СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ КОЛОНИЕОБРАЗОВАНИЯ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В СЕЛЕЗЕНКЕ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2004 года по МПК A61K31/70 A61P7/06 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к стимуляторам колониеобразования кроветворных клеток, и может найти применение в клинической практике и радиобиологических экспериментах.

Известен способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке после облучения путем введения животным адреналина в количестве 0.1-0.07 мг/мышь (Радиобиология, 1984, т.24, №4, с.545-548). Недостатками данного способа являются низкое колониеобразование кроветворных клеток и использование для этого фармакологического препарата, имеющего определенные противопоказания.

Известен способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке путем введения животным через 2-4 часа после облучения трис(гидроксиметил)-аминометан в количестве 0,3-0,5 мл/мышь (SU, А.С. №1476644, МКИ 5 А 61 К 31/045).

Недостатком данного способа является применение химически чистого препарата, дальнейшее влияние которого на организм млекопитающих не изучено.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала стимулирующих средств, полученных из экологически чистого сырья, обладающих способностью повышать эффективность колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке после облучения животных.

Поставленная задача решается путем введения животным стимулирующего вещества, при этом в качестве стимулирующего вещества применяют дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) в количестве 40-60 мкг/мышь. Стимулирующее вещество вводят до или после облучения животных ежедневно в течение 5-7 дней, причем последнюю или первую дозу стимулирующего вещества вводят за 1,0-2,0 часа до или после облучения.

Дезоксирибонуклеиновая кислота - природный нуклеопротеид из молок рыб ТУ 9354-024-21428156-98.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве стимулятора для колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных используют дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из молок лососевых, в количестве 40-60 мкг, при этом стимулирующее вещество вводят животным ежедневно в течение 5-7 дней до или после облучения. Последнюю или первую дозу стимулирующего вещества вводят за 1,0-2,0 часа до или после облучения животных.

Применение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) как стимулятора колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке до или после облучения животных ранее не было известно.

Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критериям изобретения “Новизна” и “Изобретательский уровень”, так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники.

Сущность способа заключается в следующем.

Для оценки стимулирующего профилактического и лечебного действия дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) на кроветворные клетки-предшественники в селезенке при облучении животных были проведены экспериментальные исследования на белых беспородных мышах весом 18-20 г, в каждой группе не менее 10 животных. Эксперимент повторяли трижды.

В качестве определения профилактического действия дезоксирибонуклеиновой кислоты животным ежедневно в течение 5-7 дней за 1,0-2,0 часа до облучения вводили под кожу в область бедра ДНК в количестве 40-60 мкг, предварительно растворив ее в 0.85% физиологическом растворе. Затем мышей облучали на аппарате Рокус-М в дозе 7 Гр, при мощности дозы 0.9 Гр/мин.

В качестве определения лечебного действия дезоксирибонуклеиновой кислоты сначала животных облучали на аппарате Рокус-М в дозе 7 Гр, при мощности дозы 0.9 Гр/мин, затем животным ежедневно в течение 5-7 дней вводили под кожу в область бедра дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) в количестве 40-60 мкг, предварительно растворив ее в 0.85% физиологическом растворе, причем первую дозу ДНК вводили через 1.0-2.0 часа после облучения.

На восьмые сутки после применения дезоксирибонуклеиновой кислоты мышей умерщвляли декапитацией, извлекали селезенку и в течение двух часов фиксировали в жидкости Буэна. После фиксации подсчитывали число эндогенных колоний при помощи лупы.

Для подтверждения стимулирующего эффекта нового средства было проведено сравнительное исследование с введением животным 40-60 мкг физиологического раствора.

Дозировка дезоксирибонуклеиновой кислоты определена экспериментальным путем, так как полученные результаты свидетельствуют о том, что при уменьшении дозы менее 40 мкг стимулирующий эффект препарата незначительно отличается от контрольного, а при увеличении дозировки выше 60 мкг число колоний не нарастает, что свидетельствует об истощении компенсаторных возможностей и нецелесообразности дальнейшего увеличения дозы препарата.

Временная схема использования препарата обусловлена патофизиологическими законами развития адаптивных реакций живых организмов.

Введение стимулятора за 1.0-2.0 часа перед облучением или после облучения обеспечивает необходимую стимуляцию нейроиммуноэндокринной системы, что способствует повышению радиорезистентности организма.

Данные по влиянию дезоксирибонуклеиновой кислоты на число эндогенных колоний в зависимости от дозы препарата и продолжительности его применения представлены в таблице.

Из таблицы следует, что введение облученным мышам 40-60 мкг дезоксирибонуклеиновой кислоты увеличивает число эндогенных колоний на селезенке в 3,3 раза, а введение мышам 40-60 мкг дезоксирибонуклеиновой кислоты до облучения увеличивает число эндогенных колоний на селезенке в 2,5 раза.

Наблюдаемое увеличение числа эндогенных колоний связано с увеличением числа выживших кроветворных клеток-предшественников, необходимых для восстановления кроветворения, а также указывает на то, что дезоксирибонуклеиновая кислота в большей мере влияет на увеличение эндогенных колоний у облученных мышей и может быть использована более эффективно как лечебный препарат.

При введении животным физиологического раствора в количестве 40-60 мкг до облучения на 8-е сутки эндоколоний насчитывалось 8,1±1,5, после облучения 4,6±1,6.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1.

Эксперименты были выполнены на белых беспородных мышах-самцах весом 18-20 г, которых разделили на 2 группы по 10 особей в каждой.

1-я группа (контроль) - животным вводили физиологический раствор.

2-й группе вводили дезоксирибонуклеиновую кислоту в количестве 50 мкг в течение 6 дней. Дезоксирибонуклеиновую кислоту предварительно растворяют в 85% физиологическом растворе и вводят под кожу в область бедра раз в сутки, причем последнюю до облучения дозу вводят животным за 1.5 часа до облучения.

Затем мышей облучали в дозе 7.0 Гр, при мощности дозы 0.9 Гр/мин на аппарате Рокус-М. Доза подбирается заранее опытным путем и зависит от пола, породы и сезона.

На 7-е сутки мышей умерщвляли декапитацией, извлекали селезенку и фиксировали ее в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40% - формалин -15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносили в 70%-ный раствор этанола и подсчитывали колонии. Подсчет производили при помощи лупы.

Среднее количество эндогенных колоний при применении ДНКа составило 20,5±3,1 при применении физиологического раствора - 8,1±1,5.

Из таблицы следует, что введение дезоксирибонуклеиновой кислоты увеличивает число эндогенных колоний на селезенке по сравнению с контролем в 2.5 раза, причем применение ДНКа в качестве профилактического средства (за 1,5 часа до облучения) дает наиболее высокий стимулирующий эффект.

Пример 2 осуществляли аналогично примеру 1, однако ДНКа вводили мышам в количестве 40 мкг в течение 5 дней, а последнюю дозу за 1.0 часа до облучения.

На 6-е сутки мышей умерщвляли декапитацией, извлекали селезенку и фиксировали ее в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40% - формалин -15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносили в 70%-ный раствор этанола и подсчитывали колонии. Подсчет производили при помощи лупы.

Среднее количество эндогенных колоний составило 12,0±1,3, при применении физиологического раствора - 8,1±1,5.

Из таблицы следует, что введение дезоксирибонуклеиновой кислоты увеличивает число эндогенных колоний на селезенке по сравнению с контролем в 1.5 раза, причем применение ДНКа в качестве профилактики (за 1,0 часа до облучения) дает высокий стимулирующий эффект.

Пример 3 осуществляли аналогично примеру 1, однако ДНКа вводили мышам в количестве 60 мкг в течение 7 дней, а последнюю дозу - за 2.0 часа до облучения.

На 8-е сутки мышей умерщвляли декапитацией, извлекали селезенку и фиксировали ее в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40% - формалин -15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносили в 70%-ный раствор этанола и подсчитывали колонии. Подсчет производили при помощи лупы.

Среднее количество эндогенных колоний составило 19,1±3,3, при применении физиологического раствора - 8,1±1,5.

Из таблицы следует, что введение дезоксирибонуклеиновой кислоты увеличивает число эндогенных колоний на селезенке по сравнению с контролем в 2.3 раза, причем применение ДНКа в качестве профилактического средства (за 2,0 часа до облучения) дает высокий стимулирующий эффект, однако дальнейшего нарастания эндогенных колоний не происходит.

Пример 4.

Эксперименты были выполнены на белых беспородных мышах-самцах весом 18-20 г, которых разделили на 2 группы по 10 особей в каждой. Затем мышей облучали в дозе 7.0 Гр, при мощности дозы 0.9 Гр/мин на аппарате Рокус-М. Доза подбирается заранее опытным путем и зависит от пола, породы и сезона.

1-я группа (контроль) - животным вводили физиологический раствор.

2-й группе вводили дезоксирибонуклеиновую кислоту в количестве 50 мкг в течение 6 дней. Дезоксирибонуклеиновую кислоту предварительно растворяют в 85% физиологическом растворе и вводят под кожу в область бедра раз в сутки, причем первую после облучения дозу вводят животным через 1.5 часа после облучения.

На 7-е сутки мышей умерщвляли декапитацией, извлекали селезенку и фиксировали ее в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40% - формалин -15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносили в 70%-ный раствор этанола и подсчитывали колонии. Подсчет производили при помощи лупы.

Среднее количество эндогенных колоний составило 15,3±2,2, а при применении физиологического раствора - 4,6±1,6.

Из таблицы следует, что введение дезоксирибонуклеиновой кислоты увеличивает число эндогенных колоний на селезенке по сравнению с контролем в 3,3 раза, причем применение ДНКа в качестве лечебного средства через 1,5 часа после облучения дает наиболее высокий стимулирующий эффект.

Наблюдаемое увеличение числа эндогенных колоний связано с увеличением числа выживших кроветворных клеток-предшественников, необходимых для восстановления кроветворения.

Пример 5 осуществляли аналогично примеру 4, однако ДНКа вводили мышам в количестве 40 мкг в течение 5 дней, а первую дозу препарата вводили через 1.0 час после облучения.

На 6-е сутки мышей умерщвляли декапитацией, извлекали селезенку и фиксировали ее в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40% - формалин -15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносили в 70%-ный раствор этанола и подсчитывали колонии. Подсчет производили при помощи лупы.

Среднее количество эндогенных колоний составило 12,5±1,3, а при применении физиологического раствора - 4,6±1,6.

Из таблицы следует, что введение дезоксирибонуклеиновой кислоты увеличивает число эндогенных колоний на селезенке по сравнению с контролем в 2.1 раза, причем применение ДНКа в качестве лечения (через 1,0 час после облучения) дает высокий стимулирующий эффект.

Пример 6 осуществляли аналогично примеру 4, однако ДНКа вводили мышам в количестве 60 мкг в течение 7 дней, а первую дозу препарата вводили через 2.0 часа после облучения.

На 8-е сутки мышей умерщвляли декапитацией, извлекали селезенку и фиксировали ее в жидкости Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты в воде - уксусная кислота - 40% - формалин -15:15:1). После фиксации в течение суток селезенки переносили в 70%-ный раствор этанола и подсчитывали колонии. Подсчет производили при помощи лупы.

Среднее количество эдогенных колоний составило 14,7±1,5, а при применении физиологического раствора - 4,6±1,6.

Из таблицы следует, что введение дезоксирибонуклеиновой кислоты увеличивает число эндогенных колоний на селезенке по сравнению с контролем в 2.8 раза, причем применение ДНКа в качестве лечения (через 2,0 часа после облучения) дает высокий стимулирующий эффект, однако дальнейшего нарастания эндогенных колоний не происходит.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, может найти применение в радиобиологических экспериментах, а в дальнейшем в клинической практике. Стимулирование колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных осуществляют путем введения дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из молоки рыб. Препарат вводят до или после облучения ежедневно в дозе 40-60 мкг/мышь в течение 5-7 дней. При этом последнюю дозу препарата до облучения или первую дозу после облучения вводят за 1-2 часа соответственно до или после облучения. Способ обеспечивает повышение эффекта колониеобразования кроветворных клеток в селезенке при устранении побочного действия. 1 табл.

Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных путем введения животным стимулирующего вещества, отличающийся тем, что в качестве последнего используют ДНК, выделенную из молоки рыб, которую вводят до или после облучения ежедневно в дозе 40-60 мкг/мышь в течение 5-7 дней, причем последнюю дозу до облучения или первую дозу после облучения вводят за 1-2 ч соответственно до или после облучения.