данным ДНК-ДНК блот-гибридизации содержащий НВс-ген вируса гепатита В.
При размножении v7,5C на развивающихся куриных эмбрионах характер поражений на хориоаллантоисных оболочках такой же, как и при размножении исходного штамма ЛИВП. Кроме того, штамм v7,5C не отличается по продуктивности в монослое перевиваемых линий клеток CV-1, Rat-2, a также в монослое фибробластов эмбрионов кур. В отличие от штамма ЛИВП рекомби- нант v7,5C обладает tk-фенотипом, не способен к размножению на перевиваемой линии клеток Rat-2 в присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина.
Патогенность для животных.
Исследование свойств штамма v7,5C на лабораторных животных показало, что в стандартных тестах на токсичность, безвредность, некротическую активность, спе- цифичность, рекомбинантный штамм v7,5C не отличается от исходного штамма ЛИВП.
Иммуно-биологические свойства штамма v7,5C.
Штамм v7,5C высокоиммуногенен, он вызывает гуморальный иммунный ответ - анти-НВс- и анти - ВОВ-антитела при иммунизации кроликов в дозе 2x108 ООЕ/живо- тное. Антитела определяют методом иммуно-ферментного анализа.
Помимо индукции специфического ан- тителообразования, иммунизация штаммом v7,5C вызывает и ярко выраженный клеточный ответ на НВсАд по сравнению с исходным штаммом ЛИВП. Клеточный иммунный ответ оценивают с помощью реакции бласт- трансформации лимфоцитов (РБТЛ).
Основным отличием штамма v7,5C от ЛИВП является способность к синтезу НВсАд при инфицировании культуры клеток CV-1. Индикацию экспрессии осуществляют с помощью метода иммуно-ферментного анализа.
Штамм описанного рекомбинанта v7,5C (pVAR 15/Sty 1/HBcAg) депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР за номером ГКВ № 2208 от 15.11.89 г.
Изобретение иллюстрируется следую- щими примерами:
Пример 1. Получение рекомбинант- ного вируса осповакцины, экспрессирую- щего НВс-ген вируса гепатита В и анализ уровня экспрессии НВсАд.
Кубарики с монослоем перевиваемой линии клеток почек зеленой мартышки линии CV-1 заражают вирусом осповакцины штамма ЛИВП с множественностью 0,05- 0,1 БОЕ/кл. Адсорбцию проводят при 37°С
1 ч, затем удаляют неадсорбированный вирус и клетки покрывают поддерживающей средой (Игла ДМЕМ с 2% эмбриональной сыворотки). Через 1 ч инкубации при 37°С поддерживающую среду сливают и на клетки наносят по 0,5 мл/кубарик кальций-преципитата ДНК рекомбинантной плазмиды (р7,5С) и ДНК вируса осповакцины ЛИВП и инкубируют при комнатной температуре 45 мин. Затем клетки покрывают 4,5 мл среды Игла ДМЕМ с 8% эмбриональной сыворотки и инкубируют при 37°С 3,5 ч. После этого среду заменяют на свежую с 8% эмбриональной сыворотки и клетки инкубируют еще 18-24 ч. Урожай вируса после трэнсфек- ции замораживают, оттаивают и раститро- вывают на TK Rat-2 клетках в присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина под агаровым покрытием. Через 48 часов инкубации наносят второе покрытие с 0,002% красителя нейтрального красного. Вирусы,полученные из отдельных бляшек, подращивают в 24-луночных пластиковых платах ( лунки 16 мм) и анализируют методом ДНК-ДНК дот-гибридизации на наличие чужеродной ДНК. Положительные по гибридизации клоны дважды клонируют и анализируют экспрессию генов вируса гепатита В в составе ДНК рекомбинантных вирусов осповакцины.
С этой целью монослой CV-1 в 24-луночных платах (tf лунки 16 мм) инфицируют рекомбинантным вирусом осповакцины со множественностью 20 БОЕ/кл, проводят адсорбцию вируса при 37°С 1 ч, после чего удаляют неадсорбированный вирус, монослой промывают средой Игла ДМЕМ, после чего в каждую лунку добавляют по 1 мл среды Игла ДМЕМ с 2% эмбриональной сыворотки. Зараженные клетки инкубируют 24 ч при 37°С в присутствии 5% С02. Культу- ральную жидкость отбирают в пробирки и тестируют экспрессию НВсАд вируса гепатита В. Оставшиеся клетки заливают 1 мл среды. Игла ДМЕМ, двухкратно замораживают и оттаивают, отрабатывают ультразвуком дважды по 10 сек. Полученные таким образом лизаты клеток тестируют на экспрессию НВсАд твердофазным иммунофер- ментным методом.
Было обнаружено, что в лунках клеток через 48 ч после замораживания содержится НВсАд в количестве 600 нг/мл на 106 инфицированных клеток при полном цито- патическом действии, что свидетельствует о высоком уровне экспрессии корового белка вируса гепатита В.
П р и м е р 2, Характеристика иммуноби- ологических свойств рекомбинантного штамма v7,5C.
Индукцию специфического антителооб- разования (анти-НВс-антител) изучают, сравнивая иммунизацию кроликов вирусным рекомбинантом v7,5C в сравнении с иммунизацией ВОВ штамма ЛИВП вирусным методом накожной скарификации в дозе 2х108 БОЕ/животное. Взятие крови проводят до иммунизации и через 2, 3, 4, 6 и 11 недель после нее.
Анализ полученных сывороток на наличие антител против НВсАд проводят прямым и конкурентным иммуноферментным методами. Для этого НВсАд сорбируют в лунках 96-луночного планшета, затем добавляют разведения сывороток и инкубируют в течение 18 часов при 20°С. После инкубации лунки промывают и проявляют связавшиеся антитела конъюгатом белка А с пероксидазой хрена с последующей окраской ортофенилендиамином. Интенсивность окраски измеряют по поглощению света при длине волны 405 нм. Титр антител определяют по максимальному разведению сыворотки, дающему двухкратное превышение оптической плотности по сравнению с чистой сывороткой (до иммунизации).
В табл. 1 приведены данные по определению анти-HBcAg прямым иммуноферментным методом.
В табл.1 приведены средние данные трех определений, ошибка во всех случаях не превышает ± 5% для L 0,95.
Как видно из полученных данных, только у одного кролика из четырех, иммунизированных вирусом v7,5C, а также у кролика, инфицированного вирусом осповакцины (L- ИВП), не было обнаружено антител против НВсАд. Остальные 3 кролика индуцируют гуморальный иммунный ответ на введение НВсАд вируса гепатита В. Причем у первого кролика анти-НВс-антитела определяются со второй недели по шестую в титре 1:900, а у третьего и четвертого кроликов титры антител достигают 1:2700, 1:8100 и сохраняются в течение 11 недель.
Полученные данные подтверждаются конкурентным иммуноферментным методом в тест-системе на анти-НВс-антитела производства фирмы La Roche (Франция). В этом случае сыворотки иммунизированных кроликов исследуют на способность по- давлять связывание анти-HBcAg-lgG, меченных пероксидазой хрена, с сорбированным НВсАд. Наличие анти-НВс-антител в тестируемых сыворотках определяют по уменьшению оптической плотности в пробах (А 405) ниже 0,73. Пробы с А 405 выше 0,73 считаются отрицательными и, соответственно, не содержат антитела против НВсАд вируса гепатита В.
Результаты по выявлению анти-НВс-антител конкуретным методом представлены в табл.2.
В табл.2 приведены средние данные 5 трех определений, ошибка во всех случаях не превышает ± 5% для L 0,95.
Как видно из табл.2, данные, полученные конкурентным иммуноферментным методом, полностью подтверждают резуль0 таты исследования сывороток иммунизированных кроликов прямым иммуноферментным методом.
Для оценки уровня клеточного, ответа мышей линии BALB/c, рекомендованной
5 ВОЗ для испытания иммуногенности вакцин против гепатита В, с массой 8-10 г иммунизируют вирусной суспензией рекомбинанта v7,5C и ВОВ штамма ЛИВП в корень хвоста в дозе 4,0 107 ООЕ/мышь,
0 Спленоциты, получаемые из селезенки, выделяют на 9-е сутки после иммунизации для постановки РБТЛ.
Уровень клеточного иммунного ответа оценивают по коэффициентам РБТЛ. опре5 деляемых по отношению среднего количества имп/мин с антигеном и без него. Для этого с-терильно извлеченные селезенки, измельчают в стеклянном гомогенизаторе, трижды отмывают в питательной среде, и,
0 определив количество спленоцитов в камере Горяева, разводят с тем расчетом, чтобы в каждую лунку 96-луночной планшеты попадало 10 спленоцитов, Культивируют в С02-инкубаторе с 5% СОа при 37°С в тече5 ние 4-5 сут в среде РРМ1-1640 с добавлением 1-глутамина (300 мкг/мл), гентамицина (160 мкг/мл), 2-меркаптоэтанола (5 10 М) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки. В лунки также добавляют митогены: неспеци0 фический-конканавалин А (по 2,5 и 25 мкг на лунку), и специфические - ВОВ штамм ЛИВП в натрий-фосфатном буфере (в концентрации 25 мкг на лунку) и НВсАд (по 0,1:1 и 10 мкг на лунку).
5
Результаты оценивают по включению Н -тимидина, добавленного за 18 ч до окончания культивирования в дозе 1 мкКи на лунку. Контролем служат лунки, несодержа0 щие митоген.
После инкубации с Н3-тимидином клетки осаждают на фильтры GFF, промывают 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и раствором этанола. Фильтры с фикси5 рованными на них мечеными клетками просушивают и помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью (0,5% 2,5-ди-. фенилоксазол (РРО) и 0,03% 1,4-Пз-2-(5-фе- нилоксазолил-бензен (РОРОР) в толуле) для
регистрации включения Н -тимидина на счетчике.
Результат оценивают, рассчитывая коэффициент усиления или ингибироваиия включения Н -тимидина в пробах с внесен- ным митогеном и без него (контролем по их отношению. Результаты представлены в табл.3).
Представлены коэффициенты бластт- рансформации лимфоцитов. Ошибка не пре- вышает 10% для L 0,95.
Как видно из табл.3 рекомбинантный штамм вируса осповакцины v7,5C инфицирует образование клонов, сенсибилизированных к НВсАд лимфоцитов, что указывает на наличие выраженного специфического клеточного иммунного ответа нз НВсАд у животных, иммунизированных рекомбинан- том v7,5C, по сравнению с контрольными животными (интактными и иммунизирован- нымм ВОВ штамм ЛИЗП).
П р и м е р 3. Характеристика патогенных и некоторых биологических свойств штамма v7,5C.
При подкожном введении вирусной сус- пензии рекомбинантного штамма ВОВ V7,5C множественностью 5 .10 ООЁ/мышь в стерильном физиологическом растворе в объеме 0,2 мл не отмечается никаких патологических изменений в течение 5 дней наблюдения после введения, что свидетельствует о безвредности штамма (наблюдались 2 группы беспородных мышей по 10 животных каждая).
На скарифицированной коже кроликов штамм v7,5C образует типичные вакцинальные оспины на 5-7-е сутки, что свидетельствует о специфичности штамма. Тест проводят на трех белокожих кроликах массой 2,5- 3,5 кг. На скарифицированных участках кожи кроликов площадью 5 см наносят и тщательно втирают соответственно по 0,1 мл вирусной суспензии в дозах 10 , 10 , 10 (ООЕ/мл). Через 5-7 сут хотя бы на одном из зараженных участков кожи должны образоваться типичные вакцинальные оспины,что и наблюдалось.
Для проверки некротической активности штамма v7,5C, вирусную суспензию вводят внутрикожно на скарифицированные участки кожи кроликов (используется 2 животных) в двух местах в дозе Ю4 ООЕ/0,1 мл; на 4-5-е сутки некрозов в месте введения не наблюдается, следовательно рекомбинант v7,5C не обладает нехротирующей активностью. Изученные свойства не отличаются от тактовых исходного штамма ВОВ ЛИВП.
Таким образом, впервые получен штамм рекомбинантного вируса осповакци- ны, обеспечивающий экспрессию С-гена вируса гепатита .В а клетках млекопитающих. Применение рекомбинантного штамма v7,5C представляется перспективным в сочетании с другим штаммом рекомбинантного ВОВ в 7,5S2-S, экспрессирующим preSa и HBsAg, оказавшимся весьма эффективным. Такое комбинирование могло бы привести к значительному усилению иммунного эффекта вакцинации против гепатита В.
Формула изобретения Штамм рекомбинантного вируса осповакцины v7,5C ГКВ-2208 - продуцент карового антигена вируса гепатита В.
Определение антител к НВсАд вируса гепатита В прямым иммун оферментным методом
Обозначения; - - отсутствие анти-НВсАд; и.о. - не определялось.
Таблица 1
Таблица 2 Определение антител против НВсАд конкурентным иммуноферментным методом
Обозначения: н.о, - не определялось.
Индукция клеточного ответа сенсибилизированными спленоцитами мышей, иммунизированных v7,5C и ВОВ штамм ЛИВП
Таблица 3
