СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА МИЦЕЛИАЛЬНОЙ МАССЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕТА-КАРОТИНА Российский патент 2001 года по МПК C12P23/00 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для производства бета-каротина.

Значение указанного изобретения состоит во все большем применении биологически активных веществ, в частности бета- каротина в рецептурах продуктов питания, витаминных препаратов и лекарственных средств.

Известен ряд способов получения мицелиальной массы для производства бета-каротина методом микробиологического синтеза. При этом, например, штаммы продуцента - гетероталличного плесневого гриба Blakeslea trispora (+) 64, (-) 490 [1], (+) 8A [1], которые культивируют совместно, на питательных средах, содержащих кукурузную и соевую муку, масло растительное, ортофосфат калия, витамин В₁, биостимулятор и антиоксидант. Биопродуктивность указанных пар штаммов составляет от 0,7-1 г/л [1] до 1,35 г/л [2].

Недостатками упомянутых штаммов является их относительно невысокая биосинтетическая активность, использование дефицитного пищевого сырья в составе питательной среды.

В качестве прототипа для получения мицелиальной массы нами были приняты штаммы Blakeslea trispora К1⁺ и К1^-, культивирование которых основано на использовании побочных продуктов крахмалопаточного производства - кукурузного экстракта и зеленой патоки [3]. В качестве биостимулятора каротинообразования используют бета-ионон. Активность пар штаммов составляет в среднем 1,83 г/л. Однако недостатком этого способа также является применение пищевого растительного масла и дефицитного бета-ионона в составе питательной среды.

Задачей настоящего изобретения является полная замена пищевого сырья на непищевое, исключение дефицитного сырья за счет использования отходов и вторичных продуктов пищевой промышленности без снижения качества конечного продукта, повышение биосинтетической активности мицелиальной массы.

Поставленные задачи достигаются тем, что в способе получения мицелиальной массы предусматривается совместное культивирование новых выявленных нами штаммов гриба Blakeslea trispora КР 74⁺ и КР 86^-, обладающих способностью утилизировать в качестве субстрата отходы масложировой, мукомольной, пищеконцентратной, консервной, мясомолочной, крахмалопаточной и сахарной промышленности. В питательную среду добавляют ортофосфат калия, витамин В₁, антиоксидант и биостимулятор природного происхождения. Заявитель оставляет за собой право не конкретизировать биостимулятор.

Способ получения мицелиальной массы включает в себя три стадии.

1-я - Выращивание маточной культуры штаммов КР 74⁺ и КР 86^- в лабораторных условиях в колбах-качалках по аналогии с [1].

2-я - Выращивание инокулята в посевных аппаратах ((+) и (-) штаммы раздельно или совместно).

3-я - Совместное глубинное культивирование (+) и (-) штаммов.

Используемые в данном способе штаммы КР 74⁺ и КР 86^- получены в результате работ по индуцированному последовательному мутагенезу на реплицирующейся ДНК с помощью нитрозогуанидина в концентрации 500 мкг/мл при выживаемости 0,02 - 0,1% для КР 74⁺ и комбинированному действию УФ-облучения (выживаемость спор 5-7%) и нитрозогуанидина в указанной концентрации для КР 86^-. В условиях производства указанная пара обеспечивает удельную продуктивность 30-45 г каротина на 1 кг высушенной мицелиальной массы.

Штаммы имеют следующую характеристику:
КР 74⁺ имеет хорошо развитый воздушный мицелий серовато-белого цвета с обильной споруляцией, споры черного цвета. КР 86^- - воздушный мицелий менее развит, споруляция ослаблена. Наибольшая физиологическая активность достигается в 7-суточном возрасте на сусло-агаре;
Штаммы КР 74⁺ и КР 86^- депонированы в микробиологической лаборатории Днепровского крахмалопаточного комбината (Украина, Днепропетровская область, Верхне-Днепровский район, пос. Днепровский, Крахмалопаточный комбинат).

Способ осуществляют следующим образом.

Раздельно выращивают штаммы на сусло-агаре и маточную культуру в колбах-качалках традиционным способом [3].

Далее культивирование ведут на питательной ферментативной среде, при этом соотношение (+) и (-) вариантов штамма поддерживают на уровне 1:4-1:10.

Выращивание посевного материала производят в посевных аппаратах объемом 1000 л для (+) формы и 2000 л для (-) формы на питательной среде состава, %:
Подсолнечный шрот - 8-12
Меласса или зеленая патока - 1-2
Баковый отстой - 4,2 - 5
KH₂PO₄ - 0,05
Тиаминхлорид - 0,0002
Подготовленную питательную среду стерилизуют непосредственно в посевных аппаратах, затем среду охлаждают и засевают маточной культурой из колб: (+) форма - 1 колба (100 мл), (-) форма - 3 колбы (450 мл).

Выращивание ведут 40-48 часов при постоянном перемешивании, непрерывной подаче стерильного воздуха и температуре 26-28^oC. Периодически отбирают пробы для контроля стерильности биохимических показателей, pH и набора биомассы.

По готовности посевного материала его передают в ферментер в заданном соотношении (+) и (-) форм, на предварительно простерилизованную и охлажденную питательную среду того же состава, что и для посевных аппаратов. Кроме того, в ферментер до стерилизации среды вводят биостимулятор каротинообразования в количестве 0,05 - 0,15% и антиоксидант (0,03 - 0,05%). Режим аналогичен посевным аппаратам. Периодически (2-3 раза в сутки) отбирают пробы на анализ для проведения морфологического и биохимического контроля, pH и стерильности. Процесс заканчивают через 96-100 часов обработкой культуральной жидкости при температуре 75-80^oC в течение 10-15 минут. Затем культуральную жидкость фильтруют, а мицелиальную массу высушивают в вакуумной гребковой сушилке при температуре в массе не более 60^oC, под вакуумом, до остаточного содержания влаги в продукте не более 7%. Полученную мицелиальную массу высушивают и используют для получения бета-каротина.

Согласно предложенному способу содержание каротина в мицелиальной массе составляет от 3 до 4,5%.

Способ иллюстрируется примером.

Подготовка инокулята.

Штаммы КР 99 (±) выращивают раздельно на питательной среде следующего состава, %:
Мука соевая - 2,3
Мука кукурузная - 4,7
KH₂PO₄ - 0,05
Вода - водопроводная;
pH 6,1-6,5.

Среду разливали в качалочные колбы объемом 0,75 л по 100 мл, 150 мл и стерилизовали в автоклаве при 120^oC в течение 30 минут.

Исходным посевным материалом для засева маточных колб служили 7-10-дневные косяки. Водную суспензию спор и вегетативного мицелия в количестве 0,3-1,0 мл для (+) штамма и 1,0-3,0 мл для (-) штамма. Время инкубации при температуре 28^oC на качалках со скоростью вращения 220-240 оборотов в минуту составляет 44-52 г.

Последующую ферментацию осуществляли путем совместного культивирования (+) и (-) форм штамма на ферментационной среде.

Ферментация.

Процесс проводили в качалочных колбах с объемом питательной среды 50 мл, содержащей источники углеродного и азотного питания при следующем биохимическом составе среды;
- углеводы (редуцирующие вещества) - 0,8-3,0%;
- азот аминный - 70 - 150 мг %;
- отходы масложировой промышленности (в пересчете на жир) - 3,5-4,0%;
pH - 6,0-6,5.

В питательную среду до стерилизации вносили биостимулятор (отходы масложировой промышленности или вторичные продукты при получении кристаллического каротина) в количестве 0,05-0,3%.

Выход бета-каротина в зависимости от концентрации исходных питательных веществ приведен в таблице при длительности культивирования 120 ч.

Наиболее высокие выходы получены в группах опытов 1,4, однако более экономичными и продуктивными представляются питательные среды, содержащие 1,7-1,8% редуцирующих веществ и 0,15% биостимулятора.

Технико-экономический эффект достигается за счет рационального использования отходов производства, которые в настоящее время не находят практического применения. При этом исключается из состава питательной среды дорогостоящие (растительное масло) и дефицитные (бета-ионон) компоненты, что ведет к достижению себестоимости конечного продукта (бета-каротина).

При этом повышается биосинтетическая активность мицелиальной массы и не снижается качество полученного конечного продукта.

Способ включает использование в качестве продуцента штаммы Blakeslea trispora KP 74⁺ и КР 86^-, а в качестве питательной среды - отходов и/или вторичных продуктов пищевой промышленности, содержащих белки, жиры и углеводы, а также побочных продуктов при получении кристаллического картона. Техническим преимуществом способа является снижение себестоимости получения целевого продукта путем исключения использования дорогостоящих компонентов питательной среды и улучшение качества мицелиальной массы. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ производства мицелиальной массы для получения бета-каротина путем глубинного культивирования на питательной среде, включающей биостимулятор, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штаммы Blakeslea trispora KP 74⁺ и КР 86^-, а компонентами питательной среды являются отходы и/или вторичные продукты пищевой промышленности, содержащие жиры, белки и углеводы, а также побочные продукты при получении кристаллического бета-каротина. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отходами и вторичными продуктами пищевой промышленности являются преимущественно продукты масложировой, мукомольной, пищеконцентратной, мясомолочной, крахмалопаточной и сахарной промышленности.