Способ получения 2-кето-L-гулоновой кислоты Советский патент 1993 года по МПК C12P7/60 

Настоящее изобретение относится к способу ферментативного получения 2-ке- TO-L-гулоновой кислоты, применяемой в качестве промежуточного соединения в синтезе L-аскорбиновой кислоты.

Известен способ получения 2-кето-1.-гу- лоновой кислоты из Р-ГЛЮКОЗЫ с использованием единичного бактериального штамма, полученного введением гена ре- дуктазы 2,5-дикето-О-гликоновой кислоты микроорганизма рода Corynebacterium в микроорганизм рода Erwinia применением методов генной инженерии, Однако этот способ неприемлем для использования в промышленности с точки зрения количеств образующейся 2-кето-1-гулоновой кислоты.

Наиболее близким техническим решением является способ получения 2-кето-Ь гулоновой кислоты путем культивирования рода Pseudogluconobacter в питательной среде с L-сорбозой.

Цель изобретения - повышение выхода целеього продукта.

Микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, включает, например, следующие штаммы, описанные в опубликованной заявке на Европейский патент N° 221707:

Beudogluconobacter Saccharoketogenes K591:FERMBP-1130 JFO 14464,

Pseudogluconobacter Saccharoketogenes 12-5:FERM BP-1129, JFO 14465PseudogluconobacterSaccharoketogenes TH 14-86:FERM BP-1.128 14466,

Pseudogluconobacter Saccharoketogenes 12-15, FERM BP-1132, JFO 14482,

Pseudogluconobacter Saccharoketogenes 12-4:FERM BP-1131, JFO 14483,

vi

00

00

о

CN VI

CJ

Pse. udogluconobacter Saccharoketogenes 12-3: PERM BP-1133, JFO 14484, : v

В последующем такие бактерии рода Pse udogluconobacter Saccharoketogenes могут называться бактериями окисления,

Используемые в настоящем изобретении редкоземельные элементы включают, например: скандий (Sc), иттрий (Y), лантан (La), церий (Се), празеодим (Pr), неодий(1х№), самарий (Sm), европий (Ей), гадолиний (Gd),

тербий (ТЬ), диспрозий (Dy), гольмий (НЬ), эрбий (Ег), тулий (Тт), иттербий (Yb), лютёций (Lu)..; : .:.-.:.;У- /...-,.: : .

Эти редкоземельные элементы могут быть введены в. виде металлического порошка или ила. Или же эти элементы могут быть Исподьзопаны в виде их соединений,

таких как их хлориды, карбонаты, сульфаты,

Нитраты, оксиды и оксэлаты. Элементы могут быть использованы по отдельности йл-и Сочетанием одного или более редкоземельного элемента, например, одновременно могут быть использованы карбонат цё рия с хлоридом лантана Кроме того, может быть использован сырой продукт, полученный в ходе выделения и1 очистки соответствующих элём ентоЬ,. . .- .: : ,

Количество редкоземельного элемента,

вводимого в культурную среду, выбирают Q

таком интервале концентраций, которые не ингибйруюТ рдст Используемого мйкроорга и изм а. Ка к пр а вил о, э ффе кти в н оё кол ичёство находится в интервале от 0,000001 до 0,1, предпочтительно от 0,0001 до 0,05% (мас./об.). . .: . . ; : :Что касается способа введения элемента в культуральйую среду;то элемент может быть введен в культурную срейу предварительно или же может подаваться периоди-

ё. с к и :: или ; Не п р е р ы в н 6 в ходе

кулЬТЙВИрОВанИЯ, -; ; / ,;: ;. -.

уч В предлагаемом способе при добавленйи к культуральной среде исхо дногЬ продукта (L-сорбозы) все количество его может быть добавлено к культурной Ьреде в начале культивирования,или же L-сорбоза может быть добавлена; несколькими порциями. или. йёпрёрывНо к жйдкой культуре. Концентрация L-сорбозы в культуральной среде может составлять (мас./об.), предпочтительно (мас./об.) в пересчёте на культурную среду.; .

В культуральной среде, используемой для культЙШрбвания вышеуказанной бактерии окисления,, источниками питания,усваиваемыми бактериальными штаммами,

являются источники углерода, источники

азота, неорганические соли, органические соли и следовые питательные вещества.

В качестве источника углерода может

быть использована L-сорбоза как таковая.

Кроме того, в качестве дополнительного источника углерода могут быть использованы,

например: глюкоза, фруктоза, глицерин, сахароза, лактоза, мальтоза, мелассы и т.п.

Источники азота включают, например: различные аммониевые соли (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид

аммония, фосфат аммония), содержащие азот неорганические или органические сое- динёния, такие как: замоченный кукурузный экстракт (далее сокращенно обозначаемый как ЗКЭ), пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, соевая мука, мука из хлопковых семян, мочевина и т.п.

: В качестве не-органических солей в дополнение к вышеперечисленным солям редкоземельных элементов могут быть

использованы соли калия, натрия, кальция, магния, ж елеза, марганца, кобальта, цинка, меди и фосфорной кислоты..

:В. качестве следовых питательных веществ нельзя Не указать на такие добавляемыё вещества, являющиеся существенным фактором ро:ста вышеуказанных бактерий, как СоА, пант огеновая кислота, биотип, ти- амин и рибофла вин. Кроме того, может быть добавлен флавино.вый мононуклеотид (далее сокращенно.рбозначаемый ФМН), проявляющий промотирующее действие на рост образование 2-кето-Ь-гулоновой кислоты, другие витамины, L-цистеин, L-глута- миновая кислота, тиосульфат натрия и т.п. в

виде отдельных соединений или срдержа- щих их пр иродных продуктов..

.Эти компоненты культуральной среды могут быть предварительно добавлены в культ ур.альную среду одной порцией, Или

же часть этих компонентов или все их количество может быть добавлено в жидкую культуру периодически или непрерывно,

В качестве способа культивирования может быть использована стационарная

культура, встряхиваемая культура или перемешиваемая культура и т.п. Однако для массового производства рекомендуется так называемая погруженная культура.

Разумеется, условия состояния культуры меняются в зависимости от конкретного вида штамма, конкретного вида штамма, конкретного Состава культуральной среды и т.п. Короче, условия могут быть выбраны для каждого конкретного случая такими, при которых целевой продукт может быть получен

с наибольшей эффективностью. Например, рекомендуют температуру культивирования р 25-35°С и значение рИ культуральной среды желательно в 5-9,

При культивировании в рекомендованных условиях в течение 10-120 ч 2-кето-1 -гу- лоновая кислота накапливается в самой высокой концентрации. В этом случае, поскольку по мере накопления целевого продукта, значение рН падает, для поддержания оптимального уровня рН, требуемого для микробиологического получения 2-кето-1 -гулоновой кислоты, могут быть добавлены соответствующие основные соединения, например, гидроксид натрия, гид- роксид калия или аммиак. Или же для поддержания оптимального уровня рН к культуральной среде может быть добавлена соответствующая буферная система.

В настоящем изобретении при культивировании .. микроорганизма рода Pseudogluconobacter в жидкой среде, содержащей L-сорбозу в присутствии редкоземельного элемента с образованием и накоплением 2-кето-1 -гулоновой кислоты в культуральной среде, количество аккумулируемой 2-кето-1 -гулоновой кислоты может быть значительно увеличено путем смешивания вышеуказанной бактерии окисления с другим микроорганизмом по сравнению с использованием одной только бактерии окисления, то есть микроорганизма, принадлежащего к роду Pseudogluconobacter. Перемешиваемые бактерии включают, например, бактерии, принадлежащие к родам Bacillus, Pseudomonas, Proteus, gitrobacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas, Flavobacterium, Mfckococcus, Escherichia и т.п.

Более конкретно используют следующие бактерии:

Bacillus cereus JFO 3131, Bacillus cereus JFO 12201 Bacillus.Licheniformis JFO 12108, Bacillus megaterum JFO 12090, Bacillus pumilus JFO 3022, Bacillus amyloliquefaciens JFO 13719, Bacillus subtilis JFO 3967 Pseudomonas mallophilia JFO 12056 . Proteus ineostans JFO 12692 Proteus Inconstans JFO 12930, Citrobacter freundii JFO 13544, Enterobacter cloacae JFO 3320, . Erwinia herbicola JFO 12686 Xanthomonas pisi JFO 13556 Flavobacterium meningosepticum JFO 12535.

Micrococcus variaus JFO 3765, Echerichiacoli JFO 3366. Жидкая культура, полученная культивированием любой из перечисленных бактерий в соответствующей среде при 20-40°С в течение 1-4 дней, может быть использована в качестве затравочной культуры подмешиваемого микроорганизма. Как правило, рекомендуют применять для засева количество, составляющее 1/10-1/1000 от бактерии окисления (Pseudogluconobacter). При 5 проведении смешанного культивирования - путем подмешивания к бактерии окисления подмешиваемого микроорганизма в таком количестве, которое промотирует рост .бактерии окисления, в результате происходит 0 окисление L-сорбозы в 2-кето- -гулоновую кислоту при более высокой концентрации сорбозы и в течение более короткого периода времени по сравнению с использованием одной только бактерии окисления. 5 Бактерия, используемая в качестве подмешиваемого микроорганизма, желательно, не обладает или обладает слабой способностью ассимилировать L-сорбозу, являющуюся исходным продуктом настоящего 0 изобретения, или 2-кето-1 -гулоновую кислоту, являющуюся целевым соединением настоящего изобретения. Другие условия культивирования такие же, что и в случае применения одной только бактерии окисле- 5 ния.

Кроме того, могут быть эффективно использованы и стерилизованные культуры определенных видов бактерий, отличных от вышеуказанных бактерий окисления, в каче- 0 стве компонента культуральной среды. Используемые бактерии включают, например, бактерии рода Bacillus. Pseudomonas, Citrobacter, Escherichia и Erwinia. Более конкретно используют следующие бактерии: 5 Bacillus cereus JFO 3131 Bacillus subtilis. JFO 3023, Bacillus pumilus JFO 12089 Bacillus megaterium JFO 12108 Bacillus amyloliquefaciens JFO 3022 0Pseudomonas frifolii JFO 12056 Citrobacter freundii JFO 12681 Escherichia coli JFO 3546 Erwinia herb icola JFO 12686 Эти бактерии могут быть культивирова- 5 ны в средах, в которых происходит их рост при 20-40°С в течение 2-4 дней. Полученная культура может быть стерилизована и добавлена к культуральной среде бактерии окисления настоящего изобретения в коли- 0 честве 0,5-5 об.% с целью промотировать рост бактерии окисления.

Образовавшаяся и аккумулированная в результате 2-кето-1 -гулоновая кислота может быть выделена и очищена известными 5 способами, основанными на использовании ее свойств..

2-кето-1 -гуло.новая кислота может быть выделена в виде свободной кислоты или же она может быть выделена, например, в виде

натриевой, калиевой, кальциевой или аммониевой соли.

В качестве способа выделения может быть использован, например, способ, в котором бактериальные клетки уда ля ют фильтрованием или центрифугированием по мере необходимости, после чего раствор концентрируют с добавлением активированного угля или без добавления его и отде- лением образовавшихся кристаллов фильтрованием и их перекристаллизацией с получением целевого соединения, может быть использована экстракция растворителем, хроматография, высаливание и т.п. Эти способы могут быть использованы по отдельности, в сочетании или повтором.

При получении 2-кето-Ь-гулоновой кислоты в свободном состоянии она может быть превращена, например, в натриевую, калиевую, кальциевую или аммониевую соль, а при получении кислоты в виде соли, та может быть превращена соответствующим способом в свободную кислоту или другую соль.

Образующуюся в культуральной среде 2-кето-Ьтулоновую кислоту определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в следующих условиях.

Условия проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии:

ВЭЖХ - система 655А.

Колонка - SCH 101Н (сульфонирован- ный полистирольный гель), 300 х 7,9 мм.

Скорость потока 0,8 мл/мин деление - 50 кг/см2.

. Подвижная фаза - разбавленная серная кислота (рН 2,1).

Детектирование - УФ (214 нм) и дифференциальный рефрактометр.

Время удерживания - 7.2 мин для 2-ке- To-L-гулоновой кислоты и 8,33 мин для L- сорбозы.

Нижеследующие примеры дополнительно в подробностях иллюстрируют настоящее изобретение, но без ограничения его объема. Все приведенные для культу- ральных сред процентные отношения даны в мае./об,, если нет особых указаний. Выхода для культур в примерах соответствуют мольному выходу 2-кето-1 -гулоновой кислоты в пересчете на используемую L-сорбозу.

Пример, Среду затравочной культуры (20 мл), содержащую 2% D-глюкозы, 1% пептона, 1% сухих дрожжей и 2% СаСОз, помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают 20 минут при 120°С в автоклаве. Колбу засевают одной петелькой штамма Pseudogluconobacter Saccharoketogenes (JFO 14464. FERM BP-1130), выращенного в среде скошенного агара (табл. 1) при 30°С в течение

3 дней и культивированного при встряхивании (200 об/мин), при 30°С в течение 2 дней. Полученную культуру (2 мл) переносят в ту же среду, что была описана выше, и культивируют в тех же условиях с получением вто. рой затравочной культуры..

В колбу Эрленмейера на 200 мл помещают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0.5% сухих дрожжей. 0,3% сульфата аммония, 0,05% ЫааЗгОз .5НаО,

0 0,1 % FeSCMJHaO, 0,005% CeCI3.7H20, 3,5% СаСОз (Ака dama) и 9,5% L-сорбозы (стерилизуют отдельно) и выдерживают 20 мин при 120°С в автоклаве,

Полученную среду засевают вышеука5 занной второй затравочной культурой (1,25 мл) и культивируют при встряхивании и 30°С в течение 2 дней. Полученный в результате ферментативный раствор содержит 86,4 мг/мл 2-кето-1.-гулоновой кислоты (выход

0 84,4%) в соответствии с анализом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ферментативный раствор, полученный в результате культивирования тем же способом, но без добавления в среду

5 .хлорида цезия, содержит 51 мг/мл 2-кето- - гулоновой кислоты (выход 49,8%).

П рим ер2. Штаммы Pseudoluconobacter Saccharoketogenes 12-4 {JFO 14483, FERM BP-1131), 12-5 (JFO 14465, PERM BP-1129),

0 12-15(JFO-14482, FERM BP-1132)и 22-3 (JFO 14484, FERIV1 BP-1133) культивируют способом пример а 1 с получением вторых затравочных культур.

В колбу Эрленмейера на 200 мл помё5 щают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония. 0,05% Na2S03.5H20, 0,01% FeS04.7H20. 0,05% Се2(СОз):8Н20. 3,5% СаСОз (Ака dama) и 9,5% L-сорбозы

0 (стерилизуют отдельно), и выдерживают в автоклаве 20 мин при 120°С.

Каждую из вышеуказанных вторых затравочных культур (1,25 мл) помещают в колбу Эрленмейера, содержащую

5 ферментативную среду, и культивируют 3 дня при встряхивании и 30°С. Полученный в результате ферментативный раствор анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

0

Полученные результаты приведены в табл.2, где указаны количества образовавшейся 2-кето-1 -гулоновой кислоты (мг/мл) вместе с количествами, полученными при

5 кул ьтивировании в среде без добавления Се(СОз)з.

П римерЗ. Штамм Pseudogluconobacter Saccharoketogenes TH14-86 (JFO 14466, FERM BP-1128) культивируют по методике.

описанной в примере 1, с получением второй затравочной, культуры.

В колбу Эрленмейера на 200 мл помещают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% Na2.S203.5H20, 0,1% РеЗОл, 5% СаСОз (Ака dama) и 10,5% L-сорбозы (стерилизована отдельно), и выдерживают 20 минут в автоклаве при 120°С. Вышеуказанную вторую затравочную культуру (1,25 мл) переносят в колбу Эрленмейера с ферментативной средой и культивируют 2 дня при встряхивании и 30°С. В этих условиях культивирование встряхиваемой культуры проводят путем добавления 0,0.1% хлорида иттрия, лантана, церия, неодия, самария, европия, гадолиния, тербия, диспрозия,гольмия, эрбия или иттербия, или оксида празеодия или 0,05% оксида скандия при 30°С в течение 2 дней. Полученный в результате ферментативный раствор анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Количество образовавшейся 2-кето-Ь гулоновой кислоты в культурэльной среде (мг/мл) приведено в табл.3. .

.П р и м е р 4. По методике примера 1 культивируют штамм Pseudogluconobacter Saccharoketogenes TH14-86 использованием той же ферментативной среды, что и в примере 1, в которую добавлен оксид, хлорид, карбонат, нитрат или оксалатлантана, или оксид, хлорид, сульфат или карбонат, нитрат или оксалат лантана, или оксид, хлорид, сульфат или карбонат церия в количествах, указанных в табл.,4. В данном случае время культивирования 30 ч..Количество образовавшейся в ферментативном растворе 2-кето-1 -гулоновой кислоты (мг/мл) определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Полученные результаты приведены в табл.4, где также даны результаты для культур без добавки редкоземельного элемента.

П р и м е р 5. Микробиэльные клетки Bacillus megaterium (JFO 12108), выращенные в среде скошенного агара (состав в табл.1) при28°С в течение 2 дней, суспенди- руют в ТО мл стерилизованной воды и все количество переносят в колбу Сакагучи, .содержащую затравочную культуру примера 1 (500 мл), и культивируют при возвратно-поступательном встряхивании (85 встряхиваний в мин) и 28°С в течение 2 дней с получением затравочной культуры Bacillus megaterium. Среду (30 литров, рН 7), содержащую 4% сахарозы, 0,65% foHPO), 0,05% сульфата аммония,-4% муки хлопковых семян, 0,05% NaCI, 0,05% MgSO.7H20 и 0,05% кальциевой соли пантогеновой кислоты, загружают в ферментатор на 50 литров и выдерживают в автоклаве 20 мин при 125°С. Ферментатор засеивают затравочной культурой Bacillus megaterium (1 л) и 5 культивируют 4 дня в следующих условиях: перемешивание 200 об/мин, аэрация - 24 л/мин, внутреннее давление 1 кг/см2, температура 28°С. Полученную культуру выдерживают в автоклаве 20 мин при 120°С.

0 хранят в холодном месте и в качестве одного из компонентов ферментативной среды используют стерилизованную культуру Bacillus megaterium (далее называемой ме- га-бульоном).

5 Затравочную культуру примера 1 (20 мл) помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают20 мин в автоклаве при 120°С. Одной петелькой микробиальных клеток Pseudogluconobacter ТН14-86, выращенных

0 на среде скошенного агара (состав табл.1) при 28°С в течение 4 дней, засевают содержимое вышеуказанной колбы и культивируют 2 дня при 30°С и встряхивании. Полученную культуру (20 мл) помещают в

5 колбу Эрленмейера на 1 л, содержащую культуральную среду (200 мл), в которой содержится 2% D-глюкозы, 3% (об./об.) мега- бульона, 1% ЗКЭ, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1 % пептона, 0,3% сульфата ам0 мония и 2% СаСОз (Acadama), и культивируют 2 дня при 30°С и встряхивании с получением второй затравочной культуры штамма ТН14-86.

Отдельно в колбу Эрленмейера на 200

5 мл с затравочной культурой примера 2 (20 мл) высевают одну петельку микробиальных клеток Bacillus megaTerium JFO 12108, выращенных в течение 2 дней при 28°С на среде скошенного агара, и подвергают культиви0 рованию при встряхивании и 28°С в течение 2 дней с получением культуры подмешиваемого микроорганизма.

L-сорбозу (72 г) растворяют в воде до объема в 300 мл, после чего в воде раство5 ряют или суспендируют ЗКЭ (60 г), сухие дрожжи (6 г), сульфат аммония (9 г), Fe2SO i.7H20 (3 г), ФМН (3 мг), тиамин (3 мг), биотип (1,5 мг) и актокол (0,5 г) до общего объема в 800 мл. Отдельно суспендируют в

0 воде до объема 1000 мл СаСОз (240 г, Acadama) и Се2(СОз)з.8НгО (150 мг). После выдерживания каждой из сред 20 минут в автоклаве при 120°С их загружают в ферментатор на 5 литров, который предвари5 тельно стерилизуют.

Вторую затравочную культуру вышеуказанного штамма ТН 14-86 (300 мл) и затравочную культуру подмешиваемого микроорганизма (4 мл) высевают в ферментатор и начинают культивирование в следующих условиях: температура 30°С, аэрация 2,4 л/мин, скорость перемешивания 800 об./мин.

Отдельно растворяют в воде до объема 900 мл L-сорбозу (528 г) и аС1з.7Н20 (150 мг). Растворяют в воде до общего объема в 100 мл сульфата аммония (6 г) и FeS04.7H20 (3 г). Полученные растворы выдерживают 20 мин в автоклаве при 120°С, после чего сме- шивают в асептических условиях. На 6-й час после начала культивирования эту смесь непрерывно добавляют в фермёнтатор и добавление заканчивают за 24 ч. ПоЈле завершения добавления смеси культивирование продолжают еще 8 ч (общее время культивирования 38 ч). За это время усвоение L-сорбозы в культуре полностью завершается и в результате получают 3,16 литра ферментативного раствора, содержащего 176 мг/мл 2-кето-Ьтулоновой кислоты (вы- ход 86%).

Отдельно в вышеописанных условиях проводят культивирование, однако ни Се2(СОз)з.8Н20, ни .7Н2.0 не добавляют. В этом случае при продолжении культи- вирования еще 22 ч после добавления смеси происходит полное усвоение L-сорбозы (полное время культивирования 52 ч). В полученном в результате ферментативном растворе (3,09 л) содержится 161,4 мг/мл 2-кето-Ь-гулоновой кислоты (выход 77,1 %).

Пример 6. К перемешиваемому ферментативному раствору примера 5, содержащему 176 мг/мл 2-кето-1-гулоновой кислоты (1 л), добавляют примерно 260 мл 6N серной кислоты и образовавшиеся нерастворимые вещества, такие как сульфаты и клетки, удаляют центрифугированием. Полученный раствор (1150 мл) пропускают черезколонку, заполненную катионообменной смолой 1R120 В (Н+-тип) (200 мл), после чего колонку промывают дистиллированной водой (150 мл). Элюат и промывные растворы объединяют и пропускают через колонку, заполненную углем для хроматографии (200 мл), после чего колонку промывают дистиллированной водой (150 мл). Объединенный раствор элюата и промывных вод (1450 мл) концентрируют до 250мл при пониженном давлении и пример- но при 50°С. Концентрат оставляют на сутки при 5°С с отделением 2-кето-и-гулоновой кислоты. Образовавшиеся кристаллы отделяют фильтрованием, промывают небольшим количеством охлажденной воды, 50%-ным холодным метёнолом и хол одным метанолом. Полученное вещество сушат над пятиокисью фосфора при пониженном давлении с получением 156 г (выход 81,1%) бесцветных кристаллов моногидрата 2-кето-1-гулоновой кислоты. Температура плавления 171°С (с разложением).

Элементный анализ для СбНю07.Н20

(%)

Вычислено: С 33,97; Н 5,62

Найдено: С 33,91, Н 5,65

Удель.ное вращение - ( а)о18 - 48° (.0,Н20)

Пример. Одной петелькой микроби- альных клеток штамма Pseudogluconobacter Saccharoketogenes TH14-86 засевают колбу Эрленмейера на 200 мл со средой (20 мл), содержащей 2% D-глЮкозы, З об.% мега- бульона, 1% ЗКЭ, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% пептона, 0,3% сульфата аммония и 2% СаСОз и подвергают культивированию в течение 2 дней при 30°С и встряхивании. Полученную культуру (2 мл) переносят в колбу Эрленмейера на 200 мл с той же средой (20 мл) и культивирование проводят тем же способом с получением второй затравочной культуры бактерии окисления.

Ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% х а2520з.5Н20, 0.1% FeS04.7H20, 5% СаСОзи 12,5% L-сорбозы (стерилизуют отдельно), помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают 20 мин в автоклаве при 120°С. Отдельно стерилизованный .7Н20 в количестве, указанном в табл.5, добавляют в колбу Эрленмейера, содержащую вышеприведенную ферментативную среду, и содержимое колбы засевают вышеописанной второй затравочной культурой (1,25 мл) и затравочной культурой подмешиваемого микроорганизма, приготовленного в примере 5 (0,1 мл).

Количества образовавшейся при культивировании встряхиванием ферментативного раствора (30°С, .3 дня), 2-кето-Ь-гулоновой кислоты приведены в табл.5.

П р и м е р 8. По методике примера 1 культивированием штамма ТН14-86 бактерий окисления получают вторую затравочную культуру. Ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% Na2S203.5H20, 0,1% FeS04.7H20, 2.5% СаСОз и 7,5% L-сорбозы (стерилизуют отдельно), помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и стерилизуют. Отдельно стерилизованный .7Н20 в количестве, указанном -в табл.6, помещают в колбу Эрленмейера в указанную ферментативную среду, которую засевают выше приведенной второй затравочной (1,25 мл).

Количества 2-кетоЧ -гулоновой кислоты (мг/мл) в ферментативном растворе, полученном культивированием встряхиванием при 30°С в течение 3 дней, приведены в табл.6.

П р и м е р 9. По методике примера 7 культивированием штамма ТН14-86 бактерии окисления получают вторую затравочную культуру. Ферментативную среду (20 мл), содержащую 2% ЗКЭ.0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% Na2S203.5H20, 0,1% Ре5См.7Н20, 5% СаСОз, 12% L-сорбозы, а также добавки, указанные в табл,7, в соответствующих количествах помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и стерилизуют. Содержимое колбы засевают вышеуказанной второй затравочной культурой (1 мл) и подвергают культивированию в течение 2 дней при 30°С и встряхивании, Количество образующейся 2-кето-1 -гулоновой кислоты (мг/мл) в полученной культуре определяют с помощью

высокоэффективной жидкостной хроматог- рафии.

Полученные результаты приведены в

табл.7, где также указаны результаты, полученные при культивировании без добавок.

Формула изобретения Способ получения 2-кето-Ьгулоновой кислоты путем культивирования микроорганизмов рода Pseudogluconobacter в питательной среде с L-сорбозой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, на стадии ферментации в питательную среду вносят

редкоземельный элемент в количестве 0,000001-0,1 мас.%, при этом в процессе культивирования поддерживают концентрацию L-сорбозы 2-40%, рН среды от 5 до 9 и температуру 25-35°С. а культивирование

осуществляют в течение 10-120 ч.

Изобретение относится к способам ферментативного получения 2-кето-1 -гулоновой кислоты, применяемой в качестве промежуточного соединения в синтезе L-аскорбиновой кислоты. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Способ получения 2-кето-Ыулоновой кислоты включает культивирование микроорганизмов рода Pseudogluconobacter в питательной среде с L-сорбозой, при этом на стадии ферментации в питательную среду вносят редкоземельный элемент в количестве 0,000001-0,1 мас.%, при этом в процессе культивирования поддерживают концентрацию L - сорбозы 2-40%. рН среды 5-9 и температуру 25-35°С, а культивирование осуществляют в течение 10-120 ч. 7 табл. (Л С

Цифры в скобках означают усредненный выход.

Таблица 1

Таблица 2

Цифры в скобках означают усредненный выход.

Таблица 3

Цифры в скобках означают усредненный выход.

Количество добавленного -7Н20

О

0,00001 0,0001 0,001 0,01 - OJ

Цифры в скобках показывают усредненный выход.

Таблица 5

Таблица б

Количество образующейся 2-кето- -гулоно- вой кислоты, мг/мл

30,0/37,1%/ 61,2 /75,7%/ 67,1 /83,0%/ 70,7/87,5%/ 70,6 /87,4%/ 70,5/87.2%/

Таблица 7