СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В СЛЮНЕ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/66 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии.

Поскольку пировиноградная кислота (ПВК) является ключевым метаболитом цикла энергообеспечения, он может служить косвенным критерием оценки энергетического гомеостаза, показателем интенсивности гликолитических и окислительных превращений углеводов [1].

Наиболее близким к изобретению решением является определение ПВК в крови модифицированным методом Умбрайта [2].

Целью изобретения является определение пировиноградной кислоты (ПВК) в слюне.

Способ: ПВК слюны конденсируется с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием гидразона, который в щелочной среде дает коричнево-красный цвет раствора. По интенсивности его окраски судят о содержании ПВК.

Реактивы: Раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) - 10 г/100 мл.

Раствор 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ). 50 мг реактива растворяют в 10 мл концентрированной соляной кислоты при слабом подогревании смеси. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 50 мл. Хранят в холодильнике.

Раствор едкого натра - 12 г/100 мл.

Пировинограднокислый натрий (пируват натрия) - 1 ммоль/л.

Ход определения: 5,0 мл слюны центрифугируют при 3000 оборотов в течение 20 мин. Затем 0,3 мл ценрифугата смешивают с 0,7 мл дистиллированной воды и приливают 1 мл раствора ТХУ, перемешивая стеклянной палочкой. К полученной смеси прибавляют 0,4 мл раствора ДНФГ и на 20 мин помещают в темное место при комнатной температуре. По истечении этого срока в пробирку приливают 1 мл раствора едкого натра и через 5 мин определяют на фотоэлектролориметре (ФЭКе) оптическую плотность окрашенного реактива. В качестве компенсационной жидкости берут контрольный раствор, который готовят так же, как опытный, только вместо слюны используют воду. Колориметрируют пробы на ФЭКе с синим светофильтром в кюветах с толщиной слоя 5 мм. Количество ПВК в исследуемой пробе рассчитывают по калибровочной кривой.

Калибровочную кривую строят исходя из того, что 1 ммоль ПВК соответствует 88 мг.

Слюна для определения ПВК собиралась утром, натощак, после ополаскивания полости рта водой. Результаты проведенных нами 92 исследований показали, что предложенный способ характеризуется точностью и достоверностью.

Пример 1.

Халиуллин, ученик 1"в" класса 68 школы города Казани. После предварительного анкетирования и обследования выставлен Ds: Практически здоров. Слюна собиралась утром, натощак, после ополаскивания полости рта водой. Пировиноградная кислота слюны определялась следующим образом: 5,0 мл слюны центрифугировали при 3000 оборотов в течение 20 мин; затем 0,3 мл ценрифугата смешали с 0,7 мл дистиллированной воды и добавили 1 мл раствора ТХУ, перемешивая стеклянной палочкой; к полученной смеси прибавили 0,4 мл раствора ДНФГ и на 20 мин поместили в темное место при комнатной температуре; по истечении этого срока в пробирку добавили 1 мл раствора едкого натра и через 5 мин определили на фотоэлектролориметре (ФЭКе) оптическую плотность окрашенного реактива; в качестве компенсационной жидкости использовали контрольный раствор, который готовили так же, как опытный, только вместо слюны использовали воду; колориметрировали пробы на ФЭКе с синим светофильтром в кюветах с шириной слоя 5 мм; количество ПВК в исследуемой пробе рассчитывали по калибровочной кривой. Результат: пируват = 0,0768 ммоль/л.

Пример 2.

Бухтулова, ученица 3"г" класса 84 школы города Казани. После предварительного анкетирования и обследования выставлен Ds: Хронический гастродуоденит, период обострения. Слюна собиралась утром, натощак, после ополаскивания полости рта водой. Пировиноградная кислота слюны определялась следующим образом: 5,0 мл слюны центрифугировали при 3000 оборотов в течение 20 мин; затем 0,3 мл ценрифугата смешали с 0,7 мл дистиллированной воды и добавили 1 мл раствора ТХУ, перемешивая стеклянной палочкой; к полученной смеси прибавили 0,4 мл раствора ДНФГ и на 20 мин поместили в темное место при комнатной температуре; по истечении этого срока в пробирку добавили 1 мл раствора едкого натра и через 5 мин определили на фотоэлектролориметре (ФЭКе) оптическую плотность окрашенного реактива; в качестве компенсационной жидкости использовали контрольный раствор, который готовили так же, как опытный, только вместо слюны использовали воду; колориметрировали пробы на ФЭКе с синим светофильтром в кюветах с шириной слоя 5 мм; количество ПВК в исследуемой пробе рассчитывали по калибровочной кривой. Результат: пируват = 0,0889 ммоль/л.

Пример 3.

Шакурова, ученица 1"в" класса 68 школы города Казани. Ds: Практически здорова. Слюна собиралась утром, натощак, после ополаскивания полости рта водой. Пировиноградная кислота слюны определялась следующим образом: 5,0 мл слюны центрифугировали при 3000 оборотов в течение 20 мин; затем 0,3 мл ценрифугата смешали с 0,7 мл дистиллированной воды и добавили 1 мл раствора ТХУ, перемешивая стеклянной палочкой; к полученной смеси прибавили 0,4 мл раствора ДНФГ и на 20 мин поместили в темное место при комнатной температуре; по истечении этого срока в пробирку добавили 1 мл раствора едкого натра и через 5 мин определили на фотоэлектролориметре (ФЭКе) оптическую плотность окрашенного реактива; в качестве компенсационной жидкости использовали контрольный раствор, который готовили так же, как опытный, только вместо слюны использовали воду; колориметрировали пробы на ФЭКе с синим светофильтром в кюветах с шириной слоя 5 мм; количество ПВК в исследуемой пробе рассчитывали по калибровочной кривой. Результат: пируват = 0,0486 ммоль/л.

Источники информации

1. Большая Медицинская Энциклопедия. Гл. ред. Б.В.Петровский. - 3-е изд. - М. - 1982. - Т.19. - С.246.

2. Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. - Минск. - 1982. - С.198-199.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Способ обеспечивает простоту исследования при высокой точности определения пировиноградной кислоты. Проводят смешивание исследуемой пробы с трихлоруксусной кислотой (ТХУ), кондесацию с 2,4-динитрофенилгидразином, центрифугирование, определение оптической плотности с последующим расчетом пировиноградной кислоты по калибровочной кривой, при этом конденсируют с 2,4-динитрофенилгидразином пировиноградную кислоту слюны, а центрифугирование слюны осуществляют при 3000 об/мин в течение 20 минут перед смешиванием с ТХУ.

Способ определения пировиноградной кислоты путем смешивания исследуемой пробы с трихлоруксусной кислотой (ТХУ), кондесации с 2,4-динитрофенилгидразином, центрифугирования, определения оптической плотности с последующим расчетом пировиноградной кислоты по калибровочной кривой, отличающийся тем, что конденсируют с 2,4-динитрофенилгидразином пировиноградную кислоту слюны, а центрифугирование слюны осуществляют при 3000 об/мин в течение 20 мин перед смешиванием с ТХУ.