ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PHODOTORULA GRACILLIS - ПРОДУЦЕНТ КАРАТИНОИДОВ Российский патент 1995 года по МПК C12P23/00 C12N1/16 C12N1/16 C12R1/00 

Изобретение относится к изысканию продуцентов биологически активных веществ микробного происхождения, точнее к получению нового штамма дрожжей, синтезирующего каротиноиды, и может быть использовано в сельском хозяйстве для повышения эффективности кормов путем обогащения их экологически чистыми каротинсодержащими белково-витаминными концентратами.

Интерес к каротиноидным пигментам обусловлен их жизненно-важными функциями. В частности, недостаток каротина и витамина А в продуктах питания и кормах негативно влияет на процессы роста и формирования клеток эпителия животного организма, нарушает работу железистой части гипофиза, вызывает снижение остроты зрения, заболевания глаз.

Все возрастающие потребности кормопроизводства, медицины и ветеринарии в каротине могут быть удовлетворены в значительной мере с помощью микробиологического синтеза. В связи с этим поиск и отбор среди микрофлоры активных штаммов каротинобразующих дрожжей благоприятствует разрешению этой проблемы.

Известны различные виды микроорганизмов, широко встречающиеся в качестве эпифитов на травянистых кормовых растениях, синтезирующие каротиноиды: Blakeslea trispora, Sporobolomyces pararoseus, Rhodotorula aurantiaca. Rh. glutinis.

Описанные штаммы дрожжей характеризуются относительно низким содержанием каротиноидов и β-каротина, используют нетрадиционное сырье, в том числе гидролизаты верхового торфа (авт.св. N 391174), этанол, углеводороды нефти (авт.св. N 5311844). Однако названные питательные субстраты (хотя легко усвояются селекционированными культурами), могут быть потенциальными источниками синтеза дрожжевой клеткой канцерогенных веществ.

Наиболее близким аналогом (прототип) предлагаемого изобретения является штамм дрожжей Rhodotorula glutinis 214, образующий каротиноиды и β-каротин. Штамм (прототип) получен искусственным путем с помощью десятиминутного воздействия электрического тока промышленной частоты напряженностью 23 кВ/см на мутант ЭТ-6, селекционированный с помощью УФ и воздействия этиленимина. Культура (прототип) синтезирует оптимальное количество каротиноидов и β-каротина на средах с Н-алканами.

Недостатком указанного штамма является его низкая эффективность по выходу каротиноидов и β-каротина.

Цель изобретения - получение более эффективного штамма Rhodotorula gracillis 1934 с высоким содержанием каротиноидов и β-каротина.

Предлагаемый штамм Rhodotorula gracillis 1934 образует названные целевые продукты в более высоких концентрациях при росте культуры на субстратах с углеводами (глюкозой, сахарозой и др.), на основе которых клетки синтезируют экологически безопасные метаболиты.

Продуцент биологически активных веществ, который практически может быть использован для повышения эффективности кормов, должен характеризоваться определенной скоростью роста, высоким уровнем биосинтетической активности, не обладать токсигенными, токсичными, вирулентными свойствами для человека и сельскохозяйственных животных, не загрязнять окружающую среду потенциально канцерогенными продуктами.

Штамм дрожжей Rhodotorula gracillis 1934 хранится в коллекции культур кафедры микробиологии и вирусологии Украинской ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии на пептонно-глюкозном агаре (ПГА) и сусло-агаре (СА, 7^о по Баллингу) при 4^оС. Штамм депонирован в ВКПМ под N У-1724. Штамм Rhodotorula gracillis 1934 выделен из свежего сена люцерны и имеет следующую характеристику:
Морфологические признаки. Клетки суточной культуры на СА овальные, вытянутые, одиночные или в коротких цепочках. Размеры клеток 9,5-10 х 3,5-4 мк. Спор и псевдомицелия не образует.

Культуральные признаки. На СА и ПГА колонии ограниченно растущие, выпуклые, гладкие, блестящие с ровным краем, оранжево-красного цвета. На жидких средах через 48-96 ч культура образует пленку, кольцо, осадок.

Физиологические признаки. Факультативный аэроб. Максимум роста при 28-30^оС, рН 5,5-6,0.

Отношение к углеводам. Ассимилирует хорошо глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, галактозу, фруктозу, трегалозу, рафинозу, ксилозу. Слабо - сорбозу и декстрин.

Отношение к спиртам. Усваивает этиловый спирт, глицерин, маннит, сорбит.

Отношение к кислотам. Хорошо использует янтарную и яблочную кислоты.

Отношение к источникам азота. Усваивает нитратные и аммонийные соли азота.

Патогенные свойства. Патогенными (токсигенными, токсическими, вирулентными) и канцерогенными свойствами при пероральном и внутрибрюшинном введении белым мышам и крысам живых или убитых клеток в дозе 500 млн не обладает. Коагулазная, гиалуронидазная, лецитиназная активность, некротические и фибринолитические свойства отсутствуют.

Для получения такого штамма были изучены каротинсинтезирующие свойства у 220 изолятов дрожжей разного происхождения: музейные, свежевыделенные штаммы из ризосферы кормовых растений, растительных остатков, разных видов кормов - сена, соломы, зерна, зернофуража, силоса и других субстратов.

Изучение биосинтетической активности дрожжей проводили общепринятыми методами. Протеолитические свойства определялись по способу Ансона (Сампер и др. , 1948), содержание белка в клетках и культуральных жидкостях - по Лоури (Закордонец, 1982). При расчете сырого протеина использовали коэффициент 6,25. Для оценки динамики роста и накопления пигментов пробы отбирали через каждые 24 ч после инокуляции среды. Содержание биомассы определяли нефелометрическим и весовым методами, сухое вещество дрожжей - высушиванием навески их при температуре 105^оС до постоянного веса.

Определение каротиноидов в клетках дрожжей проводили по методу Одинцовой (Одинцова, 1959). Для количественного учета β-каротина применяли спектрофотометрический метод выявления этой группы пигментов в экстракте (Вечер, Куликова, 1969). Пантотеновую кислоту и другие витамины определяли по методике, описанной Щербиной )Щербина, 1982).

Сопоставление значений нескольких выборок интенсивности каротинобразования исследуемых штаммов проводили с помощью критерия Стьюдента. Достоверность различий между результатами составляла при 0,1% уровне значимости t_факт = =3,48 > t_табл. = 2,28.

Сухая биомасса Rhodotorula gracillis 1934, полученная при росте штамма на СА или ПГА поверхностным методом в течение 7 сут, при 28^оС, представляет собою сухое красно-коричневого цвета вещество, которое содержит в своем составе сырого протеина 47,5-49% , общего азота 7,3-7,8%, аминного азота 3,9-4,5% , золы 5,1-5,3%, липидов 3,5-3,8%. каротиноидов, пантотеновую кислоту, других витаминов - 5820 мкг/л среды, что в пересчете на 1 г абсолютно сухой массы клеток дрожжей составляет 2983-3720 мкг (34%) каротиноидов и 2000-2100 мкг (66%) β-каротина.

Биологические исследования полученных продуктов на лабораторных животных в течение месяца свидетельствуют об отсутствии в них токсических примесей. Животные охотно поедали корм, содержащий метаболиты Rhodotorula gracillis 1934, хорошо росли и развивались в течение всего периода испытаний, прибавляли в весе (на 30-40%) по сравнению с контролем.

Полученный штамм может быть рекомендован для разработки эффективных методов обогащения кормов витаминами, ферментами, белком и другими биологически активными продуктами микробного происхождения.

Использование: микробиологическая промышленность, получение новых штаммов дрожжей, синтезирующих каратиноиды. Сущность: штамм дрожжей RHODOTORULA GRACILLIS депонирован в ВКПМ под N 1724. Сухая биомасса штамма, полученная при культивировании на сусло -агаре в течение 7 сут при 28°С, содержит (в %) - 47,5 - 49 сырого протеина, 7,3 - 7,8 общего азота, 3,9 - 4,5 аминного азота, 5,1 - 5,3 золы, 3,5 - 3,8 липидов, 5820 мкг/л среды каратиноидов, пантотеновую кислоту и другие витамины.

ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PHODOTORULA GRACILLIS - ПРОДУЦЕНТ КАРАТИНОИДОВ.

Штамм дрожжей RHODOTORULA GRACIL LIS ВКПМ У-1724 - продуцент каротиноидов.