ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОМАССЫ ГРИБА BLAKESLEA TRISPORA ВКПМ F-117 - ПРОДУЦЕНТА КАРОТИНА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/14 C12P23/00 C12P23/00 C12R1/645 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к питательным средам для культивирования продуцентов каротиносодержащей биомассы.

Известна питательная среда Циглера для культивирования продуцентов каратиносодержащей биомассы, включающая соевую муку - 4,7%, кукурузную муку - 2,3%, масло подсолнечное - 4%, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,05%, витамин B₁ - 0,0002% и воду остальное (Cigler А., Arnold U., Аnсеlеrson R.F. Microbiological production carotinoides. 1958, V7, р94-98).

Недостатками питательной среды Циглера являются невысокая биосинтетическая способность продуцента и применение пищевого сырья для его приготовления.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому техническому результату является питательная среда для глубинного культивирования биомассы гриба Вlakeslea trispora - продуцента каротина, содержащая соевое масло - 43%, размельченную кукурузу, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,05%, витамин В₁ - 1 мг%, β-ионон - 0,1% (см. US 2890989, 16.06.1959). Однако данная питательная среда не обеспечивает достаточно высокую биосинтетическую способность продуцента каротина.

Техническим результатом является повышение биосинтетической способности продуцентов каротиносодержащей биомассы и удешевление питательной среды.

Техническая задача решается тем, питательная среда для глубинного культивирования биомассы гриба Вlakeslea trispora ВКПМ F-117 - продуцента каротина содержит ячменную мучку, соевую муку, калий фосфорнокислый однозамещенный, масло подсолнечное, витамин В₁, β-ионон, водопроводную воду при следующим соотношении компонентов, мас.%:

Ячменная мучка 3,0-4,0

Соевая мука 4,0-4,7

Масло подсолнечное 3,8-4,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,04-0,05

Витамин В₁ 0,0002-0,0005

β-ионон 0,098-0,099

Водопроводная вода остальное

Сущность изобретения заключается в том, что повышение биосинтетической способности продуцента каротина обеспечивается высокой концентрацией в ячменной мучке углеводородов изопреноидной природы - каротиноидов и терпенов. Использование в качестве источника углерода углеводородов изопреноидной природы, в частности каротиноидов, резко увеличивает содержание каротина в биомассе и микробных липидах. Это объясняется тем, что вероятно микроорганизмы включают растительные каротиноиды в продукты синтеза липидов, при этом энергетические затраты на синтез липидов в микробной клетке сводятся к минимуму. Повышению биосинтетической способности продуцентов каротина может способствовать и наличие стеринов в ячменной мучке (1,5-4,5%).

Экспериментально установлено, что достижение более высокой биосинтетической способности продуцентов каротина возможно при использовании ячменной мучки, характеризующейся следующим химическим составом (таблица 1).

Таблица 1
Химический состав ячменной мучкиВлажность, %В % на сухое вещество БелокЖирКрахмалКлетчаткаЗольность12-1312-138-1050-608- 108-9

Интенсификации процесса биосинтеза каротина могут способствовать витамины и каротиноиды, содержание которых в мучке колеблется в следующих пределах, мг%:

Витамин В₁ 0,50-0,65

Витамин В₂ 0,45-0,55

Витамин РР 1,10-1,3

Витамин Е 4,8-4,95

Каротиноиды 0,40-0,42

На увеличение биосинтетической способности продуцентов каротина могут оказывать влияние и другие группы биологически активных веществ, в частности некоторые жирные кислоты. Содержание основных жирных кислот липидов ячменной мучки представлено следующими данными (таблица 2).

Таблица 2
Жирнокислотный состав липидов ячменной мучкиЖирная кислота% от суммыС₁₆:06,9С₁₈:01,2С₁₈:125,4С₁₈:265,6С₁₈:30,9Сумма насыщенных кислот8,1Сумма ненасыщенных кислот91,9

Основным представителем жирных кислот липидов ячменной мучки является биологически активная линолевая кислота.

Питательную среду готовят следующим образом: ячменную мучку, полученную в результате шелушения ячменя, просеивают через сито диаметром 1 мм. Соли в заданном количестве растворяют в холодной водопроводной воде. В солевой раствор добавляют ячменную мучку, соевую муку, подсолнечное масло. Среду стерилизуют при 121°С в течение 45-60 мин, затем охлаждают.

В ферментационные колбы, содержащие 50 мл среды, засевают культуру штамма микроорганизма в количестве 5-10% от объема среды в соотношении объемов 1:10. Проводят глубинное брожение в течение 4-6 дней при 26-28°С в аэробных условиях при непрерывном перемешивании и аэрации в соотношении количества подаваемого воздуха 1/2:1 к объему питательной среды.

По истечении 36-48 ч от начала брожения загружают β-ионон в количестве 0,099 вес. ч.

По достижении максимальной концентрации каротина мицелий отделяют от жидкости фильтрацией.

Пример 1

Культивирование продуцента Вlakeslea Trispora ВКПМ-117 проводят в лабораторных колбах-качалках V=730 мм. Использовали питательную среду следующего состава, мас.%: соевая мука 4,7%, ячменная мучка 3%, масло подсолнечное 4%, КН₂Р0₄ - 0,05%, витамин B₁ - 0,0005%, β-ионон - 0,099% и вода до 100%. В ферментационные колбы, содержащие 50 мл среды, засевают двухдневную культуру гриба Вl. Trispora в количестве 10% от объема среды, в соотношении объемов, равном 1:10. Выращивание проводят при 26°С и перемешиванием при 220 об/мин. Спустя 48 часов от начала ферментации в колбы загружают 0,099 мас.ч. β-ионона, от объема среды.

При достижении максимальной концентрации каротиноидную массу отделяют фильтрацией. Навеску биомассы 0,02 г помещают в бюкс, содержащий 0,5 мл трихлорэтилена и 7 мл ацетона. После перехода пигментов в раствор биомассу дополнительно растирают в ступке до бесцветного состояния.

Раствор каротина в ацетоне переносят в мерную колбу па 200 мл. Объем доводят до метки ацетоном. Содержание каротина определяют фотометрически по стандартному раствору синтетического каротина. Кроме того, определяют содержание каротина в культуральной жидкости (мкг/100 мл культуральной жидкости) и содержание абсолютно сухого вещества биомассы (г/100 мл культуралыной жидкости). Содержание каротина в биомассе 46,25 г/кг, что на 2,27 больше, чем на известной среде (43,98 г/кг). Содержание каротина в культуральной жидкости 185315 мкг/100 мл, что на 30026 мкг/100 мл больше по сравнению с известной средой (155289 мкг/100 мл), накопление биомассы также идет более интенсивно 3,72 г/кг против 3,63 г/кг на известной среде.

Пример 2

Питательную среду готовят также, как в примере 1, отличием является то, что питательная среда содержит ячменную мучку в количестве 3,5%, витамина В₁ - 0,0002%, количество остальных компонентов аналогично примеру 1.

Согласно полученным результатам содержание каротина составило 49,93 г/кг, что на 13,5% больше по сравнению с известной средой. Содержание каротина в культуральной жидкости составило 188654 мкг/100 мл, что на 21% больше результатов, полученных на известной среде. Накопление биомассы 3,83 г/100 мл, т.е. на 5,5% больше по сравнению с известной средой.

Пример 3.

Питательную среду готовят также, как и примере 1 и 2, отличием является то, что питательная среда содержит ячменную мучку в количестве 4%, соевую муку 4,3%, витамин В₁ - 0,0002%. Количество остальных компонентов аналогично указанному в примерах 1 и 2.

При данном соотношении компонентов в среде содержание каротина в биомассе 44,23 г/кг, что на 0,5% больше, чем на известной среде. Содержание каротина в культуральной жидкости 165534 мкг/100 мл, что на 6,5% больше, чем на известной среде, накопление биомассы 3,75 г/100 мл, что на 3,3% больше по сравнению с результатами известной среды.

При использовании запредельных значений концентраций ячменной мучки в питательной среде положительного эффекта достичь не удалось. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3Концентрация компонентов в питательной среде, %Содержание каротинаНакопление биомассы, г/100 мл культуральной жидкости
Ячменная мучкаСоевая мукаМасло подсолнечноеВитамин В₁β-иононг/кг биомассымкг/100 мл культуральной жидкости14,753,80,00050,09931,011101003,711,54,753,80,00050,09931,101101153,7924,753,80,00020,09931,821352143,852,54,703,80,00020,09838,841412763,794,54,003,80,00020,09840,771532143,605,04,003,80,00020,09835,141501143,57

Предлагаемая питательная среда позволяет увеличить выход целевого продукта по сравнению с прототипом на 0,85 кг в пересчете на кристаллический β-каротин.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к питательным средам для культивирования продуцентов каротина. Питательная среда содержит ячменную мучку, соевую муку, калий фосфорнокислый однозамещенный, масло подсолнечное, витамин B₁, β-ионон, водопроводную воду при следующем соотношении компонентов, мас.%: ячменная мучка 3,0-4,0; соевая мука 4,0-4,7; масло подсолнечное 3,8-4,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,04-0,05, витамин В₁ 0,0002-0,0005; β-ионон 0,098-0,099, водопроводная вода - остальное. Питательная среда является дешевой и повышает биосинтетическую способность продуцента каротина. 3 табл.

Питательная среда для глубинного культивирования биомассы гриба Blakeslea trispora ВКПМ F-117 - продуцента каротина, содержащая ячменную мучку, соевую муку, калий фосфорнокислый однозамещенный, масло подсолнечное, витамин В₁, β-ионон, водопроводную воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Ячменная мучка 3,0-4,0

Соевая мука 4,0-4,7

Масло подсолнечное 3,8-4,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,04-0,05

Витамин В₁ 0,0002-0,0005

β-Ионон 0,098-0,099

Водопроводная вода Остальное