СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ Российский патент 2005 года по МПК C12P19/04 C12P1/06 C12N1/20 C12N1/16 C12N1/14 C08B37/00 C12P19/04 C12R1/64 C12R1/05 C12R1/06 C12R1/65 C12R1/38 C12R1/15 C12R1/645 C12R1/66 C12R1/78 

Предметом настоящего изобретения является способ получения экзополисахаридов путем ферментации при помощи микроорганизмов. В частности, изобретение относится к способу получения экзополисахаридов ферментацией микроорганизмов в питательной среде, содержащей по меньшей мере один источник углерода, ассимилируемый микроорганизмами, и по меньшей мере один органический источник азота, происходящий от растения семейства бобовых и обладающий повышенным содержанием протеинов.

В рамках настоящего изобретения термин "экзополисахариды" обозначает полисахариды, продуцируемые микроорганизмами.

Экзополисахариды с высокой молекулярной массой все более широко используются в различных областях промышленности благодаря их загущающим, вязкостным, эмульгирующим, стабилизирующим свойствам, в частности, в водных средах. Так, ксантановая камедь используется благодаря своим исключительным реологическим свойствам в таких разнообразных областях, как строительство, производство красок, бумажная, текстильная, косметическая, пищевая промышленность, сельское хозяйство, водное хозяйство, бурение, добыча нефти и др.

Эти экзополисахариды обладают высокой молекулярной массой, обычно выше 1· 10⁶ г/моль (измерение гель-фильтрацией) и состоят из звеньев глюкозы, маннозы, галактозы, рамнозы, глюкуроновой кислоты, маннуроновой кислоты, гулуроновой кислоты, возможно, с ацетатными и пируватными производными, их особая структура и свойства описаны, например, в работе:industrial Gums - Whistler - 2-е издание - Chapters XXI-(XIII(1973).

Экзополисахариды предпочтительно продуцируются аэробной культурой микроорганизмов в водной питательной среде.

Ксантановую камедь продуцируют бактерии рода Xanthomonas. Экзополисахариды этого же типа могут продуцироваться разнообразными микроорганизмами, среди наиболее известных из которых можно назвать микроорганизмы родов Agrobacterium, Arthrobacter, Alcaligenes (сукциноглюкан), Pseudomonas (леван), Rhizobium, Sclerotium (склероглюкан).

Водная питательная среда обычно содержит, помимо различных элементов роста, источник углерода и источник азота. В промышленной ферментации выбор источника углерода и/или источника азота основан одновременно на его доступности, стоимости и способности обеспечить высокую продуктивность.

Так, в SU 1838417 A3 описан способ, включающий получение экзополисахаридов ксантанового типа выращиванием микроорганизма-продуцента полисахаридов на питательной среде, содержащей источники углерода, органического азота и факторы роста в аэробных условиях. В частном случае в качестве микроорганизма-продуцента используются бактерии Хanthomonas campestris.

В некоторых областях промышленности, например в пищевой или косметической промышленности, существуют дополнительные условия. В этих областях источники углерода и азота должны быть выбраны, кроме того, таким образом, чтобы получаемые экзополисахариды удовлетворяли необходимым органолептическим, сенсорным и визуальным требованиям.

Среди обычно используемых источников углерода и азота нелегко найти такие, которые удовлетворяли бы сразу всем перечисленным требованиям.

Например, когда микроорганизм не в состоянии поглотить все количество источника азота, по завершении ферментации остаются нерастворимые остаточные продукты, из-за которых, с одной стороны, в среде могут развиться сторонние штаммы, способные испортить сусло для отделения экзополисахаридов, и, с другой стороны, которые могут привести к окрашиванию экзополисахаридов при возможной термической стерилизующей и осветляющей обработке. В некоторых способах ферментации для устранения этого недостатка используют ферменты. Другие способы включают стадии фильтрации и/или центрифугирования. Какими бы способами не удаляли нерастворимые остаточные постферментационные продукты, это приводит к удорожанию всего процесса.

Некоторые источники углерода и/или азота обладают тем недостатком, что значительно удлиняют цикл ферментации, что приводит, в частности, к заражению и, следовательно, к порче сусла до отделения экзополисахарида и к снижению продуктивности.

Природа источника азота особенно важна в случае, когда нужно получить экзополисахарид, обладающий хорошими органолептическими, сенсорными и визуальными свойствами. На нем также лежит ответственность за высокий выход экзополисахаридов.

Было установлено, что некоторые источники, полученные из семян некоторых бобовых, таких как каруба, представляют собой особо ценные источники органического азота для ферментации микроорганизмов. Эти фракции на поверку удовлетворяли всем вышеперечисленным требованиям.

Среди фракций, полученных из семян карубы, наилучшие результаты, в частности, в том, что касается продуктивности, дают те, которые обладают высоким содержанием протеинов. На так называемых стандартных средах, таких как указанные, например, в работе Industrial Gums - Whistler - 2-е издание - Chapters XXI-XXIII (1973) для контрольной ферментации продуктивность составляет порядка 0,3-0,4 г/(кг· ч); для фракций, полученных из семян карубы, эта продуктивность составляет более 0,4 г/(кг· ч).

В настоящем изобретении ставится цель предложить способ получения экзополисахаридов путем ферментации микроорганизмов, который был бы простым и экономичным.

Другой задачей изобретения является предложить способ получения экзополисахаридов ферментацией микроорганизмов, в котором бы устранялись вышеуказанные проблемы загрязнения среды.

Таким образом, объектом изобретения является способ получения экзополисахаридов путем ферментации микроорганизмов, отличающийся тем, что ферментацию проводят в питательной среде, содержащей по меньшей мере один источник углерода, ассимилируемый микроорганизмами, и по меньшей мере один органический источник азота, причем указанный источник происходит из фракции семян карубы.

Другими преимуществами, связанными, в частности, с выбором источника азота, являются сокращение времени ферментации, отсутствие нерастворимых остаточных постферментационных продуктов и повышенная производительность.

Кроме того, этот способ позволяет получить экзополисахарид, обладающий хорошими органолептическими, сенсорными и визуальными свойствами.

Кроме того, реологические свойства получаемого этим способом экзополисахарида сохраняются и даже в некоторых случаях оказываются улучшенными.

Способ по изобретению может быть применен для получения любого экзополисахарида путем ферментации при помощи микроорганизмов. Многие микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи, грибы, водоросли, способны продуцировать экзополисахариды. В числе прочих можно назвать:

бактерии, принадлежащие к роду Xanthomonas, и, в частности, к видам, описанным в Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8-е издание - 1974 - Williams N. Wilkins Co. Baltimore), таким как Xanthomonas begoniae, Xanthomonas campestris, Xanthomonas carotae, Xanthomonas hederae, Xanthomonas incanae, Xanthomonas malvacearum, Xanthomonas papavericola, Xanthomonas phaseoli, Xanthomonas pisi, Xanthomonas vasculorum, Xanthomonas vesicatoria, Xanthomonas vitians, Xanthomonas pelargonii;

бактерии, принадлежащие к роду Arthrobacter, и в частности, к видам Arthrobacter stabilis, Arthrobacter viscosus;

бактерии, принадлежащие к роду Erwinina;

бактерии, принадлежащие к роду Azotobacter, и в частности, к виду Azotobacter indicus;

бактерии принадлежащие к роду Agrobacterium, и в частности, к видам Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens;

бактерии, принадлежащие к роду Alcaligenes, и в частности, Alcaligenes faecalis;

бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas, и в частности, Pseudomonas methanica;

бактерии, принадлежащие к роду Corynebacterium;

бактерии, принадлежащие к роду Bacillus, и в частности, Bacillus polymyxa;

грибы, принадлежащие к роду Sclerotium, и в частности, к видам Sclerotium glucanicum, Sclerotium rolfsii или Plectania occidentalis;

грибы, принадлежащие к роду Aspergillus, и в частности, к видам Aspergillus itaconicus, Aspergillus terreus;

дрожжи, принадлежащие к роду Hansenula, такие как вид Hansenula casulata.

Предпочтительно, используемый микроорганизм является бактерией рода Xanthomonas и, в частности, вида Xanthomonas campestris.

Основным объектом изобретения является способ получения экзополисахаридов ферментацией микроорганизмов, отличающийся тем, что ферментацию проводят в питательной среде, содержащей по меньшей мере один источник углерода, ассимилируемого микроорганизмами, и по меньшей мере один органический источник азота, причем указанный источник происходит из фракции семян карубы.

Плод, образуемый деревьями карубы, состоит из двух частей: кожуры и семени. Семя карубы и, в частности, эндосперм этого семени, уже широко используется под названием "смола карубы". С эндоспермом соприкасается зародыш, побочный продукт, получаемый в больших количествах при выделении смолы карубы.

Выяснилось, что те из фракций семян карубы, которые обладают повышенным содержанием протеинов, наилучшим образом подходят для осуществления способа согласно настоящему изобретению.

Так, фракция семян карубы преимущественно содержит по меньшей мере 45%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, и более предпочтительно, по меньшей мере, 60% протеинов по отношению к сухому весу сухого вещества.

Содержание протеинов определяют на основе измерения азота, высвобождаемого при горении при 950° С в атмосфере кислорода, осуществляемого по проводимости в токе гелия. В качестве измерительной аппаратуры используют LECO FP 428.

Эти протеины состоят как из незаменимых, так и из заменимых аминокислот.

Особый вариант осуществления способа по изобретению заключается в использовании фракций семян карубы, в которых протеины характеризуются, предпочтительно, повышенным содержанием аргинина, глутамина и/или глутаминовой кислоты и лизина.

В этом особом варианте содержание аргинина преимущественно составляет от 9 до 20% и, предпочтительно, от 12 до 14%, вес/вес, по отношению к общему количеству аминокислот.

Также содержание глутамина и/или глутаминовой кислоты составляет преимущественно от 18 до 30%, предпочтительно, от 22 до 27%, вес/вес, по отношению к общему количеству аминокислот.

Содержание лизина преимущественно составляет от 18 до 30%, предпочтительно, от 12 до 14%, вес/вес, по отношению к общему количеству аминокислот.

Содержание аминокислот определяют обычными известными специалисту способами.

Помимо протеинов используемые фракции могут также содержать липиды. Экзополисахариды, полученные ферментацией микроорганизмов в питательной среде, содержащей по меньшей мере один органический источник азота, происходящий из фракции семян карубы, содержащей липиды, обладают особо улучшенными органолептическими, визуальными и сенсорными свойствами. Эти липиды также препятствуют вспениванию в фазах предкультуры.

Предпочтительно содержание липидов в указанных фракциях составляет, по меньшей мере, 4%, более предпочтительно, по меньшей мере, 5% и еще более предпочтительно от 7 до 15% по отношению к весу сухого вещества.

Содержание липидов указано по отношению к общему содержанию жиров. Его определяют экстракцией гексаном в экстракторе Soxhiet. Последовательность операций является следующей:

- в патроне экстрактора взвешивают примерно 10 г перемолотого зародышевого материала карубы, т.е. Е грамм, причем патрон закупоривают гидрофильным хлопковым тампоном;

- в предварительно тарированный (Р0 грамм) баллон емкостью 250 мл вводят 150 мл гексана;

- осуществляют экстракцию в течение примерно 6 часов;

- растворитель выпаривают с помощью вращающегося выпаривателя и завершают высушивание осадка в сушильном шкафу при 105° С в течение 1 часа;

- после охлаждения в эксикаторе взвешивают баллон, содержащий осадок, т.е. Р1 грамм.

Содержание жиров и, следовательно, липидов, определяют по следующей формуле:

Содержание жиров (%)=100× (Р1-Р0)/Е.

Из характерных составляющих, входящих в состав этих липидов, можно, в частности, назвать пальмитиновую, стеариновую, олеиновую и линолевую кислоты.

Помимо протеинов и липидов фракции семян карубы могут содержать также углеводы.

Согласно особому варианту осуществления изобретения указанная фракция представляет собой зародыш семени карубы.

В этом варианте осуществления указанную фракцию предварительно очищают от фракций эндосперма с помощью обычных известных методов.

Используемая фракция семян карубы может быть предпочтительно представлена в форме муки. Эту муку получают обычными способами размалывания, такими как размалывание в мельницах следующих типов:

- валковые мельницы для муки со средней гранулометрией type mesh 100, т.е. муки, содержащей не более 1 вес.% частиц размером более 80 mesh и не более 10 вес.% частиц размером менее 200 mesh;

- мельницы с вертелом (pin mills) для муки с более тонкой гранулометрией:

- type mesh 200, т.е. мука, не содержащая частиц размером более 80 mesh и содержащая не более 60 вес.% частиц размером менее 200 mesh, и

- type mesh 175, т.е. мука, содержащая не более 1 вес.% частиц размером более 80 mesh и не более 75 вес.% частиц размером менее 200 mesh.

Мука может быть использована в первоначальном виде или после обработки подходящими ферментами, например щелочными, кислыми и/или нейтральными протеазами; липазами; фитазами; щелочными, кислыми и/или нейтральными фосфотазами; амилазами. Обработку ферментами проводят с помощью обычных известных способов.

Гранулометрия указанной муки может колебаться в пределах от 10 до 150 микрон. В случае обработанной муки эта гранулометрия составляет, в частности, от 20 до 60 микрон, предпочтительно, от 30 до 50 микрон.

Измерение гранулометрии может быть осуществлено методом лазерной гранулометрии с помощью гранулометра MALVERN, поставляемого компанией Malvern Instruments S.A.

Можно также использовать фракцию семян карубы в непереработанном виде, т.е. после отделения эндосперма в форме пластинок или в форме первичной водной дисперсии или суспензии.

Хотя изобретение описано для семян карубы, оно может также применяться в отношении других бобовых, например, гуара, кассии, тары. Эти бобовые приводятся в качестве примера и не ограничивают изобретение.

В другом особом варианте осуществления изобретения ферментацию проводят со смесью органических и минеральных источников азота.

В этом случае минеральный источник азота может быть выбран из нитратов аммония или натрия, фосфатов или силикатов аммония, сульфата магния, сульфата калия или натрия, по отдельности или в смеси.

Концентрация органических и, в случае необходимости, минеральных источников азота в среде ферментации составляет от 1 до 80 г/л, предпочтительно от 3 до 50 г/л и еще более предпочтительно от 5 до 30 г/л.

Среда ферментации содержит также источник углерода, ассимилируемый микроорганизмами.

В качестве конститутивного источника углерода среды ферментации можно назвать глюкозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, трегалозу, маннозу, мелобиозу, рафинозу, мальтотриозу, мальтозу, лактозу, лактулозу, метил-β -галактопиранозид, метил-α -галактопиранозид, целлобиозу, гентобиозу, метил-β -D-глюкопиранозид, метил-α -D-глюкопиранозид, эскулин, рибозу, арабинозу, ксилозу, палатинозу, рамнозу, фукозу, мелезитозу, D(+)арабит, L(-)арабит, ксилит, дульцит, тагатозу, глицерин, мио-иннозит, маннит, мальтит, туранозу, сорбит, адонит, ликсозу, эритрит, крахмал, предпочтительно гидролизованный, гидролизаты крахмала, смеси указанных сахаров и смеси, содержащие по меньшей мере один из этих сахаров. Предпочтительными сахарами являются глюкоза и сахароза.

Концентрация ассимилируемого источника углерода составляет от 1 до 100 г/л, предпочтительно, от 15 до 80 г/л.

Среда ферментации может дополнительно содержать олигоэлементы, такие как следовые количества неорганических солей, таких как сульфаты, хлориды железа, кальция, марганца, магния, натрия, калия, никеля, кобальта, меди, цинка или их смесей, а также витамины, нуклеотиды и/или другие обычные добавки, такие как агенты регуляции рН и противовспенивающие агенты.

Способ получения экзополисахаридов по изобретению путем ферментации микроорганизмов может быть осуществлен в присутствии фермента (ферментов), таких как щелочные, кислые и/или нейтральные протеазы; полисахаразы; амидазы; пептидазы; амилоглюкозидазы; фосфатазы; фитазы.

Однако одно из главных преимуществ способа по изобретению заключается в том, что возможно осуществлять ферментацию микроорганизмов в отсутствии ферментов. Неожиданно было обнаружено, что в отсутствие ферментов не меняются ни продолжительность, ни продуктивность ферментации. Более того, отказ от ферментов не приводит к аккумуляции нерастворимых и нерастворенных остаточных постферментационных продуктов, которые могли бы привести к развитию в среде сторонних штаммов, способных вызвать порчу сусла до отделения экзополисахарида.

Сама культивация микроорганизмов может быть проведена обычным образом. Специалист, в зависимости от используемого микроорганизма, сможет осуществить выбор условий, в частности, температуры и времени инкубации, а также природу среды для указанного микроорганизма.

Для консервирования микроорганизма предпочтительно осуществить стадию предкультуры. Под предкудьтурой понимают стадию, состоящую в развитии и размножении бактериального штамма без продукции экзополисахарида.

Микроорганизм вносят в среду ферментации известным образом с помощью инокулумов или промежуточных культур.

Ферментация может протекать под давлением от 0 до 4 бар. Ферментацию можно проводить при температуре от 15 до 100° С, предпочтительно от 25 до 80° С, и еще более предпочтительно от 25 до 35° С.

Значение рН среды ферментации может составлять от 5 до 9, предпочтительно от 6 до 8. Значение рН может быть установлено на желаемом уровне, в зависимости от случая, с помощью основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия или гидроксид аммония, или с помощью кислоты, такой как серная кислота, ортофосфорная кислота, соляная кислота или азотная кислота.

Среда ферментации, помещенная в ферментационный резервуар или емкость, может быть подвергнута перемешиванию и аэрации. Это перемешивание может быть осуществлено, например, с помощью реципрокного взбалтывателя, вращающегося взбалтывателя, одного или нескольких взбалтывающих блоков или пузырьковой колонны. Продолжительность ферментации обычно составляет более 30 часов, обычно - от 40 до 100 часов.

Производительность измеряют на основании количества полученного экзополисахарида, в граммах, по отношению к кг сусла, на один час ферментации. Благодаря способу по изобретению наблюдают повышение производительности на 3-15%, предпочтительно на 5-10%.

По завершении ферментации экзополисахарид может быть отделен от сусла и очищен согласно известным способам, таким как фильтрация, концентрирование, кристаллизация или экстракция растворителями.

Изобретение также распространяется на экзополисахариды, полученные или которые могут быть получены указанным способом. В частности, оно распространяется на ксантановую камедь, полученную способом по изобретению.

Ксантановая камедь, полученная способом по изобретению, в водном растворе в 1% в дистиллированной воде, обладает повышенной прозрачностью, т.е. прозрачностью порядка 70-95% или порядка 80-95%. Коэффициент прозрачности водного раствора измеряют спектрофотометрией при 600 нм.

Следующие примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения, не ограничивая его объем.

Примеры

Пример 1

Этот пример описывает фазы предкультуры 1 и 2 для Xanthomonas campestris.

Все эти составляющие растворяют в 1 литре питьевой воды, гомогенизируют при помощи магнитной мешалки и разливают в сосуды Эрленмайера емкостью 500 мл фракциями по 112 мл.

Препараты помещают в автоклав на 30 минут при 120° С.

Штамм первично консервируют замораживанием в пробирках при -196° С способом замораживания в парах жидкого азота.

Для замораживания жидким азотом готовят предкультуру в особой среде следующего состава:

Для получения среды все эти ингредиенты диспергируют в родниковой воде. Устанавливают рН 6,5 при помощи H₂SO₄ (10%). Среду стерилизуют в автоклаве при 120° С в течение 20 минут.

После 24 часов инкубации при 28° С на вращающемся взбалтывателе при 220 об/мин и амплитуде 50 мм в культуру добавляют 10 об.% чистого стерильного глицерина. После этого культуру распределяют по криопробиркам емкостью от 1 мл до 10 мл, предпочтительно от 2 мл до 4 мл.

Эти пробирки консервируют в парах жидкого азота. Предкультуру 1 высеивают при помощи криопробирки, предварительно размороженной на воздухе при комнатной температуре. Все или 50% содержимого криопробирки стерильно вводят в сосуд Эрленмайера емкостью 500 мл, среда в котором была стерилизована автоклавированием, как описано выше.

Засеянную таким образом среду инкубируют 24 часа при 28° С на вращающемся взбалтывателе при 220 об/мин и амплитуде 50 мм.

После 24 часов инкубации получают предкультуру с рН от 7 до 7,5, вязкостью от 50 до 500 мПа· с и с содержанием популяции бактерий Xanthomonas campestris выше 10¹⁰ /мл.

Предкультура 2:

Предкультуру 1 используют для высеивания в предкультуру 2. Состав среды предкультуры 2:

- Сахароза 10 г/л Eurosucre

- Мука из зародышей карубы 4 г/л Meyhall AG

- Na₂HPO₄ 3 г/л Europhos

- Питьевая или смягченная вода qsp 1 литр

- рН, отрегулированный 10%-й серной кислотой до значения 6,5 перед стерилизацией.

Все эти составляющие суспендируют в 1 литре питьевой воды и доводят рН до 6,5. Полную среду распределяют по сосудам Эрленмайера емкостью 500 мл по фракциям объемом 112 мл и автоклавируют при 120° С в течение 30 минут.

Содержимое сосудов Эрленмайера засеивают с помощью 0,1-0,2 мл предкультуры 1. Инкубируют сосуды Эрленмайера от 24 до 30 часов при 28° С на вращающемся взбалтывателе при 220 об/мин с амплитудой 50 мм.

После 24-30 часов инкубации получают предкультуру с рН от 5,8 до 7,1, вязкостью от 100 до 1000 мПа· с и с содержанием популяции бактерий Xanthomonas campestris более 10⁹ /мл.

Пример 2

Этот пример описывает подготовку и получение экзополисахарида двумя способами ферментации: с источником органического азота и со смешанным источником органического азота и минерального азота.

В этом примере прибегают к двум стадиям предкультуры. Эти стадии проводят в сосудах Эрленмайера емкостью 500 мл, что соответствует 100 мл среды (см. примеры 1 и 2).

Стадия продукции, которая соответствует стадии, на которой бактериальный штамм продуцирует полисахарид, протекает в ферментере емкостью 20 литров, в т.ч. 15 литров полезного объема.

Стадия предкультуры 1 и 2:

Стадии предкультуры 1 и 2 осуществляют таким же образом, как в примере 1.

Стадия продукции:

Среда 1:

Последней стадией является стадия продукции экзополисахарида.

Среда ферментера 1 имеет следующий состав:

- Сахароза 42 г Eurosucre

- Мука из зародышей карубы 6 г Meyhall Аg

- МgSO₄·_{7Н2O 0,25 г Bittersalz}

- Na₂HPO₄ 2 г Prolabo

- Органический противовспениватель 0,5 мл

- Питьевая или смягченная вода qsp 1 л

Получение источников азота и углеводов осуществляют раздельно.

Сахароза ⇒ Qsp грамм глюкозы растворяют в qsp 3 л смягченной или питьевой воды в сосуде Марьота. Понижают рН до значения 5,2 с помощью Н₂SO₄ (10%). Раствор стерилизуют в сосуде Марьота в течение 45 минут при 120° С в автоклаве. Мука из зародышей карубы + соли ⇒ Qsp грамм муки из зародышей карубы, 30 г Na₂HPO₄, 3,75 г MgSO₄·_{7H2O и 7,5 мл противо-вспенивающего агента растворяют в qsp 7 л смягченной воды. Доводят рН до значения 6 с помощью H2SO4 (10%). Смесь стерилизуют in situ в течение 45 минут при 120° С.}

1н гидроксид натрия ⇒ 40 г твердого NaOH растворяют в qsp 1 л дистиллированной воды. Раствор стерилизуют в сосуде Марьота в течение 30 минут при 120° С в автоклаве.

По достижении всеми ингредиентами температуры 28° С их смешивают в ферментере. Затем в ферментер высеивают qsp предкультуры 2.

Условия ферментации в ферментере являются следующими:

Перемешивание ⇒ 200 об/мин от 0 до 20 часов, затем 400 об/мин до завершения ферментации.

Аэрация ⇒ 400 л/ч от 0 до 18 часов, затем 825 л/ч с 24 часа до завершения ферментации.

Температура составляет 28° С.

рН устанавливают на значении 6,8 при помощи 1н NaOH.

Давление равно атмосферному.

Среда 2:

Среда 2, которая может быть альтернативой среде 1, имеет следующий состав:

- Сахароза 42 г/л (Eurosucre)

- NH₄NO₃ 1,15 г/л (Atochem)

- MgSO₄·_{7H2O 0,25 г/л (Bitter salz)}

- (NH₄)₂HPO₄ 0,217 г/л (Europhos)

- Растворимый препарат 36 г/л (Meyhall AG)

муки из зародыша карубы

- Органический противовспениватель 0,2 мл

- Смягченная вода qsp 1 л

Сахароза ⇒ Qsp грамм глюкозы растворяют в qsp 3 л смягченной воды. Устанавливают рН на уровне 5 с помощью Н₂SO₄ (10%). Раствор стерилизуют в сосудах Марьота в течение 30 минут при 120° С в автоклаве.

Азот + соли⇒ 17,25 г NH₄NO₃, 3,75 г MgSO₄·_{7H2O, 3,22 г (NH4)2HPO4, 525 г растворимого препарата муки из зародышей карубы и 3 мл противовспенивающего агента растворяют в qsp 7 л смягченной воды. Устанавливают рН раствора на уровне 6 с помощью Н2SO4 (10%). Смесь стерилизуют in situ в течение 45 минут при 120° С.}

1н гидроксид натрия ⇒ 40 г твердого NaOH растворяют в qsp 1 л дистиллированной воды. Раствор стерилизуют в сосудах Марьота в течение 30 минут при 120° С в автоклаве.

Растворимый препарат муки из зародышей карубы готовят путем разбавления муки смягченной водой до концентрации 6-15%. Этот раствор при необходимости может быть обработан ферментами типа щелочных, кислых и/или нейтральных протеаз; липаз; фитаз; щелочных, кислых и/или нейтральных фосфатаз; амилаз перед необязательной стадией декантации в горизонтальном вращательном декантаторе, которую проводят для удаления примесей, которые могут ухудшить качество конечного продукта.

По достижении всеми этими ингредиентами температуры 28° С их перемешивают в ферментере (среда 1 или 2). В ферментер затем высеивают qsp предкультуры 2.

Условия ферментации в ферментере 2 являются следующими:

Перемешивание ⇒ 200 об/мин от 0 до 20 часов, затем 400 об/мин до завершения ферментации.

Аэрация ⇒ 400 л/ч от 0 до 24 часов, затем 825 л/ч с 24 часа до завершения ферментации.

Температура составляет 28° С.

рН устанавливают на значении 6,8 при помощи 1н NaOH.

Давление равно атмосферному или составляет от 0,5 до 4 бар.

Результаты ферментации.

В зависимости от исследуемой культуральной среды продолжительность ферментации составляет от 45 до 65 часов, сухое вещество, которое может быть осаждено изопропанолом, составляет от 20 до 30 г/кг, и выход продукта, по весу, по отношению к использованному источнику углерода составляет от 50 до 70%. Полученное ферментационное сусло имеет светлоту и блеск, превышающие когда-либо полученные с другими источниками азота.

Пример 3

Этот пример описывает фазы предкультуры 1 и 2 для бактерий рода Agrobacterium tumefaciens.

Все компоненты смешивают в 1 литре питьевой воды, полученный раствор гомогенизируют путем перемешивания на магнитной мешалке и помещают в колбы Эрленмейера емкостью 500 мл порциями по 112 мл. Выдерживают в автоклаве от 15 до 30 минут при температуре 120° С.

Штамм первоначально сохраняют в пробирках, замороженных при температуре минус 196° С по способу замораживания в жидком азоте.

Для замораживания в жидком азоте получают предкультуру на среде RYS-10, имеющую следующий состав:

Для приготовления среды все ингредиенты диспрегируют в родниковой воде. Среду стерилизуют от 15 до 30 минут при температуре 120° С в автоклаве при естественном уровне рН.

После инкубации продолжительностью от 24 до 30 часов при температуре в интервале от 28 до 32° С при перемешивании на вибромешалке со скоростью 220 об/мин и амплитудой, равной 50 мм, в культуру добавляют 10% об. чистого стерильного глицерина. Затем культуру помещают в криопробирки вместимостью от 1 до 10 мл, предпочтительно от 2 до 4 мл. Указанные пробирки хранят в жидком азоте.

Предкультуру 1 высевают из предварительно размороженной на воздухе криопробирки. Весь объем при 50% содержимого криопробирки помещают в стерильных условиях в колбы Эрленмейера емкостью 500 мл, содержимое которых выдерживают в автоклаве и стерилизуют указанным выше образом.

Высеянную таким образом среду выдерживают в инкубаторе от 24 до 30 часов при температуре от 28 до 32° С при перемешивании на вибромешалке со скоростью 220 об/мин и амплитудой, равной 50 нм. После 24 часов инкубации получают предкультуру, уровень рН которой варьирует от 7 до 7,5, вязкость которой составляет от 50 до 500 МПа· с и плотность бактерий Agrobacterium tumefaciens выше 10¹⁰ колониеобразующие единиц (КОЕ) на мл.

Предкультура 2:

Предкультура 1 необходима для посева предкультуры 2.

Композиция среды в г/л

сахароза 10

мука из зародыша семени карубы 1,875

нитрат аммония 1,0

сульфат магния 7Н₂О 0,25

динатриевая соль фосфорной кислоты 3,0

рапсовое масло 2 мл/л

умягченная родниковая вода в необходимом количестве дообъема 1 л

Все компоненты суспендируют в 1 л умягченной родниковой воды, а уровень рН доводят до 6,8±0,1. Конечную среду помещают в колбы Эрленмейера емкостью 500 мл порциями по 112 мл и выдерживают в автоклаве от 15 до 30 минут при температуре 120° С.

Затем в указанные колбы Эрленмейера всевают от 0,1 до 0,2 мл предкультуры 1. Колбы помещают в инкубатор на период от 24 до 30 часов при температуре от 28 до 32° С при перемешивании на вибромешалке со скоростью 220 об/мин и амплитудой, равной 50 мм. После инкубации от 24 до 30 часов получают предкультуру, уровень рН которой варьирует от 6,8 до 7,5, вязкость составляет от 100 до 1000 МПа· с, а плотность бактерий Agrobacterium tumefaciens составляет более 10⁹ КОЕ/мл.

Пример 4

Этот пример описывает приготовление и получение экзополисахаридов путем ферментации тремя способами:

- в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл

- в лабораторных ферментерах емкостью 20 литров

- в экспериментальных ферментерах емкостью 1000 литров

Пример 4-1

Этап предкультур 1 и 2:

В этом Примере описываются два этапа “предкультуры”. Указанные этапы проводят в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл и используют по 100 мл среды (см. Пример 1).

Этапы предкультур 1 и 2 осуществляют также как в Примерах 1 и 2.

Последний этап является этапом получения экзополисахаридов.

Этап получения:

Среда 1: колбы Эрленмейера емкостью 500 мл (100 полезных мл)

Среда имеет следующую композицию (доводят до объема 1 л):

сахароза 25,00 г Eurosucre

мука из зародыша семени карубы 1,82 MeyhallAG

нитрат аммония 0,69 г Prolabo 21280293

К₂НРО₄ 4,00 Prolabo 26927292

молочная кислота 2,20 Prolabo

MgSО₄,· 7H₂О 0,25 Bittersalz

органический пеногаситель 0,50

умягченная вода в необходимом количестве до объема 1 л

Уровень рН конечной среды доводят до 6,9. Проводят стерилизацию колбы Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащей 100 мл среды, в автоклаве от 15 до 30 минут при температуре 120° С.

Проводят инкубацию при температуре от 28 до 32° С на виброшейкере с амплитудой 50 мм и скоростью 220 об/мин.

Завершение инкубации определяют по анализу на содержание сахарозы, которая должна быть ниже или равна 1,5 г/л).

Пример 4-2

Этап предкультур 1 и 2:

В этом Примере описываются два этапа “предкультуры”. Указанные этапы проводят в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл среды (см. Пример 1).

Этапы предкультур 1 и 2 осуществляют так же, как в Примерах 1 и 2.

Последний этап является этапом получения экзополисахаридов.

Этап получения:

Среда 2: лабораторные ферментеры емкостью 20 литров (15 полезных литров)

Последний этап является этапом получения экозополисахаридов.

Среда 2, которая может являться альтернативой среде 1, имеет следующий состав:

сахароза 32.00 г/л Eurosucre

растворимая фракция

муки из зародыша

семени карубы 2.30 г/л Meyhall AG

- NH₄NО₃ 0.86 г/л Prolabo 21280

- К₂НРО₄ 0.20 г/л Prolabo 26927

- MgSО₄, 7H₂О 0,25 г/л Prolabo 25165

- молочная кислота 2.00 г/л Prolabo 20536

- органический пеногаситель 0,2 мл/л

умягченная вода в необходимом количестве до объема 1 л

приготовление источников азота и углеводов осуществляют раздельно.

Сахароза ⇒ Необходимое количество граммов сахарозы растворяют в колбе Мариотта в умягченной воде в количестве, необходимом для получения 3 л раствора. Уровень рН уменьшают до 5,2 10%-ным раствором серной кислоты. Раствор стерилизуют в колбе Мариотта от 30 до 45 минут при температуре 120° С в автоклаве.

Мука из зародышей семени карубы + соли ⇒ Необходимое количество граммов растворимой фракции муки из зародыша семени карубы, 12,9 г NН₄NO₃, 3,75 г MgSО₄, 7H₂O и 3 мл пеногасителя растворяют в количестве умягченной воды, необходимом для образования 7 л раствора. Уровень рН доводят до 6,5 10%-ным раствором серной кислоты. Указанную смесь стерилизуют, не выделяя компоненты, от 30 до 45 минут при температуре 120° С.

Растворимую фракцию муки из зародыша семени карубы готовят растворением муки в умягченной воде с целью получения раствора с концентрацией от 6 до 10%. В указанный раствор перед возможным проведением декантации на горизонтальном вращательном декантаторе с целью устранения примесей, которые могут ухудшить качество конечного продукта, в случае необходимости добавляют ферменты типа щелочных, кислотных и/или нейтральных протеаз; липазы; фитазы; щелочные, кислотные и/или нейтральные фосфатазы; амилазы; органические кислоты.

Однонормальный раствор гидроксида натрия ⇒ 40 г таблеток NaOH растворяют в количестве дистиллированной воды, необходимом для образования 1 л раствора. Указанный раствор стерилизуют в колбе Мариотта 30 минут при температуре 120° С в автоклаве.

Когда все ингредиенты достигнут температуры от 28 до 32° С, их смешивают в ферментере. Затем в ферментер помещают необходимое количество предкультуры 2.

Условия ферментации в ферментере следующие:

- Перемешивание ⇒ 200 об/мин в течение от 0 до 20 часов, затем 400 об/мин до завершения ферментации

- Аэрация ⇒ 400 л/ч от 0 до 18 часов, затем 825 л/ч от 24 часов до завершения ферментации

- Температуру поддерживают в интервале от 28 до 32° С

- Уровень рН регулируют однонормальным раствором гидроксида натрия до величины 6,7±0,2.

Пример 4-3

Этап предкультур 1 и 2:

В этом Примере описываются два этапа “предкультуры”. Предкультуру 1 готовят в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл среды, а Предкультуру 2 готовят в ферментере емкостью 20 литров, содержащем 15 литров среды (см. Примеры 1 и 2).

Этапы предкультур 1 и 2 осуществляют также как в Примерах 1 и 2.

Последний этап является этапом получения экзополисахаридов.

Этап получения:

Среда 3: экспериментальные ферментеры емкостью 1000 литров (800 полезных литров).

Среда 3, которая может являться альтернативой средам 1 и 2, имеет следующий состав:

сахароза 32.00 г/л (Eurosucre)

NH₄NО₃ 0,94 (Hydro)

MgSО₄·_{7H2О 0,12 г/л (Bitter salz)}

K₂HPО₄ 0,10 г/л (Rhodia)

растворимая фракция муки

из зародыша семени карубы 26,60 г/л (Meyhall AG)

Молочная кислота 2,50 г/л Purac

органический пеногаситель 0,20 мл

умягченная вода в необходимом количестве до объема 1 л

Сахароза ⇒ Необходимое количество граммов сахарозы растворяют в умягченной воде в количестве, необходимом для получения 320 л раствора. Уровень рН доводят до 5,00 10%-ным раствором серной кислоты. Раствор стерилизуют в стерилизаторе емкостью 600 л от 30 до 45 минут при температуре 120° С.

Азот + соли ⇒ 750 г NH₄NO₃, 96 г MgSО₄, 7H₂O, 80 г K₂HPO₄ 21,3 кг растворимой фракции муки из зародыша семени кабуры и 150 мл пеногасителя растворяют в умягченной воде в количестве, необходимом для получения 230 л раствора. Уровень рН указанного раствора доводят до 6,00 концентрированной серной кислотой. Указанную смесь стерилизуют, не выделяя компоненты, в течение от 30 до 45 минут при температуре 120° С.

Растворимую фракцию муки из зародыша семени карубы готовят растворением муки в умягченной воде с целью получения раствора с концентрацией от 6 до 10%. В указанный раствор перед возможным проведением декантации на горизонтальном вращательном декантаторе с целью устранения примесей, которые могут ухудшить качество конечного продукта, в случае необходимости добавляют ферменты типа щелочных, кислотных и/или нейтральных протеаз; липазы; фитазы; щелочные, кислотные и/или нейтральные фосфатазы; амилазы.

Когда все ингредиенты достигнут температуры от 28 до 32° С, их смешивают в ферментере. Затем в ферментер помещают необходимое количество прекультуры 2.

Условия ферментации в ферментере 3 следующие:

- Перемешивание ⇒ 110 об/мин от 0 до 20 часов, затем 200 об/мин до завершения ферментации

- Аэрация ⇒ 25 Нм³/ч от 0 до 24 часов, затем 45 Нм³/ч от 24 часов до завершения ферментации

- Температуру поддерживают в интервале от 28 до 32° С

- Уровень рН регулируют раствором 300 г/л NaOH до 6,7±0.2

- Давление является атмосферным или повышенным и может находиться в интервале от 0,5 до 4 бар.

Результаты ферментации:

В соответствии с исследуемой средой культуры продолжительность ферментации может варьировать от 55 до 100 часов, сухие вещества, которые осаждают изопропанолом, варьируют от 15 до 25 г/кг, а весовой выход по отношению к используемому источнику углерода варьирует от 50 до 70%. Полученное сусло ферментации имеет светлоту, блеск, которые никогда не наблюдались ни у какого другого источника азота.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в строительной, бумажной, текстильной, косметической, пищевой, нефтедобывающей промышленности и в сельском хозяйстве. Предложен способ получения экзополисахарида путем культивирования микроорганизмов на питательной среде, содержащей один и более источников углерода, ассимилируемого микроорганизмами, и фракцию семян карубы в качестве органического источника азота. Применение предложенного способа позволяет получить экзополисахарид, обладающий улучшенными органолептическими, сенсорными и визуальными свойствами. 2 н. и 13 з.п. ф-лы.

1. Способ получения экзополисахаридов путем культивирования микроорганизмов на питательной среде, содержащей, по меньшей мере, один источник углерода, ассимилируемый микроорганизмами, и, по меньшей мере, один органический источник азота, отличающийся тем, что указанный источник азота происходит из фракции семян карубы.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержание протеинов во фракции семян карубы составляет по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60% по отношению к весу сухого вещества.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что протеины предпочтительно имеют высокое содержание аргинина, глутамина и/или глутаминовой кислоты и лизина.4. Способ по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что содержание липидов во фракции семян карубы составляет по меньшей мере 4%, предпочтительно по меньшей мере 5%, еще более предпочтительно 7-15% по отношению к весу сухого вещества.5. Способ по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что указанной фракцией является зародыш семени карубы.6. Способ по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что фракция семян карубы находится в виде муки.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что гранулометрия муки составляет 10-150 мкм.8. Способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что ферментацию проводят в питательной среде, дополнительно содержащей по меньшей мере один минеральный источник азота.9. Способ по п.8, отличающийся тем, что минеральный источник азота выбирают из нитратов аммония или натрия, фосфатов или сульфатов аммония по отдельности или в смеси.10. Способ по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что концентрация органического и, при необходимости, минерального источника азота в среде ферментации составляет 1-80 г/л, предпочтительно 3-50 г/л, еще более предпочтительно 5-30 г/л.11. Способ по одному из пп.1-10, отличающийся тем, что ассимилируемый источник углерода выбирают из глюкозы и сахарозы.12. Способ по одному из пп.1-11, отличающийся тем, что концентрация ассимилируемого источника углерода составляет 1-100 г/л, предпочтительно 15-80 г/л.13. Способ по одному из пп.1-12, отличающийся тем, что ферментацию проводят при температуре 15-100°С, предпочтительно 25-80°С, еще более предпочтительно 25-35°С.14. Способ по одному из пп.1-13, отличающийся тем, что микроорганизм выбирают из группы бактерий рода Xanthomonas, рода Alcaligenes, рода Agrobacterium, рода Arthrobacter, рода Azotobacter, рода Pseudomonas, рода Corynebacterium, грибов рода Sclerotium, рода Aspergillus и дрожжей рода Hansenula.15. Экзополисахарид, полученный способом по одному из пп.1-14, обладающий в 1%-ом водном растворе в дистиллированной воде, прозрачностью порядка 70-95%.