СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2000 года по МПК C12P19/04 C12N1/16 C08B37/00 C12N1/16 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской, косметической и пищевой промышленности и может быть использовано для производства медицинских препаратов, косметических средств и биологически активных добавок к пище.

Известны способы получения полисахаридов дрожжей рода Cryptococcus путем культивирования с использованием питательных сред, на которых в процессе биосинтеза pH среды снижается ниже 5 (1,2). При этом синтезируются два продукта: гетерополисахарид и гомополисахарид (глюкан). Биологической активностью обладает гетерополисахарид, а глюкан является побочным продуктом (3).

С целью получения только биологически активного гетерополисахарида с помощью дрожжей рода Cryptococcus, в том числе Cr.laurentii, используют способ получения путем культивирования на питательной среде, в которой присутствием буферной системы, создаваемой избытком фосфорных солей, pH поддерживается на нейтральном уровне, чем исключается синтез побочного продукта.

По этому способу дрожжи культивируют на среде следующего состава, г/л:
Глюкоза - 50
Пептон - 2,0
KH₂PO₄ - 3,56
Na₂HPO₄•2H₂O - 7,22
MgSO₄•7H₂O - 0,5
NaCl - 0,5
CaCl₂•2H₂O - 0,001
MnCl₂•4H₂O - 0,0015
FeSO₄•7H₂O - 0,01
Дрожжевой автолизат (мл) - 10
Дистиллированная вода - До 1 л
(4,5).

При этом длительность процесса биосинтеза составляет 120 ч. Культуральную жидкость разбавляют в 2-3 раза дистиллированной водой и отделяют клетки центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант концентрируют вакуум-упариванием при 40-60^oC в 5 раз и осаждают гетерополисахарид 2 объемами этилового спирта. Осадок дважды промывают этиловым спиртом и сушат при температуре 37^oC.

Недостатками способа являются сравнительно небольшой выход целевого продукта (6-8 г/л), длительность процесса биосинтеза (120 ч), высокая зональность продукта (28-30%).

Задачей изобретения является разработка способа получения гетерополисахарида, который обеспечивал бы повышение выхода и улучшение качества целевого продукта, сокращение времени биосинтеза.

Задача изобретения реализуется предлагаемым способом, включающим культивирование дрожжей Cr. laurentii на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, сульфаты магния и железа, хлориды натрия и марганца, дрожжевой автолизат и регулятор pH, разбавление культуральной жидкости, отделение клеток дрожжей, упаривание супернатанта и осаждение из него гетерополисахарида.

В качестве регулятора pH среда содержит углекислый кальций и имеет следующее соотношение компонентов, г/л:
Глюкоза - 36 - 40
Пептон - 0,4 - 0,7
CaCO₃ - 1,5 - 1,8
MgSO₄•7H₂O - 0,45 - 0,55
NaCl - 0,45 - 0,55
MnCl₂•4H₂O - 0,001-0,002
FeSO₄•7H₂O - 0,01 - 0,02
Дрожжевой автолизат, мл - 10 - 15
Дистиллированная вода - До 1 л
Способ иллюстрируется следующими примерами (см. табл. 1).

На этих средах проводят культивирование Cr.laurentii при 24 ± 0,5^oC и скорости перемешивания 220 об/мин. Культуральную жидкость разбавляют в 2-3 раза дистиллированной водой. Клетки отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант концентрируют вакуум-упариванием при 40-60^oC в 5 раз и осаждают 2 объемами этилового спирта. Осадок гетерополисахаридов дважды промывают этиловым спиртом и сушат при 37^oC.

Сравнение показателей биосинтеза и состава гетерополисахаридов приведено в табл. 2, 3.

Таким образом, по сравнению с прототипом для получения гетерополисахарида вместо фосфорных солей, используемых для регуляции pH среды и составляющих 14,5% от всех компонентов питательной среды, в ее состав введен CaCO₃, составляющий в среднем 3% от всех компонентов. Количество глюкозы снижено в среднем на 24%, пептона - в среднем на 73%. При этом идет более быстрая и полная утилизация источников углеродного и азотного питания. Выход гетерополисахарида увеличился в среднем на 57%, удельная продуктивность процесса повысилась более чем в 2 раза. Продукт при том же моносахаридном составе (табл. 3) содержал значительно меньшее количество зольных веществ и имел большую относительную вязкость (табл. 2), что увеличивает возможности использования гетерополисахарида в качестве биологически активного вещества.

Литература
1. Harada T., Fukui T., Nikuni Z., Banno I., Hasegawa T. J.Agric. Chem. Soc.Japan, 1963, т. 37, N 4, с. 226-230.

2. Елинов Н.П., Витовская Г.А. Биохимия, 1970, т. 35, N 6, с. 1187-1192.

3. Витовская Г.А. Микробиологический журнал, 1986, т. 48, N 3, с. 91-101.

4. Витовская Г.А., Ананьева Е.П., Гринберг Т.А., Буклова В.Н., Козлов А. И. Прикладная биохимия и микробиология, 1983, т. 19, N 6, с. 728-792.

5. Витовская Г.А., Самаркина Г.М., Ананьева Е.П., Синицкая И.А. Микробиология, 1989, т. 58, N 2, с. 240-245.

Изобретение может быть использовано для производства медицинских препаратов, косметических средств и биологически активных добавок к пище. Способ включает культивирование дрожжей Cryptococcus laurentii на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, сульфаты магния и железа, хлориды натрия и марганца, дрожжевой автолизат и регулятор рН, разбавление культуральной жидкости, отделение клеток дрожжей, упаривание супернатанта и осаждение гетерополисахарида. В качестве регулятора рН питательная среда содержит углекислый кальций. Способ позволяет увеличить выход целевого продукта более чем на 50%, улучшить его качество, сократить время культивирования на 24 ч. 3 табл.

Способ получения гетерополисахарида путем культивирования дрожжей Cryptococcus laurentii на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, сульфаты магния и железа, хлориды натрия и марганца, дрожжевой автолизат и регулятор pH среды, разбавления культуральной жидкости, отделения клеток дрожжей, упаривания супернатанта и осаждения из него гетерополисахарида, отличающийся тем, что используют питательную среду, содержащую в качестве регулятора pH углекислый кальций, при следующем соотношении компонентов, г/л:
Глюкоза - 36 - 40
Пептон - 0,4 - 0,7
CaCO₃ - 1,5 - 1,8
MgSO₄ • 7H₂O - 0,45 - 0,55
NaCl - 0,45 - 0,55
MnCl₂ • 4H₂O - 0,001 - 0,002
FeSO₄ • 7H₂O - 0,01 - 0,02
Дрожжевой автолизат(мл) - 10 - 15
Вода - До 1 л