого пигмента, выделение сероводорода, ОФ-тест, рост на среде Эндо). Строгий аэроб, растет при температуре +37°С, +42°С. Индол, сероводород, оксидазу не образует, каталазопозитивный. Не ферментирует сахарозу, глюкозу, мальтозу, маннитол, уреазу, аргинин, орнитин, лизин, ацетамид, бета-глюкозидазу, N-ацетил-бета-D-глюкозаминидазу, бета-галактозидазу, инозитол, эскулин. Ферментирует лактозу, ксилозу, арабинозу, малонат, галактозу, целлобиозу, гамма-гдютамилтрансферазу, фосфотазу.

Выросшие на плотной питательной среде колонии были исследованы с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF Biotyper (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Для этого проводили экстракцию белков посредством последовательной обработки микробной взвеси этиловым спиртом, 70% муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила. В качестве вещества, обеспечивающего процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения, использовали MALDI-матрицу (насыщенный водный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, содержащий 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты). Анализ проводили в автоматическом режиме. Согласно проведенным исследованиям, показатель подобия варьировался от 2,44 до 2,536, что соответствует высокому уровню видовой идентификации.

Проведенные исследования позволяют заключить, что исследуемый штамм был идентифицирован как Acinetobacter baumannii с высокой степенью достоверности и не содержит примеси других бактериальных культур.

При построении филогенетического дерева на основе определенных коровых SNP при использовании программы SplitsTree4 (http://www.splitstree.org/) Acinetobacter baumannii 5720 сопоставим с Acinetobacter baumannii MDR-TJ, находящимся в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank.

Предлагаемый нами штамм Acinetobacter baumannii 5720 содержит все актуальные маркеры резистентности к антимикробным препаратам: аминогликозидам, бета-лактамам, MLS-антибиотикам, сульфонамиду, тетрациклину, поэтому может быть эффективным для стандартизации оценки разрабатываемых перспективных антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств.

Пример 1.

В эксперименте, оценку эффективности нового синтезированного антимикробного препарата (АМП-Х), предлагаемого для лечения инфекции, вызванной мультирезистентными штаммами Acinetobacter baumannii, проводили специальными методами: диско-диффузионным и методом серийных разведений. Метод серийных разведений являются более чувствительным, так как определятся его минимальная подавляющая концентрация (МПК). Для этого исследования подобрали 10 штаммов Acinetobacter baumannii, отличающиеся генетическим разнообразием по генам резистентности к различным группам антибиотиков. Предложенный нами мультирезистентный штамм Acinetobacter baumannii В-8561, является одним из них, так как представляет собой редкий генетический вариант содержащий: blaOXA-66, bla ADC-73, blaTEM-1D, что способствует расширению спектра маркеров резистентности.

Оценка полученных результатов определения чувствительности АМП-Х к штаммам Acinetobacter baumannii: синтезированный антимикробный препарат не эффективен в отношении мультирезистентного штамма Acinetobacter baumannii В-8561.

Пример 2.

Оценку эффективности дезинфицирующих средств (ДС), предлагаемых для дезинфекции объектов окружающей среды, контаминированной мультирезистентными штаммами Acinetobacter baumannii, проводили суспензионным методом, в соответствии с Р.4.2.2643-10 «Методы лабораторного исследования и испытаний дезинфицирующих средств для оценки их эффективности и безопасности». Результаты исследования представлены в таблице.

Оценка полученных результатов определения эффективности ДС: проведенные исследования чувствительности трех групп ДС оказались не эффективными в отношении мультирезистентного штамма Acinetobacter baumannii В-8561.

Таким образом, предложенный штамм Acinetobacter baumannii позволит расширить ассортимент коллекции микроорганизмов этого вида, пригодных для разработки антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств.

Литература

1. Атакишизаде С.А. Чувствительность внутрибольничных штаммов бактерий рода Acinetobacter к антибиотикам в многопрофильном стационаре // Детские инфекции. 2018; 17 (3): 62-63.

2. Палковский О.Л., Новогран Л.И., Полонская И.О. Проблемы терапии нозокомиальной инфекции, вызванной Acinetobacter baumannii // Проблемы здоровья и экологии. 2014; 3 (41): 26-30.

3. Чеботарь И.В., Лазарева А.В., Масалов Я.К., Михайлович В.М., Маянский Н.А. Acinetobacter: микробиологические, патогенетические и резистентные Свойства // Актуальные вопросы микробиологии. Весник РАМН. 2014; 9-10: 39-50.

4. Allen D.M. Wong S.Y. Acinetobacter.a perspective // Singapore Med. J. 1990; 31 (6): 511-514.

5. Zarrilli R., Pournaras S., Giannouli M., Tsakris A. Global evolution of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii clonal lineages // Antimicrob. Agents. 2013; 41 (1): 11-19.

6. Peleg A.Y., Seifert H., Paterson D.L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen // Clin. Microbiol. Rev. 2008; 21: 538-582.

Изобретение относится к области микробиологии, дезинфектологии, биотехнологии. Штамм Acinetobacter baumannii 5720 депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под регистрационным номером В-8561. Штамм Acinetobacter baumannii В-8561 может быть пригоден для разработки эффективных антибактериальных препаратов и дезинфицирующих средств. 2 табл., 2 пр.

Мультирезистентный штамм Acinetobacter baumannii 5720 для стандартизации оценки эффективности разрабатываемых антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8561.