Изобретение относится к области биотехнологии вирусных препаратов и может быть использовано в ветеринарии для профилактики бешенства среди животных.
В современной биотехнологии антирабических вирусных препаратов используют различные вакцинные штаммы (Внуково-32, Щелково-51, Тс-80, РВ-97 и др.), которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах ВНК-21, ПС, Vero., и др., применяя различные методические приемы культивирования - стационарный, роллерный, суспензионный [R.Barth, V.Franke, M.A.Selimov Vnukovo-32 primary hamster kidney cell vaccines for humans. //Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization, Geneva 1996, C.310-313; Вишняков И.Ф., Никишин И.В., Недосеков В.В. Инактивированная культуральная вакцина против бешенства//Ветеринария. – 1998 - №1 С.22-24; Патент 2077338 от 20.4.97. г. Никишин И.В., Вишняков И.Ф., Горшкова Т.Ф., Стрельцов Л.Ф., Жестерев В.И.; Иванов B.C. Бешенство животных: эксперементально-теоретическое обоснование разработки, производства, применения культуральных инактивированных вакцин и новые подходы к проблеме экстренной защиты ЦНС от возбудителя заболевания: Автореф. дис. д-ра вет. наук: М. 2001-20 с; Гочмурадов М.Г. Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. канд. вет. наук: Владимир 1999-33 с.].
Известные способы получения вирусного сырья для изготовления инактивированных антирабических вакцин являются весьма трудоемкими, экономически не эффективными и не позволяют получать без дополнительных технологических приемов профилактические препараты требуемой биологической активности (низкое накопление инфекционной и антигенной активности).
Наиболее близким аналогом является способ получения инактивированной антирабической вакцины из штамма (РВ-97) в суспензии клеток ВНК-21 с использованием инактиванта димерэтиленимина (Гочмурадов М.Г., Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. канд. вет. наук: Владимир 1999-33 с.).
Однако существующий способ приготовления вакцинного препарата технологически объемный и не позволяет получать на первичных этапах сырье требуемой биологической активности (инфекционная активность 6,0-6.5 lg ЛД50/мл, антигенная активность <1МЕ).
Первоначально проводят подращивание клеток ВНК-21 до 1.2-1.8 млн. кл/мл; затем заражение их вирусом бешенства. Полученное вирусное сырье концентрируют в 2-3 раза до получения необходимой антигенной активности и инактивируют димерэтиленимином.
В процессе выполняемых технологических этапов проводят 1-2 раза смену дорогостоящих питательных сред (Игла-МЕМ), вводят дополнительные этапы обработки - сепарирование, концентрирование и используют инактиванты, которые требуют особых условий работы с ними, поскольку высоко токсичны и сильные мутагены для работающего персонала (димерэтиленимин).
Целью изобретения является разработка и усовершенствование технологичного способа изготовления инактивированной вакцины против бешенства для животных без снижения ее иммунобиологических характеристик.
Поставленная цель достигается тем, что способ включает культивирование вируса бешенства, инактивацию и конструирование вакцины, при этом в качестве вируссодержащего материала используют вакцинный штамм вируса бешенства РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ), который вносят в количестве 0.1-0.01 МВД50/клетку одновременно с клетками ВНК-21 в концентрации 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии в среде 0.25% ФГМ при 37°С при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток, вирусное сырье инактивируют 0.01% 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом при 37°С в течение 3 суток и добавляют 10-20% 6%-го ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0.6-0.9%.
Штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) получен из исходного “овечий” ВГНКИ - 80 пассаж в мозге овец и адаптирован к культуре клеток почки кролика и культуре клеток куриных фибробластов. Инфекционная активность штамма 4,5-5,5 lg МДД50/мл. Вирус вызывает образование антител у домашних и диких животных при оральном и парантеральном введении. Патогенен для лабораторных животных мышей и кроликов при внутримозговом заражении (Ковалев Н.А и др. Авторское свидетельство №1091393 от 08.01.1984 г.). Вирус вносят в культуральный сосуд одновременно с клетками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии.
Культивирование проводят в суспензионной среде 0,25% ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании содержимого. Полученное вирусное сырье имеет инфекционную (6.5-6.8 lg МЛД50/мл) и антигенную активность (1.5-2.0 ME), достаточную для использования его в вакцине без дополнительных технологических приемов (сепарирование, концентрирование).
Инактивацию вируса проводят безопасным и устойчивым препаратом 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодекан - (А-24) в концентрации 0.01-0.1% при 37°С в течение 3 суток.
В качестве адъюванта добавляют 10-20% 6% ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0.6-0.9%.
Пример конкретного выполнения.
Выращивание вируса бешенства штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) проводят в культуре ВНК-21 с концентрацией 0.5-0.6 млн. кл/мл с одновременным внесением вируса в дозе 0.1-0.01 МЛД50/кл в суспензионной среде 0,25% ФГМ в ферментерах реакторного типа при температуре 37°С и постоянном перемешивании содержимого, и автоматическом поддержанием рН среды в пределах 7.2-7.6. В течение первых трех суток наблюдается повышение концентрации инфицированных клеток до 1.5-2.5 млн. кл/мл, затем постепенная их гибель. Культивирование прекращают, когда жизнеспособных клеток во взвеси остается 18-20%. Время культивирования - 6 суток. Инфекционная активность вируса бешенства штамма РБ-71 к этому времени составляет 6.5-6.8 lg МДЦ50/мл. Антигенная активность вирусного сырья из штамма РБ-71 составляет 1:90-1:270 в реакции ИФА. Полученное вирусное сырье инактивировали А-24 в концентрации 0.01-0.1% в течение 3 суток при 37°С, затем добавляли 6% 10-20% гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 0.6% (таблица №1).
(0.01, 37°С, 3 суток)
(0.1-0.3, 37°С, 24 часа)
Использование предлагаемой технологии изготовления инактивированной вакцины против бешенства по сравнению с существующим способом имеет следующие преимущества.
1. Сокращает время получения вирусного сырья на 1-2 суток за счет одновременного внесения клеток и вируса в реактор.
2. Уменьшает расход дорогостоящей питательной среды в 2 раза за счет исключения этапа смены среды.
3. Снижает расход вирусного сырья в 5-10 раз и повышает накопление антигенной активности в вирусном сырье, достаточной для использования его для изготовления эффективного инактивированного препарата.
4. Исключает использование дополнительных технологических приемов - осаждение клеток, сепарирование, концентрирование без снижения характеристик получаемой вакцины.
5. Позволяет заменить импортную среду Игла MEM на не менее эффективную отечественную питательную среду из ферментативного гидролизата мышц (ФГМ).
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ | 1994 |
|
RU2077338C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ПРИ БЕЗОПОРНОМ ВЫРАЩИВАНИИ КЛЕТОК И РЕПРОДУКЦИИ В НИХ ВИРУСА В УКОРОЧЕННОМ ЦИКЛЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ | 2012 |
|
RU2537183C2 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ | 2013 |
|
RU2538617C2 |
ВАКЦИНА ПРОТИВ ЧУМЫ, АДЕНОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ПАРВОВИРУСНОГО И КОРОНАВИРУСНОГО ЭНТЕРИТОВ, ЛЕПТОСПИРОЗА И БЕШЕНСТВА СОБАК | 2013 |
|
RU2546247C2 |
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАКЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 1993 |
|
RU2090210C1 |
СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ | 2003 |
|
RU2254575C2 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА | 2023 |
|
RU2816765C1 |
Бессывороточная среда "ВНИИЗЖ" для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин | 2021 |
|
RU2770814C1 |
Вакцина антирабическая инактивированная эмульсионная культуральная для профилактической иммунизации домашних плотоядных и сельскохозяйственных животных | 2019 |
|
RU2722868C1 |
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БЛЮТАНГА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА (ВАРИАНТЫ) И ВАКЦИНА ПРОТИВ БЛЮТАНГА КРУПНОГО И МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА | 2008 |
|
RU2391114C1 |
Изобретение относится к области биотехнологии вирусных препаратов. Используют штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) вируса бешенства, который вносят в культуральный сосуд (0.1-0.01 МЛД50/клетку) одновременно с катками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток (0.5-0.6 млн. кл/мл) и выращивают в суспензии. Культивирование проводят в суспензионной среде ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании и поддержании рН 7.2-7.4. Полученное вирусное сырье с инфекционной 6.5-6.8 lg МЛД50/мл и антигенной активностью 1:90-270 инактивируют 1,8,36-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом 0.01% при 37°С 3 суток. Готовый вакцинный препарат соответствует требованием стандарта для ветеринарных препаратов и обладает активностью 1.5-2.0 ME. 1 табл.
Способ изготовления антирабической инактивированной вакцины, включающий культивирование вируса бешенства, инактивацию и конструирование вакцины, отличающийся тем, что в качестве вируссодержащего материала используют вакцинный штамм вируса бешенства РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ), который вносят в количестве 0,1-0,01 МЛД50/клетку одновременно с клетками ВНК-21 в концентрации 0,5-0,6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии в среде 0,25% ФГМ при 37°С при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток, вирусное сырье инактивируют 0,01%-ным 1,8,36-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом при 37°С в течение 3 суток и добавляют 10-20% 6% гидроокиси алюминия до конечной концентрации сухого остатка 0,6-0,9%.
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ | 1994 |
|
RU2077338C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ | 2001 |
|
RU2191600C1 |
Авторы
Даты
2005-01-20—Публикация
2003-01-21—Подача