СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО БАКТЕРИОФАГА Российский патент 1999 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в технологии получения бруцеллезных бактериофагов.

Известен способ получения бруцеллезного бактериофага, по которому смешивают 0,3 мл бактериофага в наименьшем разведении с 0,6 мл 6-ти часовой культуры индикаторного штамма. Смесь выдерживают в течение 30 мин при 37^oC на водяной бане, затем выливают во флакон с бульоном Мартена и помещают на 6 ч при + 4^oC затем инкубируют в течение 18 ч при 37^oC. Смесь центрифугируют 60 мин при 6000 об/мин, сливают 50% супернатанта и фильтруют остаток (Parnas J. Brucella phage, properties and application, Basel, New York, 1963.- 32 P. ).

Способ достаточно прост и кратковременен в исполнении, однако выход готового продукта недостаточно высок, так как при предварительном смешивании культуры с бактериофагом и последующей инкубацией не обеспечивается достаточной адсорбции бактериофага на поверхности микробной клетки.

Известен способ культивирования бактериофагов энтеробактерий (А.с. СССР, N 1058283, C 12 N 7/00, Бюл. N 31, 10.11.95).

С целью повышенного выхода бактериофага, культивирование бактерий-хозяев проводят в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде, содержащей источник азота, углерода и минеральные соли при pH 7,2-7,8, посевной дозе 0,1-5% от максимальной концентрации бактерий, скорости перемешивания 500-1200 об/мин, скорости аэрации 0,5-2 объема воздуха/объем питательной среды в 1 мин и концентрации растворенного кислорода 40-70% от полного насыщения. Заражение бактериофагом осуществляют в первой половине фазы экспоненциального роста бактерий при достижении их концентрации 2-10•10⁹ кл/мл из расчета 1 фаговая частица на 1-500 бактериальных клеток. Инкубирование смеси проводят в течение 30-60 мин при тех же значениях pH и pO₂.

Способ может быть реализован в условиях современного биотехнологического аппаратурного оформления в серийном производстве. Кроме того с учетом специфических особенностей возбудителя бруцеллеза, в частности, его медленного роста на питательных средах, режим интенсивной аэрации и перемешивания среды культивирования не будет способствовать достаточно полной абсорбции бактериофага на поверхности микробной клетки.

Наиболее близким к заявляемому способу является методика размножения бруцеллезного бактериофага (M.J.Corbel, E.L.Thomas. The Brucella phage: their properties, characterisation and application, Weybridge, 1980,- P. 25).

По этой методике готовят взвесь агаровой культуры бруцелл в бульоне до концентрации 10¹⁰ КОЕ (колониеобразующих единиц)/мл. 1 мл этой взвеси добавляют к 150 мл бульона и инкубируют в течение 4-6 ч при 37^oC. Затем асептически вносят 1 мл фага (около 10⁹ БОЕ (бляшкообраэующих единиц), смесь инкубируют на шюттеле 24-36 ч, помещают при + 4^oC на 12 ч, центрифугируют 15 мин при 10000 об/мин. Супернатант фильтруют через мембранные фильтры.

Способ является достаточно длительным, недостаточен выход бактериофага.

Целью изобретения является повышение выхода бактериофага, сокращение времени процесса.

Поставленная цель достигается тем, что взвесь культуры готовят на бульоне Мартена, содержащем сернокислый кальций и магний, до концентрации 10⁹ КОЕ/мл, инкубируют взвесь в течение 4-6 ч при 37^oC, добавляют в нее гомологичный бактериофаг в количестве обеспечивающем множественность инфекции равной 0,01-0,001 (т. е. приблизительно 10⁷-10⁶ бляшкообразующих единиц БОЕ/мл), затем смесь подогревают 20-30 мин при 37^oC, разбавляют бульоном Мартена и инкубируют в течение 24-36 ч при 37^oC.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Соотношение количество бактериофага и микробных клеток бруцелл, выполняемое с учетом множественности инфекции равной 0,01-0,001 обеспечивает размножение бактериофага внутри бактериальной клетки, а не способствует разрушению микробных клеток за счет "лизиса извне". В частности, при внесении 0,1 мл бактериофага концентрацией 10⁷ БОЕ/мл на 100 мл бульона Мартена концентрация получаемого фага составляет 10¹⁰-10¹¹ БОЕ/мл, по прототипу вносят 1 мл фага с концентрацией 10⁹ БОЕ на 150 мл взвеси культуры бруцелл.

Предварительная инкубация смеси фаг-культура в течение 20-30 мин при 37^oC обеспечивает необратимость адсорбции бактериофага на клеточных рецепторах.

Разбавление смеси фаг-культура бульоном Мартена с последующим инкубированием в течение 24-36 ч при 37^oC способствует эффективному процессу размножения бактериофага.

Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемая совокупность технологических приемов обеспечивает наиболее благоприятные я эффективные условия адсорбции бактериофага на поверхности микробных клеток и соответственно, повышению выхода готового продукта, кроме того исключает необходимость длительного выдерживания смеси на холоде (+4^oC), что значительно сокращает процесс получения бактериофагов.

Заявляемые пределы множественности инфекции 0,01-0,001 и времени инкубирования смеси фаг-культура 20-30 мин при 37^oC экспериментально установлены оптимальными. При их снижении не обеспечивается необратимость процесса адсорбции и не достигается выход бактериофага высокой концентрации, увеличение этих показателей является нецелесообразным.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Готовят взвесь культуры штамма размножения концентрацией ≈ 10⁹ КОЕ/мл в бульоне Мартена, дополнительно содержащем сернокислый кальций и магний в концентрации 10^-2-10^-3 М каждой. Взвесь выращивают при 37^oC в течение 5-6 ч, затем смешивают 0,1 мл взвеси и 0,1 мл бруцеллезного бактериофага с концентрацией 10⁷-10⁶ БОЕ/мл. Смесь выдерживают при 37^oC 20-30 мин, после чего переносят в 100 мл бульона Мартена и выращивают в течение 24-36 ч при 37^oC. Центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин и фильтруют. Определяют концентрацию бактериофага.

Возможность практического применения заявляемого способа подтверждается примерами его конкретного выполнения полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. В качестве системы фаг-культуры были использованы:
1. B.abortus 19 + бруцеллезный бактериофаг Tб;
2. B.abortus 19 + бруцеллезный бактериофаг Fi;
3. B.suis 1330 + бруцеллезный бактериофаг Wb.

Готовят взвесь указанных культур возбудителя бруцеллеза концентрацией ≈ 10⁹ КОЕ/мл в бульоне Мартена, дополнительно содержащем сернокислый кальций и магний в концентрации 10^-2-10^-3 М каждой. Взвесь выращивают при 37^oC в течение 5-6 ч, затем смешивают 0,1 мл взвеси и 0,1 мл бруцеллезного бактериофага с концентрацией 10⁷ БОЕ/мл (множественность инфекции 0,01). Смесь выдерживают при 37^oC 20 мин, после чего переносят в 100 мл бульона Мартена и выращивают в течение 24-36 ч при 37^oC. Центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин и фильтруют. Концентрация полученного бактериофага составляет 5•10¹⁰ БОЕ/мл.

Пример 2. В качестве системы фаг-культура были использованы:
1. B. abortus 19 + бруцеллезный бактериофаг Tб;
2. B. abortus 19 + бруцеллезный бактериофаг Fi;
3. B.suis 1330 + бруцеллезный бактериофаг Wb.

Готовят взвесь указанных культур возбудителя бруцеллеза концентрацией ≈ 10⁹ КОЕ/мл в бульоне Мартена, дополнительно содержащем сернокислый кальций и магний в концентрации 10^-2 - 10^-3 М каждой. Взвесь выращивают при 37^oC в течение 5-6 ч, затем смешивают 0,1 мл взвеси и 0,1 мл бруцеллезного бактериофага с концентрацией 10⁶ БОЕ/мл (множественность инфекции 0,001). Смесь выдерживают при 37^oC 30 мин, после чего переносят в 100 мл бульона Мартена и выращивают в течение 24-36 ч при 37^oC. Центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин и фильтруют. Концентрация полученного бактериофага составляет 8•10¹⁰ БОЕ/мл.

Пример 3. В качестве системы фаг-культура были использованы:
1. B.abortus 19 + бруцеллезный бактериофаг Tб;
2. B.abortus 19 + бруцеллезный бактериофаг Fi;
3. B.suis 1330 + бруцеллезный бактериофаг Wb.

Готовят взвесь указанных культур возбудителя бруцеллеза концентрацией ≈ 10⁹ КОЕ/мл в бульоне Мартена, дополнительно содержащем сернокислый кальций и магний в концентрации 10^-2-10^-3 М каждой. Взвесь выращивают при 37^oC в течение 5-6 ч, затем смешивают 0,1 мл взвеси и 0,1 мл бруцеллезного бактериофага с концентрацией 5•10⁶ БОЕ/мл (множественность инфекции 0,005). Смесь выдерживают при 37^oC 25 мин, после чего переносят в 100 мл бульона Мартена и выращивают в течение 24-36 ч при 37^oC. Центрифугируют 20 мин при 8000 об/мин и фильтруют. Концентрация полученного бактериофага составляет 1•10¹¹ БОЕ/мл.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит организовать производство бруцеллезного бактериофага, так как предлагаемый способ проще и обеспечивает более высокий выход готового продукта по сравнению с известными аналогичными решениями.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Готовят взвесь культуры возбудителя бруцеллеза на бульоне Мартена, содержащем сернокислый кальций и магний, до концентрации 10⁷ КОЕ/мл. Инкубируют взвесь в течение 4-6 ч при 37°С, добавляют в нее гомологичный бактериофаг в количестве, обеспечивающем множественность инфекции, равной 0,01-0,001 (т.е. приблизительно 10⁷-10⁶ БОЕ/мл). Затем смесь подогревают 20-30 мин при 37^oС, разбавляют бульоном Мартена и инкубируют в течение 24-36 ч при 37°С. Способ обеспечивает повышение выхода бактериофага и сокращение продолжительности процесса.

Способ получения бруцеллезного бактериофага, включающий приготовление взвеси культуры в питательном бульоне, инкубирование взвеси в течение 4 - 6 ч при 37^oС, добавление гомологичного бактериофага, инкубирование смеси в течение 24 - 36 ч при 37^oС, отличающийся тем, что взвесь культуры готовят в бульоне Мартена, содержащем сернокислый кальций и магний, бактериофаг добавляют в количестве, обеспечивающем множественность инфекции, равную 0,01 - 0,001, перед инкубированием смесь прогревают в течение 20 - 30 мин при 37^oС и разбавляют бульоном Мартена.