СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/205 A61P31/12 

Описание патента на изобретение RU2244557C2

Изобретение относится к области биотехнологии вирусных препаратов и может быть использовано в ветеринарии для профилактики бешенства среди животных.

В современной биотехнологии антирабических вирусных препаратов используют различные вакцинные штаммы (Внуково-32, Щелково-51, Тс-80, РВ-97 и др.), которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах ВНК-21, ПС, Vero., и др., применяя различные методические приемы культивирования - стационарный, роллерный, суспензионный [R.Barth, V.Franke, M.A.Selimov Vnukovo-32 primary hamster kidney cell vaccines for humans. //Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization, Geneva 1996, C.310-313; Вишняков И.Ф., Никишин И.В., Недосеков В.В. Инактивированная культуральная вакцина против бешенства//Ветеринария. – 1998 - №1 С.22-24; Патент 2077338 от 20.4.97. г. Никишин И.В., Вишняков И.Ф., Горшкова Т.Ф., Стрельцов Л.Ф., Жестерев В.И.; Иванов B.C. Бешенство животных: эксперементально-теоретическое обоснование разработки, производства, применения культуральных инактивированных вакцин и новые подходы к проблеме экстренной защиты ЦНС от возбудителя заболевания: Автореф. дис. д-ра вет. наук: М. 2001-20 с; Гочмурадов М.Г. Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. канд. вет. наук: Владимир 1999-33 с.].

Известные способы получения вирусного сырья для изготовления инактивированных антирабических вакцин являются весьма трудоемкими, экономически не эффективными и не позволяют получать без дополнительных технологических приемов профилактические препараты требуемой биологической активности (низкое накопление инфекционной и антигенной активности).

Наиболее близким аналогом является способ получения инактивированной антирабической вакцины из штамма (РВ-97) в суспензии клеток ВНК-21 с использованием инактиванта димерэтиленимина (Гочмурадов М.Г., Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. канд. вет. наук: Владимир 1999-33 с.).

Однако существующий способ приготовления вакцинного препарата технологически объемный и не позволяет получать на первичных этапах сырье требуемой биологической активности (инфекционная активность 6,0-6.5 lg ЛД50/мл, антигенная активность <1МЕ).

Первоначально проводят подращивание клеток ВНК-21 до 1.2-1.8 млн. кл/мл; затем заражение их вирусом бешенства. Полученное вирусное сырье концентрируют в 2-3 раза до получения необходимой антигенной активности и инактивируют димерэтиленимином.

В процессе выполняемых технологических этапов проводят 1-2 раза смену дорогостоящих питательных сред (Игла-МЕМ), вводят дополнительные этапы обработки - сепарирование, концентрирование и используют инактиванты, которые требуют особых условий работы с ними, поскольку высоко токсичны и сильные мутагены для работающего персонала (димерэтиленимин).

Целью изобретения является разработка и усовершенствование технологичного способа изготовления инактивированной вакцины против бешенства для животных без снижения ее иммунобиологических характеристик.

Поставленная цель достигается тем, что способ включает культивирование вируса бешенства, инактивацию и конструирование вакцины, при этом в качестве вируссодержащего материала используют вакцинный штамм вируса бешенства РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ), который вносят в количестве 0.1-0.01 МВД50/клетку одновременно с клетками ВНК-21 в концентрации 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии в среде 0.25% ФГМ при 37°С при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток, вирусное сырье инактивируют 0.01% 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом при 37°С в течение 3 суток и добавляют 10-20% 6%-го ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0.6-0.9%.

Штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) получен из исходного “овечий” ВГНКИ - 80 пассаж в мозге овец и адаптирован к культуре клеток почки кролика и культуре клеток куриных фибробластов. Инфекционная активность штамма 4,5-5,5 lg МДД50/мл. Вирус вызывает образование антител у домашних и диких животных при оральном и парантеральном введении. Патогенен для лабораторных животных мышей и кроликов при внутримозговом заражении (Ковалев Н.А и др. Авторское свидетельство №1091393 от 08.01.1984 г.). Вирус вносят в культуральный сосуд одновременно с клетками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии.

Культивирование проводят в суспензионной среде 0,25% ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании содержимого. Полученное вирусное сырье имеет инфекционную (6.5-6.8 lg МЛД50/мл) и антигенную активность (1.5-2.0 ME), достаточную для использования его в вакцине без дополнительных технологических приемов (сепарирование, концентрирование).

Инактивацию вируса проводят безопасным и устойчивым препаратом 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодекан - (А-24) в концентрации 0.01-0.1% при 37°С в течение 3 суток.

В качестве адъюванта добавляют 10-20% 6% ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0.6-0.9%.

Пример конкретного выполнения.

Выращивание вируса бешенства штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) проводят в культуре ВНК-21 с концентрацией 0.5-0.6 млн. кл/мл с одновременным внесением вируса в дозе 0.1-0.01 МЛД50/кл в суспензионной среде 0,25% ФГМ в ферментерах реакторного типа при температуре 37°С и постоянном перемешивании содержимого, и автоматическом поддержанием рН среды в пределах 7.2-7.6. В течение первых трех суток наблюдается повышение концентрации инфицированных клеток до 1.5-2.5 млн. кл/мл, затем постепенная их гибель. Культивирование прекращают, когда жизнеспособных клеток во взвеси остается 18-20%. Время культивирования - 6 суток. Инфекционная активность вируса бешенства штамма РБ-71 к этому времени составляет 6.5-6.8 lg МДЦ50/мл. Антигенная активность вирусного сырья из штамма РБ-71 составляет 1:90-1:270 в реакции ИФА. Полученное вирусное сырье инактивировали А-24 в концентрации 0.01-0.1% в течение 3 суток при 37°С, затем добавляли 6% 10-20% гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 0.6% (таблица №1).

Таблица №1Сравнительная характеристика способов изготовления инактивированной вакцины против бешенстваЭтапы работыПредлагаемый способПрототипШтамм вирусаРБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ)РВ-97Культура клетокВНК-21/13ВНК-21/2Посадочная концентрация клеток0.5 млн.кл/мл0.5 млн.кл/млПодращивание культуры:  время 1-2 сутокконцентрация 1.8-20 млн. кл/млЗаражение вирусом: доза0.1-0.01 МЛД50/кл0.5-1.0 ЛД50/клВремя культивирования5-6 суток5 сутокИнфекционная активность (lg МЛД50/мл)6.5-6.86.0-6.5ИнактивантА-24
(0.01, 37°С, 3 суток)
Димерэтиленимин
(0.1-0.3, 37°С, 24 часа)
Стабилизатор-ФеракрилАдъювантГОА-

Использование предлагаемой технологии изготовления инактивированной вакцины против бешенства по сравнению с существующим способом имеет следующие преимущества.

1. Сокращает время получения вирусного сырья на 1-2 суток за счет одновременного внесения клеток и вируса в реактор.

2. Уменьшает расход дорогостоящей питательной среды в 2 раза за счет исключения этапа смены среды.

3. Снижает расход вирусного сырья в 5-10 раз и повышает накопление антигенной активности в вирусном сырье, достаточной для использования его для изготовления эффективного инактивированного препарата.

4. Исключает использование дополнительных технологических приемов - осаждение клеток, сепарирование, концентрирование без снижения характеристик получаемой вакцины.

5. Позволяет заменить импортную среду Игла MEM на не менее эффективную отечественную питательную среду из ферментативного гидролизата мышц (ФГМ).

Похожие патенты RU2244557C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ 1994
  • Никишин И.В.
  • Вишняков И.Ф.
  • Горшкова Т.Ф.
  • Стрельцов Л.Ф.
  • Жестерев В.И.
RU2077338C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ПРИ БЕЗОПОРНОМ ВЫРАЩИВАНИИ КЛЕТОК И РЕПРОДУКЦИИ В НИХ ВИРУСА В УКОРОЧЕННОМ ЦИКЛЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 2012
  • Рахманин Павел Петрович
  • Захарченко Олег Сергеевич
  • Крюков Сергей Вениаминович
  • Христюк Александр Александрович
  • Гусев Виталий Николаевич
  • Чудин Олег Васильевич
RU2537183C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ 2013
  • Самуйленко Анатолий Яковлевич
  • Зенов Николай Иванович
  • Красуткин Сергей Николаевич
  • Мельник Николай Васильевич
  • Пухова Нина Михайловна
  • Литенкова Ирина Юрьевна
  • Елисеев Анатолий Константинович
  • Абрашин Евгений Васильевич
  • Кожушко Маргарита Юрьевна
  • Маслов Евгений Витальевич
  • Хайкина Людмила Сергеевна
  • Иванова Александра Федоровна
  • Красуткина Светлана Владимировна
RU2538617C2
ВАКЦИНА ПРОТИВ ЧУМЫ, АДЕНОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ПАРВОВИРУСНОГО И КОРОНАВИРУСНОГО ЭНТЕРИТОВ, ЛЕПТОСПИРОЗА И БЕШЕНСТВА СОБАК 2013
  • Непоклонов Евгений Анатольевич
  • Алипер Тарас Иванович
  • Мусиенко Мария Ивановна
  • Соболева Галина Леонидовна
  • Мухин Алексей Николаевич
RU2546247C2
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАКЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 1993
  • Закутский Н.И.
  • Жестерев В.И.
  • Вишняков И.Ф.
  • Юрков С.Г.
RU2090210C1
СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ 2003
  • Сливко И.А.
  • Недосеков В.В.
  • Жестерев В.И.
  • Горшкова Т.Ф.
  • Курильчук Ю.Н.
  • Анисимова Л.И.
  • Жданова Н.А.
  • Баньковский Д.О.
  • Лаптева О.Г.
  • Хухоров И.Ю.
  • Ногина И.В.
RU2254575C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА 2023
  • Сокол Ольга Олеговна
  • Мехда Юсеф
  • Матвеева Ирина Николаевна
  • Никулин Артем Евгеньевич
  • Сивков Михаил Андреевич
RU2816765C1
Бессывороточная среда "ВНИИЗЖ" для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин 2021
  • Доронин Максим Игоревич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Гусева Марина Николаевна
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Луговская Наталия Николаевна
RU2770814C1
Вакцина антирабическая инактивированная эмульсионная культуральная для профилактической иммунизации домашних плотоядных и сельскохозяйственных животных 2019
  • Лозовой Дмитрий Анатольевич
  • Михалишин Дмитрий Валерьевич
  • Борисов Алексей Валерьевич
  • Доронин Максим Игоревич
  • Балашов Андрей Николаевич
  • Стариков Вячеслав Алексеевич
RU2722868C1
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БЛЮТАНГА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА (ВАРИАНТЫ) И ВАКЦИНА ПРОТИВ БЛЮТАНГА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА 2008
  • Колбасов Денис Владимирович
  • Шурыгин Александр Иванович
  • Малышева Вера Ивановна
  • Чудин Олег Васильевич
  • Зенов Николай Иванович
  • Красуткин Сергей Николаевич
  • Мельник Николай Васильевич
  • Луницын Андрей Иванович
  • Литенкова Ирина Юрьевна
  • Рахманин Павел Петрович
  • Крюков Сергей Вениаминович
  • Тренев Василий Николаевич
  • Соловьев Борис Васильевич
  • Балашов Владимир Григорьевич
  • Кузнецов Дмитрий Павлович
  • Лозовой Дмитрий Анатольевич
  • Охапкин Сергей Сергеевич
  • Дорохин Владимир Васильевич
RU2391114C1

Реферат патента 2005 года СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области биотехнологии вирусных препаратов. Используют штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) вируса бешенства, который вносят в культуральный сосуд (0.1-0.01 МЛД50/клетку) одновременно с катками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток (0.5-0.6 млн. кл/мл) и выращивают в суспензии. Культивирование проводят в суспензионной среде ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании и поддержании рН 7.2-7.4. Полученное вирусное сырье с инфекционной 6.5-6.8 lg МЛД50/мл и антигенной активностью 1:90-270 инактивируют 1,8,36-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом 0.01% при 37°С 3 суток. Готовый вакцинный препарат соответствует требованием стандарта для ветеринарных препаратов и обладает активностью 1.5-2.0 ME. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 244 557 C2

Способ изготовления антирабической инактивированной вакцины, включающий культивирование вируса бешенства, инактивацию и конструирование вакцины, отличающийся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют вакцинный штамм вируса бешенства РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ), который вносят в количестве 0,1-0,01 МЛД50/клетку одновременно с клетками ВНК-21 в концентрации 0,5-0,6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии в среде 0,25% ФГМ при 37°С при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток, вирусное сырье инактивируют 0,01%-ным 1,8,36-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом при 37°С в течение 3 суток и добавляют 10-20% 6% гидроокиси алюминия до конечной концентрации сухого остатка 0,6-0,9%.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2005 года RU2244557C2

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ 1994
  • Никишин И.В.
  • Вишняков И.Ф.
  • Горшкова Т.Ф.
  • Стрельцов Л.Ф.
  • Жестерев В.И.
RU2077338C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ 2001
  • Скичко Н.Д.
  • Красуткин С.Н.
  • Мельник Н.В.
  • Иванов В.С.
  • Зенов Н.И.
RU2191600C1

RU 2 244 557 C2

Авторы

Жестерев В.И.

Горшкова Т.Ф.

Лаптева О.Г.

Балышева В.И.

Хрипунов Е.М.

Ковалев Николай Андреевич

Усеня Михаил Михайлович

Даты

2005-01-20Публикация

2003-01-21Подача