СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ КОЛОНИЕОБРАЗОВАНИЯ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В СЕЛЕЗЕНКЕ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2004 года по МПК C12N5/06 A61K35/36 

Изобретение относится к медицине, а именно к стимуляторам колониеобразования кроветворных клеток, и может найти применение в клинической практике и радиобиологических экспериментах.

Известен способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток предшественников в селезенке после облучения путем введения животным адреналина в количестве 0.1-0.07 мг/мышь.

Недостатком данного способа является низкое колониеобразование кроветворных клеток и использование для этого фармакологического препарата, имеющего определенные противопоказания для применения.

Известен способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке путем введения животным через 2-4 часа после облучения трис(гидроксиметил)аминометан в количестве 0,3-0,5 мл/мышь.

Недостатком данного способа является применение химически чистого препарата, дальнейшее влияние которого на организм млекопитающих не изучено.

Наиболее близким в уровне техники к заявляемому техническому решению является способ воздействия гистона на кроветворные клетки-предшественники (КОЕ-c) нормального или облученного организма (Радиационная биология, Радио-экология, 1994, 34, №4-5, с.544-549).

Недостатком данного способа является высокая стоимость используемых препаратов, которые были получены из тимуса животных путем сложного биотехнологического процесса.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала стимулирующих средств, полученных из экологически чистого сырья, обладающих способностью повышать эффективность колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке после облучения животных.

Поставленная задача решается путем введения животным стимулирующего вещества, а именно ферментативного гидролизата из морских гидробионтов в количестве 40-60 маг. Стимулирующее вещество вводят животным до облучения, причем последнюю дозу стимулирующего вещества вводят не позднее чем за 1,5 часа до облучения или после облучения, причем первую дозу стимулирующего вещества вводят не ранее чем за 1,5 часа после облучения.

В качестве стимулирующих веществ используют ферментативные гидролизаты из мидии, или из мантии морского гребешка, или из гонад морского гребешка, причем стимулирующее вещество вводят животным в течение 5-7 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве стимулятора колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке используют ферментированные гидролизаты из морских гидробионтов, а именно из мидии, или из мантии морского гребешка, или из гонад морского гребешка, в количестве 40-50 мкг.

Сравнение заявляемого способа с известными способами показывает, что впервые предложено использование ферментированных гидролизатов из морских гидробионтов: мидии, или из мантии морского гребешка, или из гонад морского гребешка в количестве 40-50 мкг, при этом гидролизаты вводят животным ежедневно в течение 5-7 дней до облучения или после облучения, причем последнюю дозу стимулирующего вещества вводят не позднее чем за 1,5 часа до облучения или первую дозу стимулирующего вещества вводят не ранее чем за 1,5 часа после облучения.

Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критериям изобретения “Новизна” и “Изобретательский уровень”.

Ферментативные гидролизаты из морских гидробионтов готовят следующим образом.

Исходное сырье: мидии, или мантию морского гребешка, или гонады морского гребешка измельчают по отдельности, добавляют в них дистиллированную воду в соотношении 1:2-1:3, доводят до рН 8,0-8.2, добавляют стандартный ферментный препарат протеолитического действия, в частности коллагеназу, в количестве 1-5% от исходной массы. Смесь выдерживают в течение 4-8 часов при комнатной температуре, затем подогревают до 100°С, охлаждают, фильтруют и сушат.

Для оценки стимулирующего действия ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов на колониеобразование кроветворных клеток-предшественников в селезенке до или после облучения были проведены экспериментальные исследования на белых беспородных мышах весом 18-20 г.

Для оценки профилактического действия ферментативных препаратов подопытным животным ежедневно в течение 5-7 дней не позднее чем за 1,5 часа до облучения вводили под кожу в область бедра ферментативные препараты: из мидии, или из мантии морского гребешка, или из гонад морского гребешка в количестве 40-50 мкг, предварительно растворив их в 0.85% физиологическом растворе. Затем мышей облучали на аппарате Рокус-М в дозе 7 Гр при мощности дозы 0.9 Гр/мин.

Для определения лечебного действия ферментативных препаратов животных сначала облучали на аппарате Рокус-М в дозе 7 Гр при мощности дозы 0.9 Гр/мин, затем ежедневно в течение 5-7 дней вводили им под кожу в область бедра ферментативные препараты: из мидии, или из мантии морского гребешка, или из гонад морского гребешка в количестве 40-50 мкг, предварительно растворив их в 0.85% физиологическом растворе, причем первую дозу ферментативных препаратов вводили животным не позднее чем через 1.5 часа после облучения.

На восьмые сутки после применения ферментативных препаратов мышей забивали декапитацией, извлекали селезенку и в течение двух часов фиксировали в жидкости Буэна. После фиксации подсчитывали число эндогенных колоний при помощи лупы.

Критерием стимулирующего воздействия ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов служит наличие образования эндогенных колоний похожих на бугорки, размером 0.5-3.5 мм. Каждая колония представляет собой клон клеток, возникших из одной кроветворной клетки-предшественника. Число колоний пропорционально числу выживших клеток-предшественников и является показателем восстановления кроветворения.

Для подтверждения стимулирующего эффекта данных средств было проведено сравнительное исследование путем введения животным 40-50 мкг 0,85% физиологического раствора. При введении животным физиологического раствора в количестве 40-50 мкг до облучения на 8-ые сутки эндоколоний насчитывалось 8,1±1,5, после облучения 4,6±1,6.

Дозировку ферментативных препаратов определяли экспериментальным путем, так как полученные результаты свидетельствуют о том, что при уменьшении дозы менее 40 мкг стимулирующий эффект препарата незначительно отличается от контрольного, а при увеличении дозировки выше 50 мкг число колоний не нарастает, что свидетельствует об истощении компенсаторных возможностей и нецелесообразности дальнейшего увеличения дозы препарата.

Временная схема использования препарата обусловлена патофизиологическими законами развития адаптивных реакций живых организмов.

Введение стимулятора не позднее чем за 1.5 часа перед или после облучения обеспечивает необходимую стимуляцию нейроиммуноэндокринной системы, что способствует повышению радиорезистентности организма, а применение стимуляторов не менее 5-7 дней соответствует минимальному сроку традиционных схем введения иммуностимуляторов, обеспечивающих стойкий физиологический эффект.

Данные по влиянию ферментативных препаратов на число эндогенных колоний в зависимости от дозы препарата и продолжительности его применения представлены в таблице.

Из таблицы следует, что все взятые в эксперимент ферментативные гидролизаты из морских гидробионтов являются стимуляторами эндогенных колоний (по сравнению с показателями контрольных групп).

Введение мышам до облучения ферментативных гидролизатов в количестве 40-50 мкг увеличивает количество эндоколоний в 1,01-2,5 раза, причем максимальный профилактический эффект дает применение ферментативного гидролизата из гонад морского гребешка.

Введение облученным мышам ферментативных гидролизатов в количестве 40-50 мкг увеличивает количество эндоколоний в 1,7-3,9 раза, причем максимальный лечебный эффект дает применение ферментативного гидролизата из мидии.

Примеры конкретного выполнения

Пример №1

Эксперименты были выполнены на белых беспородных мышах-самцах весом 18-20 г, которых разделили на 4 группы по 10 особей в каждой.

1-я группа (контроль) - животным вводили физиологический раствор.

2-я группа - вводили ферментативный гидролизат из мидии в количестве 45 мкг (сухой) в течение 6 дней, а последнюю дозу за 1.5 часа до облучения.

3-я группа - вводили ферментативный гидролизат из мантии морского гребешка в количестве 45 мкг (сухой) в течение 6 дней, а последнюю дозу за 1.5 часа до облучения.

4-ая группа - вводили ферментативный гидролизат из гонад морского гребешка в количестве 45 мкг (сухой) в течение 6 дней, а последнюю дозу за 1.5 часа до облучения.

Ферментативный гидролизат из мидии или из мантии морского гребешка или из гонад морского гребешка предварительно растворяют в 0,85% физиологическом растворе и вводят под кожу в область бедра раз в сутки.

Затем мышей облучают в дозе 7.0 Гр с мощностью дозы 0.9 Гр/мин на аппарате Рокус-М. Доза подбирается заранее опытным путем и зависит от пола, породы и сезона.

На 7-ые сутки мышей забивают декапитацией, селезенку извлекают и фиксируют в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40%-ный формалин - 15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносят в 70%-ный раствор этанола и подсчитывают колонии. Подсчет производится при помощи лупы.

Из таблицы следует, что введение ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов увеличивает число эндогенных колоний на селезенке в 1,4-2.5 раза, причем применение гидролизата из гонад морского гребешка дает наиболее высокий стимулирующий эффект в качестве профилактики, число колоний - 20,1±2,3.

Наблюдаемое увеличение числа эндогенных колоний связано с увеличением числа выживших кроветворных клеток-предшественников, необходимых для восстановления кроветворения.

Пример №2 осуществляли аналогично примеру №1, однако стимулирующие вещества - ферментативные гидролизаты из морских гидробионтов вводили мышам в количестве 40 мкг(сухой) в течение 5 дней.

На 6-ые сутки мышей забивают декапитацией, селезенку извлекают и фиксируют в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40%-ный формалин - 15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносят в 70%-ный раствор этанола и подсчитывают колонии. Подсчет производится при помощи лупы.

Результаты эксперимента представлены в таблице.

Из таблицы следует, что введение ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов увеличивает число эндогенных колоний на селезенке в 1.01-1.7 раза, причем применение гидролизата из гонад морского гребешка дает наиболее высокий стимулирующий эффект, число колоний - 13,5±1,2.

Пример №3 осуществляли аналогично примеру №1, однако стимулирующие вещества - ферментативные гидролизаты из морских гидробионтов вводили мышам в количестве 50 мкг (сухой) в течение 7 дней.

На 8-ые сутки мышей забивают декапитацией, селезенку извлекают и фиксируют в жидкости Буэна (насыщении раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40%-ный формалин - 15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносят в 70%-ный раствор этанола и подсчитывают колонии. Подсчет производится при помощи лупы.

Результаты эксперимента представлены в таблице.

Из таблицы следует, что введение ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов увеличивает число эндогенных колоний на селезенке в 1,5-2.5 раза, причем применение гидролизата из гонад морского гребешка дает наиболее высокий стимулирующий эффект, число колоний - 19,9±2,4. Введение стимулирующих веществ в количестве 50 мкг не дает более высокий стимулирующий эффект по сравнению с примером №1.

Пример №4

Эксперименты были выполнены на белых беспородных мышах-самцах весом 18-20 г, которых разделили на 4 группы по 10 особей в каждой. Затем мышей облучают в дозе 7 Гр с мощностью дозы 0.9 Гр/мин в аппарате Рокус-М. Через 1.5 часа после облучения мышам вводят стимулирующее вещество. 1-я группа (контроль) - животным вводили физиологический раствор.

Животным других групп вводили стимулирующие вещества в количестве 45 мкг(сухой) в течение 6 дней. Животным вводили стимулирующие вещества:

2-ой группе - ферментативный гидролизат из мидии;

3-ей группе - ферментативный гидролизат из мантии морского гребешка;

4-ой группе - ферментативный гидролизат из гонад морского гребешка.

Стимулирующее вещество предварительно растворяют в 0,85% физиологическом растворе и вводят под кожу в область бедра раз в сутки, причем первую после облучения дозу вводят животным через 1.5 часа.

На 7-ые сутки мышей забивают декапитацией, селезенку извлекают и фиксируют в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40%-ный формалин - 15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносят в 70%-ный раствор этанола и подсчитывают колонии. Подсчет производится при помощи лупы х4.

Результаты эксперимента представлены в таблице.

Из таблицы следует, что введение ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов увеличивает число эндогенных колоний на селезенке в 2,7-3,9 раза, причем применение гидролизата из мидии дает наиболее высокий лечебный стимулирующий эффект, число колоний - 17,9±5,1.

Наблюдаемое увеличение числа эндогенных колоний связано с увеличением числа выживших кроветворных клеток-предшественников, необходимых для восстановления кроветворения.

Пример №5 осуществляли аналогично примеру №4, однако стимулирующие вещества - ферментативные гидролизаты из морских гидробионтов вводили мышам в количестве 40 мкг (сухой) в течение 5 дней.

На 6-ые сутки мышей забивают декапитацией, селезенку извлекают и фиксируют в жидкости Буэна (насыщении раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40%-ный формалин - 15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносят в 70%-ный раствор этанола и подсчитывают колонии. Подсчет производится при помощи лупы х4.

Результаты эксперимента представлены в таблице.

Из таблицы следует, что введение ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов увеличивает число эндогенных колоний на селезенке в 1,7-2.9 раза, причем применение гидролизата из мидий дает наиболее высокий стимулирующий эффект, число колоний - 13,2±1,3.

Пример №6 осуществляли аналогично примеру №4, однако стимулирующие вещества - ферментативные гидролизаты вводили мышам в количестве 50 мкг (сухой) в течение 7 дней.

На 8-ые сутки мышей забивают декапитацией, селезенку извлекают и фиксируют в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40%-ный формалин - 15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносят в 70%-ный раствор этанола и подсчитывают колонии. Подсчет производится при помощи лупы х4.

Из таблицы следует, что введение ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов увеличивает число эндогенных колоний на селезенке в 2,4-3,8 раза, причем применение гидролизата из мидии дает наиболее высокий стимулирующий эффект, число колоний - 17,8±4,8.

Наблюдаемое увеличение числа эндогенных колоний связано с увеличением числа выживших кроветворных клеток-предшественников, необходимых для восстановления кроветворения. Введение стимулирующих веществ в количестве 50 мкг не дает более высокий стимулирующий эффект по сравнению с примером №4.

Изобретение относится к медицине, а именно к стимуляторам колониеобразования кроветворных клеток. Способ осуществляют путем введения животным ферментативного гидролизата из морских гидробионтов в количестве 40-50 мкг. Стимулирующее вещество вводят животным до или после облучения не менее 5-7 дней. Изобретение позволяет в 2-4 раза повысить эффективность колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке и ускорить восстановление кроветворения у животных после облучения. 2 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных путем введения животным стимулирующего вещества, отличающийся тем, что в качестве стимулирующего вещества применяют ферментативный гидролизат из морских гидробионтов в количестве 40-60 мкг, стимулирующее вещество вводят животным до облучения, причем последнюю дозу стимулирующего вещества вводят не позднее чем за 1,5 ч до облучения или после облучения, причем первую дозу стимулирующего вещества вводят не ранее чем через 1,5 ч после облучения.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стимулирующего вещества применяют ферментативный гидролизат из мидии, или из мантии морского гребешка, или из гонад морского гребешка.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимулирующее вещество вводят животным в течение 5-7 дней.