СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2005 года по МПК A61K31/405 A61P37/00 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам их класса арилгетероалканкарбоновых кислот и может быть использовано в фармакологии и медицине в качестве основы для создания лекарственного препарата для лечения аутоиммунных заболеваний (неспецифическом язвенном колите, ревматоидном полиартрите, красной волчанке, волчаночном нефрите, хроническом гепатите и др.), а также для профилактики и лечения отторжения трансплантата при пересадке органов, для подавления реакции трансплантат против хозяина при пересадке костного мозга.

Современная иммунофармакология уделяет пристальное внимание созданию новых препаратов, которые способны эффективно снижать проявления аутоиммунных реакций организма (лежащих в основе патогенеза широко распространенных заболеваний), поскольку номенклатура подобных лекарственных средств весьма ограничена.

В настоящее время в практической медицине для профилактики отторжения трансплантата при пересадке почки, сердца и других органов, а также при некоторых аутоиммунных заболеваниях, используется препарат Азатиоприн, обладающий противоопухолевыми и иммунодепрессивными свойствами (1). Данный препарат обладает рядом серьезных побочных эффектов (угнетает функцию костного мозга, вызывает лейкопению и агранулоцитоз, что требует еженедельного мониторинга за составом периферической крови; индуцирует развитие токсического гепатита и аллергических реакций и др).

С целью расширения арсенала синтетических лекарственных средств, которые подавляют выраженность иммунных реакций, предлагается использовать трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты в качестве нового препарата для лечения аутоиммунных заболеваний, а также для предупреждения развития реакции отторжения трансплантата при пересадке различных органов реципиенту.

Производные алканкарбоновых кислот обладают разнообразными биологическими эффектами. В частности, трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты обладает свойствами стабилизации клеточных мембран (“Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства ООО “АБОЛмед”. Сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ. Новосибирск, 2002. - Стр.179; www. abolmed.ru/pages/article33.htm). Известно использование ряда лекарственных препаратов, содержащих соли алканкарбоновых кислот, в качестве местных противовоспалительных и/или анальгетических средств (2, 3).

Сущность изобретения заключается в том, что были исследованы иммуномодулирующие свойства трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты по способности данного соединения влиять на количество белка в моче у мышей с иммунокомплексным гломерулонефритом, на количество антителообразующих клеток (IgM АОК) in vivo (первичный гуморальный иммунный ответ).

В работе использовали здоровых половозрелых самок мышей - гибридов (C57BL/6×DBA/2)F1 (B6D2F1), мышей гибридов (CBA×C57Bl/6)F1, самок мышей линии DBA/2, массой тела 18-20 г., из питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Модель иммунокомплексного гломерулонефрита (аутоиммунного заболевания) вызывали у самок B6D2F1 двукратньм с недельным интервалом внутривенным введением лимфоидных клеток от самок родительской линии DBA/2. Содержание белка в моче определяли калориметрически с красителем Kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie) на Titertec Multiscan, длина волны λ 570 nm. В опытах использовали мышей со стойкой протеинурией и содержанием белка 3 мг/мл и более (белок в моче определялся неоднократно) (4).

Полученные данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Влияние соединения в дозе 300 мг/кг на уровень белка в моче.

У мышей со стабильной протеинурией на протяжении 2-х месяцев и содержанием белка в моче от 3,0 до 6,5 мг/мл проведено курсовое введение соединения. Курс составил 5 ежедневных внутрибрюшинных инъекций в дозе 300 мг/кг. Через 5 дней после последнего введения соединения была измерена протеинурия. Установлено, что в 83% случаев (у 5 мышей из 6 мышей, использованных в опыте) наблюдается снижение протеинурии на 10; 18,5; 30,8; 45,2 и 55,6%, у одной мыши эффекта практически нет. В среднем по группе до лечения протеинурия составила 5,1 мг/мл, после лечения - 3,6 мг/мл, что достоверно ниже (Р<0,05), снижение по группе в среднем составило 32,0%.

Пример 2. Влияние соединения в дозе 5 мг/кг на уровень белка в моче.

Соединение в дозе 5 мг/кг вводили мышам per os ежедневно (один раз в день), курс составил 10 введений. Аналогичным образом и в такой же дозе (5 мг/кг) мышам вводили препарат сравнения азатиоприн. Измерение протеинурии проводили через сутки после последнего введения препаратов. В таблице 1 представлены данные о влиянии внутрижелудочного введения соединения в дозе 5 мг/кг на количество белка в моче в сравнении с азатиоприном.

Таблица 1.АзатиопринСоединениеБелок в моче до лечения
(мг/мл)Белок в моче после лечения
(мг/мл)% ингибицииБелок в моче до лечения
(мг/мл)Белок в моче после лечения
(мг/мл)% ингибиции5,95,21211,24,8589,513,6-438,96,4286,56,6-1,55,98,1-3714,65,2646,55,6147,610,1- 338,13,063

Как видно из таблицы 1, под влиянием азатиоприна снижение уровня содержания белка в моче наблюдалось только у 2-х из 5-ти мышей (т.е. в 40% случаев), в то время как соединение вызывало снижение протеинурии у 4-х из 5-ти мышей (т.е. в 80% случаев). Другими словами, исследуемое соединение, используемое в дозе 5 мг/кг, оказалось в два раза эффективнее по сравнению с известным препаратом - азатиоприном. В среднем процент ингибиции для соединения составил 41%.

Пример 3. Влияние соединения в дозе 10 мг/кг на уровень белка в моче.

Соединение в дозе 10 мг/кг вводили мышам per os ежедневно (один раз в день). Курс составил 10 введений. Аналогичным образом вводили препарат сравнения азатиоприн (в дозе 10 мг/кг). Измерение протеинурии проводили через сутки после последнего введения препаратов.

В таблице 2 представлены данные о влиянии внутрижелудочного введения соединения в дозе 10 мг/кг на содержание белка в моче в сравнении с азатиоприном.

Таблица 2.АзатиопринСоединениеБелок в моче до лечения (мг/мл)Белок в моче после лечения (мг/мл)% ингибицииБелок в моче до лечения (мг/мл)Белок в моче после лечения
(мг/мл)% ингибиции2,70,7843,01,8601,95,6-2904.05,0-253.91,8542,41,9214,63,5243,92,7314,12,1492,31.0573,91,562   

Как видно из таблицы 2, под влиянием азатиоприна у 5-ти из 6-ти мышей (в 83% случаев) наблюдалось снижение протеинурии (в среднем снижение составило 55%). Под влиянием соединения у 4-х мышей из 5-ти (в 80% случаев) наблюдается снижение протеинурии (в среднем снижение составило 42%).

Анализируя полученные данные можно заключить, что соединение, используемое в дозах 5 и 10 мг/кг в 80% случаев приводит к снижению белка в моче. Использование соединения в меньших дозах (5 и 10 мг/кг) более эффективно, чем в большой дозе (300 мг/кг). Дозы 5 и 10 мг/кг снижают протеинурию на 41 и 42% соответственно, тогда как доза 300 мг/кг - на 32%. В целом, полученные данные говорят о том, что соединение, используемое в дозе 5 и 10 мг/кг по эффективности не уступает широко используемому в клинической практике препарату азатиоприну (в дозе 5 мг/кг - эффективнее в 2 раза). Однако при сравнении соединения и азатиоприна по параметрам токсичности можно отметить, что соединение (LD₅₀=500 мг/кг) в двадцать раз менее токсично по сравнению с азатиоприном (LD₅₀=25 мг/кг). По данным литературы азатиоприн уже в дозе 10 мг/кг угнетает функции костного мозга, вызывает лейкопению и агранулоцитоз (1).

В используемой нами мышиной модели гломерулонефрита, иммунологическим субстратом, запускающим каскад нарушений в почках, является Т-зависимая поликлональная активация В-клеток, сопровождающаяся увеличением синтеза анти-ДНК антител, формированием иммунных комплексов, что приводит к системному иммунокомплексному воспалительному процессу в почках - нефриту и протеинурии. Такой тип повреждения почек сравним морфологически и функционально с тяжелым заболеванием человека - системной красной волчанкой (5). Подтверждением иммуномодулирующего эффекта соединения, т.е. его способности подавлять Т-зависимую активацию В-клеток, являются данные, изложенные в примере 4.

Пример 4. Влияние соединения на синтез IgM антител in vivo при активации В-клеток Т-зависимым антигеном - эритроцитами барана.

Животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5×10⁷/мышь. Со дня иммунизации вводили соединение внутрибрюшинно или per os ежедневно (в течение 4-х дней, один раз в сутки) в дозе 5 и 10 мг/кг. Количество IgM АОК в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом Cunningham (1968). Результаты выражали в абсолютном количестве IgM АОК в селезенке. Данные о влиянии соединения на число антителообразующих клеток (АОК) представлены в таблице 3.

Таблица 3.ГруппыЧисло АОК/ селезенкуСпособ введения соединенияВнутрижелудочноВнутрибрюшинноКонтроль4023 (n=15)6227 (n=12)Соединение в дозе: 5 мг/кг
10 мг/кг730* (n=16)
585* (n=15)1129* (n=14)
752* (n=15)

* достоверно, Р<0,05; n - количество животных

Как видно из таблицы 3, соединение, вне зависимости от способа введения, в несколько раз снижает в селезенке количество IgM антителообразующих клеток, т.е. эффективно подавляет Т-зависимую активацию В-лимфоцитов.

Таким образом, проведенные нами исследования позволяют говорить о том, что трис-(2-гидроксиэтил)аммониевая соль 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты, обладая выраженным свойством подавлять Т-зависимую активацию В-лимфоцитов (т.е. ингибировать основное патогенетическое звено механизма формирования и развития аутоиммунного процесса, на примере гломерулонефрита), является перспективньм химическим соединением для создания новых лекарственных средств с целью эффективного лечения аутоиммунных заболеваний.

Литература

1. Машковский М.Д. //Лекарственные средства.-2001.-С.197-200.

2. Патент Великобритании №2093693.

3. Патент США №4551475.

4. Kimura M., Gleichmann E. Depressed antibody responses to exogenous antigens in mice with lupus-like graft-versus-host diseases. //Clin. Immunol. and Immunopathol.-1987.-V.43.-N.1.-P.97-109.

5. Appleby P., Webber D.G., Bowen J.G. Murine chronic graft-versus-host disease as model of systemic lupus erythematosus.: Effect of immunosuppressive drugs on disease development.//Clin. and Exp. Immunol.-1989.-V.78.-N3.-P.449-453.

Предложено применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-бензилиндолил-З-тиоуксусной кислоты, ранее известной как стабилизатор клеточной мембраны, в качестве средства для лечения аутоиммунных заболеваний. Свойство трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты ингибировать Т-зависимую активацию В-лимфоцитов, в том числе в условиях угнетения функции костного мозга и лейкопении в организме позволит создать на ее основе новые фармакологические препараты для лечения аутоиммунных заболеваний, таких, например, как системная красная волчанка, ревматоидный полиартрит, отторжение трансплантата при пересадке органов или костного мозга. 3 табл.

Применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-бензилиндолил-3-тиоуксусной кислоты в качестве средства для лечения аутоиммунных заболеваний.