ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2004 года по МПК A61K31/404 A61P35/00 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса алканкарбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов.

Несмотря на существование в клинической практике более 60-ти противоопухолевых препаратов, эффективность большинства их них недостаточна и спектр онкологических заболеваний, чувствительных к химиотерапии, ограничен. Среди наиболее доступных и применяемых в настоящее время цитостатиков известны такие препараты, как цисплатин и 5-фторурацил, которые используются отдельно или в комплексной терапии рака желудка, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака печени (гепатомы), меланомы и др. (Противоопухолевая химиотерапия. Справочник/Под ред. Н.И.Переводчиковой. - М., 1996; Safit J.T., Bonavida В. //Cancer Res. 1992. V.52. P.630; Михайлов И.Б.// Настольная книга врача по клинической фармакологии - руководство для врачей. - СПб. - 2001. С. 615).

Как и большинство препаратов, используемых для лечения злокачественных заболеваний, цисплатин и 5-фторурацил обладают высокой токсичностью - при их применении, как правило, наблюдаются тошнота, рвота, выраженные нарушения функций почек, нарушения функций нервной системы, угнетение кроветворения и т.д. (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М. - 2001. С. 425-428).

Разработка новых, более активных в отношении злокачественных новообразований лекарственных средств, эффективных при опухолях с первичной или приобретенной резистентностью к известным противораковым препаратам, является актуальным направлением научных исследований в области современной фармакологии и онкологии.

Целью изобретения является создание нового противоопухолевого средства.

В качестве противоопухолевого средства предлагается использовать гетероциклическое соединение - трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты, которое обладает свойствами стабилизатора клеточных мембран (Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства ООО ″АБОЛмед″. - Сборник трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ. - Новосибирск. - 2002 г., стр. 179).

Сущность изобретения заключается в том, что была изучена противоопухолевая активность трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты (далее по тексту - ″соединение″) в системе in vitro на клетках опухолей различного типа, а также в системе in vivo на линиях мышей, которым перевивали клетки опухолей.

В качестве контрольных препаратов для проверки противоопухолевой активности соединения использовались цисплатин и 5-фторурацил.

Проведенные исследования показали, что исследуемое соединение проявляет в системе in vitro и in vivo выраженные противоопухолевые свойства.

В работе использовали клеточные опухолевые линии (Р 815, В16, L1210, Г27) и здоровых половозрелых животных - мыши С57В1/6 и СВА обоего пола, 8-, 10-недельного возраста, массой тела 18-20 г (разброс в группах животных по исходной массе тела не превышал ±10%). Контрольные и опытные животные были получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г.Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей в одной клетке) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Пример 1. Оценка противоопухолевых свойств соединения in vitro

Оценка противоопухолевых свойств соединения проводилась ³H-тимидиновым методом на клетках мастоцитомы Р 815, меланомы В16, лимфомы L1210 и гепатомы Г27. Клетки засевали в концентрации 10×10³ лунку, инкубировали с соединением в течении 24 часов, за 6 часов до конца инкубации вносили 1 мкКи Н³-тимидина. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester (′Titertek′). Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 10×10³ клеток (средние данные по триплету). Степень подавления роста опухолевых клеток под влиянием тестируемого соединения вычисляли по формуле: N=(опыт/контроль)·100%. В таблицах представлены данные по ингибиции пролиферативной активности опухолевых клеток под действием соединения относительно контрольных значений пролиферативной активности этих клеток.

Соединение испытывалось в дозах 5, 25, 50, 75, 100, 150 и 300 мкг/мл. В качестве контрольного противоопухолевого препарата использовали 5-фторурацил (5-ФУ) в дозе 5, 25 и 50 мкг/мл.

В таблице 1 и 2 представлены данные по цитотоксическому эффекту соединения in vitro на опухолевые клетки различного генеза.

Установлено, что в системе in vitro соединение оказывает дозозависимый цитотоксический (ингибирующий) эффект в отношении роста опухолевых клеток всех 4-х типов, причем максимальный эффект (89-99% подавления клеточного роста) наблюдался при дозах соединения 150-300 мкг/мл. В диапазоне доз от 5 до 50 мкг/мл соединение проявляло значительно больший ингибирующий эффект в отношении клеточных линий В17 и Г27, по сравнению с известным препаратом - 5-фторурацилом.

Таким образом, согласно результатам проведенных исследований в системе in vitro можно утверждать, что трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты является новым высокоэффективным средством, ингибирующим рост опухолевых клеток, которое в сравнимых дозах значительно превышает аналогичное действие 5-фторурацила.

Пример 2. Оценка противоопухолевых свойств соединения in vivo.

1. Влияние соединения на метастазирование клеток меланомы.

Клетки меланомы В16 внутривенно перевивали мышам C57BL/6 в дозе 200×10³мл.

Соединение в разных дозах вводили в течение 10-ти дней один раз в сутки внутрибрюшинно ежедневно (начиная с 1-го дня после перевивки меланомы В16). Проводили учет метастазов в легких на 15 день после перевивки клеток опухоли. В таблице 3 представлены данные по влиянию соединения на метастазирование клеток меланомы В16 в легкие.

Как видно из представленных в таблице 3 данных, соединение проявляет выраженные антиметастатические свойства в отношении клеток меланомы В16 в дозе 25 мг/кг.

2. Влияние соединения на метастазирование клеток гепатомы Г27 в сравнении с цисплатином

Мышам линии СВА внутривенно вводили клетки гепатомы Г27 в дозе 100×10³/мл. Учет метастазов в легких проводили на 26 день после перевивки опухоли. Для ингибиции процесса роста метастазов использовали цисплатин в дозе 5 мг/кг и соединение в дозе 10, 25 и 100 мг/кг. Цисплатин и соединение вводились один раз в сутки внутривенно ежедневно в течение 6 дней подряд, начиная со дня перевивки опухоли.

Как видно из таблицы 4, соединение в дозе 25 и 100 мг/кг, вводимое ежедневно внутривенно в течение 6 дней на 35% и 38% соответственно ингибирует процесс образования метастазов клеток гепатомы Г27 в легких, в то время как цисплатин в равнозначной терапевтической дозе (исходя из LD50 однократная доза цисплатина 5 мг/кг соответствует однократной дозе изучаемого соединения 100-250 мг/кг ) тормозит образование метастазов на 23,5% (т.е. в 1,6 раза менее эффективно).

3. Влияние комбинированного применения соединения с цисплатином на процесс метастазирования меланомы В 16 в легких

Клетки меланомы В16 внутривенно перевивали мышам C57BL/6 в дозе 100×10³/мл. При введении комбинации цисплатин + соединение использовали следующие дозы для каждого препарата (2,5 мг/кг цисплатина + 50 мг/кг соединения). Комбинацию препаратов вводили ежедневно один раз в сутки в течение 6-ти дней, начиная с первого дня после перевивки опухоли. В качестве альтернативы комбинации использовали цисплатин в дозе 5 мг/кг, а соединение в дозе 100 мг/кг.

Учет количества метастазов в легких проводили на 15 день после перевивки клеток опухоли. В таблице 5 представлены данные по влиянию комбинации цисплатин + соединение на процесс метастазирования клеток меланомы В16 в легких.

Как видно из представленных в табл. 5 данных, введение цисплатина в дозе 5 мг/кг на 49% тормозит метастазирование меланомы В 16 в легкие; введение соединения в дозе 100 мг/кг - на 26% соответственно, а комбинация цисплатина с соединением в половинных дозах - на 69% соответственно. Т.е. на модели метастазирования меланомы В 16 в легкие выявляется потенцирующий эффект комбинированного применения широко используемого в клинической онкологии препарата цисплатин и нового соединения - эффект комбинации меньше суммарного эффекта обоих комбинатов, но выше, чем при введении каждого из них. Учитывая то, что в изученной комбинации, доза высокотоксичного цисплатина была в два раза меньше по сравнению с терапевтической, предлагаемое соединение можно рассматривать в качестве перспективного противоопухолевого соединения для сочетанного применения с известными противораковыми средствами с целью уменьшения их терапевтической дозы (т.е. уменьшения вероятности проявления нежелательных побочных эффектов) и одновременного повышения противоопухолевого действия.

Проведенные в системах in vitro и in vivo исследования позволяют констатировать наличие у трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты наличие выраженной противоопухолевой активности. Данное соединение перспективно как самостоятельное противоопухолевое средство нового класса, так и как средство для комбинированного использования с другими противораковыми препаратами с целью потенцирования терапевтического эффекта.

Предложено: применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты, ранее известной как стабилизатор клеточных мембран, в качестве противоопухолевого средства, а также средства, тормозящего метастазирование. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения, а также потенцирует терапевтический эффект других противораковых препаратов. 5 табл.

Применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты в качестве противоопухолевого средства.