Штамм Streptomyces olivaceiscleroticus - продуцент противоопухолевого антибиотика оливомицина Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и биотехнологической промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего противоопухолевый антибиотик оливомицин.

Структура оливомицина

Антибиотик оливомицин по химическому строению является природным соединением группы ауреоловой кислоты (митрамицин, хромомицин) и одним из эффективных препаратов при лечении некоторых форм злокачественных новообразований. Оливомицин востребован как исходное сырье для получения полусинтетических дериватов (1, 2) и композиций фармацевтических препаратов (3) с улучшенными химиотерапевтическими свойствами, а также в качестве биохимического реагента в исследованиях по молекулярной биологии.

Предшествующий уровень техники

Известен штамм Streptomyces olivoreticuli № ИНА 7386 - продуцент антибиотика оливомицина (4), принятый в качестве прототипа. Недостатком данного штамма является невысокая антибиотическая активность - 700 мкг в 1 мл ферментационной жидкости.

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм - продуцент антибиотика оливомицина путем селекционного преобразования известного штамма в результате последовательного трехступенчатого воздействия физических (УФ-лучи) и химических (N-нитрозосоединения) мутагенов на споры известного штамма № ИНА 7386 и отбора активного мутантного штамма № ИНА 813 среди мутагенизированной популяции колоний актиномицета, выросших на фоне устойчивости к рифамицину SV (10 мкг/мл) и оливомицину (1500 мкг/мл).

Полученный новый штамм Streptomyces olivaceiscleroticus № ИНА 813 принят на национальное патентное депонирование в коллекции культур БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИ генетика под номером: штамм ВКПМ Ас-1976. Штамм Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976 обладает повышенной антибиотической активностью образования оливомицина (850 мкг в 1 мл ферментационной жидкости) и характеризуется следующими таксономическими, культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Таксономические, культурально-морфологические и физиологические признаки штамма Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976.

Таксономические признаки

Длительность выращивания для изучения таксономических признаков (7-21) суток при температуре 28°С.Для засева диагностических сред использовался споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глюкозо-аспарагиновом агаре или среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера. Данные приведены в Таблице №1.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами.

Морфологические признаки

Гифы воздушного мицелия прямые, спороносцы прямые, во вторичных мутовках споры овальные или продолговатые, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства

Аэроб. Растет при (24-37)°С, оптимум роста 28°С и диапазоне значений рН (5,0-10,0) с оптимум роста при рН 7,0; желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу не инвертирует, крахмал гидролизует слабо. На клетчатке не растет. Не восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на провокационной среде Треснера с лимоннокислым железом.

Использование источников углерода при росте на средах с неорганическим источником азота (на минеральной среде Придгейма-Готлиба ISP-9 с 1% ным источником углерода) хорошо утилизирует глюкозу и инозит; умеренно -фруктозу, рамнозу, раффинозу, маннит; слабо - арабинозу, сахарозу; не использует ксилозу и целлюлозу.

Антагонистические свойства

Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976 при испытании методом штриха на органическом агаре №2 Гаузе штамм обладает широким спектром антибиотического действия, подавляя рост грамположительных (Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus, Stafilococcus aureus) и грамотрицательных (Escherichia coli, Commomonas terrigena, Providencia stuarti) бактерий, а также дрожжеподобных грибков Candida albicans. Штамм фагоустойчив. Фаг в культуре отсутствует.

Хранение штамма

Штамм Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976 хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.

Определение антибиотической активности в ферментационной жидкости

Антибиотическая активность штамма Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976 при глубинном культивировании определяется луночным методом диффузии в агар (среда №2 Гаузе с органическим источником азота) с использованием в качестве тест-микроорганизма Bacillus subtilis АТСС 6633 и сравнением диаметров зон подавления бактериального роста образцами ферментационной жидкости с калибровочной кривой стандарта субстанции оливомицина (25-100 мкг/мл). Биологическая активность получаемой биосинтезом и химически очищенной субстанции оливомицина определяется трехдозным вариантом метода (ГФХ, стр. 949).

Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976 поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976 выращивают в течение 7-10 суток при 37°С на агаровой среде №2 Гаузе. Споровым материалом с мицелием (агаровый блочек 1 см² плотно выросшей культуры) засевают жидкую питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:

триптон 0,3 глюкоза 1,0

пептон 0,5

NaCl 0,5 вода водопроводная, рН до стерилизации 7,0-7,2.

Стерилизация в течение 30 мин при давлении 0,6 атм. и температуре 120°С.

Культивирование посевного материала в течение 24-48 часов при 28°С на круговой качалке со скоростью вращения 220-240 об/мин. Выросшим посевным мицелием засевают ферментационную питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:

соевая мука 3,0 глюкоза 3,0 NaCl 0,3 СаСО₃ 0,3 вода водопроводная, рН до стерилизации 7,0-7,2.

Стерилизация в течение 30 мин при давлении 0,6 атм. и температуре 120°С.

Количество посевного материала для инокуляции - (5-7) %. Длительность ферментации 120-144 час.

Ферментационное культивирование проводят при 28°С на фуговой качалке со скоростью вращения 220-240 об/мин. Антибиотик оливомицин накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотическая активность штамма Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976, определенная биологическим методом диффузии а агар, составляет к окончанию ферментации (144 час) 850 мкг/мл. Выделение антибиотика из нативного раствора проводят экстракционным способом (5).

Таким образом, получен новый мутантный штамм Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976, отличающийся от известного по способности антибиотикообразования, которая более чем на 20% превосходит активность продуцента - прототипа (Таблица 2).

Использование нового штамма Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976 позволит увеличить выход целевого продукта (субстанции оливомицина) при его лабораторном и промышленном биотехнологическом производстве для нужд медицины.

Источники информации

1. А.Н. Тевяшова, Е.Н. Бычкова, Л.Г. Деженкова, А.Е. Щекотихин. Разработка лекарственной формы нового противоопухолевого полусинтетического антибиотика оливомицина. Химико-фармацевический журнал, 2018, 52, №11, 42-47.

2. И.Д. Трещалин, М.И. Трещалин, А.Н. Тевяшова, Э.Р. Переверзева. Противоопухолевая активность и токсические свойства лекарственной формы оливамида - нового полусинтетического производного оливомицина А. Химико-фармацевтический журнал, 2018, 52, №11, 27-31.

3. Патент RU 2662087 от 07.2018 г.

4. Авторское свидетельство SU 1056637 от 07.1983 г.

5. Авторское свидетельство SU 1374768 от 10.1987 г.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Streptomyces olivaceiscleroticus ИНА 813, обладающий повышенной антибиотической активностью образования оливомицина, депонирован в коллекции культур БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-1976. Штамм Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ас-1976 может быть использован при производстве антибиотика оливомицина. Изобретение позволяет повысить выход антибиотика оливомицина. 2 табл., 1 пр.

Штамм Streptomyces olivaceiscleroticus ВКПМ Ac-1976 - продуцент противоопухолевого антибиотика оливомицина.