СРЕДСТВО, ПОДАВЛЯЮЩЕЕ ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ВЫЗЫВАЮЩЕЕ ГИБЕЛЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, ПРИ ЭТОМ ЗАЩИЩАЮЩЕЕ НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ Российский патент 1999 года по МПК A61K31/71 

Изобретение относится к фармакологии, а именно к биологически активным веществам, получаемым путем микробиологического синтеза, которые могут применяться в медицине и ветеринарии при разработке лекарственных средств для лечения различных онкологических заболеваний, в качестве иммуно- и кардиопротекторов, а также в биологических исследованиях.

Известно, что актиномицет Streptomyces avermitilis при культивировании в присутствии источников углерода, азота и фосфора при постоянной аэрации продуцирует восемь близких по строению веществ, названных авермектинами (патент GB 1573955, 1980 г.). Все авермектины по химическому строению являются 16-членными макролидами и отличаются между собой заместителями у 5 и 26 атомов углеродного кольца. Индивидуальные авермектины получили обозначения A_1a, A_1b, A_2a, A_2b, B_1a, B_1b, B_2a и B_2b. Известно их антипаразитарное действие, что позволяет использовать авермектины в препаратах для защиты животных и растений (патенты US 4310519, 1982 г.; US 5376678, 1994 г.; RU 2048250, 1995 г.; RU 2054483, 1996 г. и другие).

Применение авермектинов по другому назначению до настоящего времени описано не было.

Предлагаемое изобретение основано на ранее неизвестных свойствах авермектинов, выявленных экспериментальным путем.

В частности, установлено, что авермектины вызывают гибель опухолевых клеток, подавляют их пролиферацию, защищают иммунные клетки от повреждения ионизирующим излучением и гормонами стресса, защищают сердечные клетки от Ca перегрузки в гиперкальциевых условиях, а также подавляют вход ионов кальция через потенциал-зависимые каналы.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Клетки лимфолейкоза P-388 лимфоидного происхождения привили мышам (около 10⁶ клеток на мышь) и выращивали в брюшной полости мышей. Через 7 дней после прививки клетки извлекли из брюшной полости, отмыли центрифугированием и инкубировали при 37^oC в среде RPMJ-1640 с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки, 10 мМ HEPES и 40 мкг/мл гентамицина при концентрации 10⁶ клеток/мл. Авермектины растворили в 96%-ном этаноле (1 мг/мл).

Действие авермектинов на выживаемость клеток лимфолейкоза оценивали по изменению количества живых клеток через 22 ч инкубации. Мертвые клетки определяли по окраске 0,04%-ным раствором трипанового синего. При концентрации авермектинов 0,2 мкг/мл выживаемость клеток P-388 снизилась по сравнению с контрольным опытом на 50%.

Однако в аналогичном опыте с клетками асцитной карциномы Эрлиха авермектины не оказали заметного влияния на выживаемость указанных клеток.

Пример 2. Клетки мышиной миеломы NS/0 вырастили in vitro в среде DMEM с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, 80 мкг/мл гентамицина. Авермектины растворили в 96%-ном этаноле (1 мг/мл). Действие авермектинов оценивали по влиянию на пролиферацию клеток в течение трех суток. При концентрации 0,01 мкг/мл рост клеток незначительно, но достоверно ускорялся за счет сокращения лаг-фазы: клетки после посева без задержки вступали в миотический цикл (в контроле задержка 4 ч). При больших концентрациях авермектины подавляли рост клеток. Эффект прогрессивно увеличивался с ростом концентрации. При концентрации 0,25 мкг/мл рост клеток подавлялся полностью: через трое суток инкубации количество клеток равнялось исходному. При дальнейшем повышении концентрации количество клеток уменьшалось по сравнению с исходным, что указывает на цитотоксическое действие авермектинов.

Пример 3. Клетки мышиной нейробластомы NB-103 вырастили in vitro в среде DMEM с добавлением 10%-ной телячьей сыворотки и антибиотиков (100 ед./мл). Авермектины растворили в 96%-ном этаноле (1 мг/мл). Действие авермектинов оценивали по влиянию на пролиферацию клеток в течение 3 суток.

Характерной особенностью опухолевых клеток линии NB-103 является зависимость скорости роста клеток от их концентрации в среде. При концентрации 100 тыс./мл и меньше клетки практически не размножаются и при культивировании в течение нескольких суток дифференцируются, выбрасывая отростки и образуя нейронную сеть. При 200 тыс./мл клетки интенсивно пролиферируют с периодом удвоения порядка 10 ч и к концу третьих суток образуют монослой.

При концентрации клеток 100 тыс. /мл авермектины в концентрации 0,25 мкг/мл достоверно не влияли на образование отростков и нейронной сети в культуре. При концентрации клеток 200 тыс./мл авермектины в той же концентрации 0,25 мкг/мл в первые 48 ч резко подавляли пролиферацию, а к концу третьих суток приводили к 100%-ной гибели всех клеток, в то время как в контроле наблюдалось образование монослоя.

Пример 4. Исследовали действие авермектинов в широком диапазоне концентраций на выживаемость и фрагментацию ДНК контрольных, обработанных дексаметазоном и облученных ионизирующим излучением тимоцитов крыс-самцов Вистар (160 г). После декапитации животных тимус протирали через капроновую ткань и центрифугированием отделяли тимоциты. Инкубацию тимоцитов при 37^oC проводили в среде RPMJ-1640 c добавлением 10%-ной бычей сыворотки, 10 мМ HEPES и 40 мкг/мл гентамицина в 96-луночных планшетах при концентрации 1,5•10⁷ клеток/мл. Авермектины растворили в 96%-ном этаноле (1 мг/мл).

Изучали действие авермектинов на апоптоз - программируемую гибель тимоцитов. Такая форма гибели характерна для лимфоидных клеток. Ее показателем является межнуклеосомная фрагментация ДНК, которую в данном примере определяли по доле низкомолекулярной ДНК в клетках. ДНК разделяли центрифугированием (13000g, 30 мин), окрашивали дифениламином и количественно определяли по поглощению при λ = 600 нм на спектрофотометре. Апоптоз инициировали с помощью ионизирующего излучения и аналога глюкокортикоидных гормонов - дексаметазона.

После облучения с дозой 4 Гр доля фрагментированной ДНК увеличилась за 6 ч инкубации до 50% (в контрольном опыте без облучения за тот же срок инкубации - 18%). Авермектины подавляли фрагментацию ДНК и гибель клеток, инициированную облучением. Эффективная доза, снижающая фрагментацию ДНК на 50% (ЭД₅₀) составила 0,14 мкг/мл.

Обработка тимоцитов дексаметазоном (2•10^-7 М) снижала выживаемость тимоцитов до 68±5% и увеличивала фрагментацию ДНК до 39±3%. Авермектины защищали клетки по обоим показателям повреждения. Доза авермектина, снижающая фрагментацию ДНК на 50% (ЭД₅₀), равна 0,1 мкг/мл.

Пример 5. Изолированные сердечные клетки крысы, полученные ферментативной обработкой целого сердца, сохраняли в среде с повышенной концентрацией ионов Ca²⁺ (5 мМ). Авермектины растворили в 96%-ном этаноле (1 мг/мл). Действие авермектинов оценивали по влиянию на гибель кардиоцитов в течение 10 ч методами световой микроскопии по ультраструктуре и окраске 0,04%-ным раствором трипанового синего. Авермектины в концентрации 0,25 мкг/мл более чем вдвое замедляли скорость гибели клеток. После трех часов инкубации в среде с авермектинами содержалось вдвое больше функционально активных, сохранивших нормальную морфологию клеток. После шести часов инкубации в контроле функционально активных клеток не наблюдалось, в то время как в среде с авермектинами их количество составляло 20-25% от исходного числа.

Пример 6. Методом фиксации потенциала на мембране регистрировали Ca²⁺ токи на изолированных сердечных клетках крысы в контроле и в присутствии авермектинов в различных концентрациях (от 0,08 до 8,0 мкг/мл). Авермектины в исследуемых концентрациях уменьшали Ca²⁺ токи. При концентрации 0,08 мкг/мл уменьшение пикового тока составило 10%, при концентрации 0,8 мкг/мл - 23%, при 8,0 мкг/мл - 30%.

Пример 7. Кусочки нормальной ткани толстого кишечника человека поместили в условия инкубирования органной культуры на среде следующего состава: среда Игла и среда RPMJ (1:1) - 80%, эмбриональная телячья сыворотка - 15%, сыворотка крови донора - 1,5%, глютамин - 0,5 мг/мл, дезоксиметазон - 10^-6 М, инсулин - 1 мг/мл, гентамицин - 120 ед/мл. Культивирование проводили в течение трех недель. Через две недели после начала культивирования в культуру добавили авермектин в концентрации 0,3 мг/мл. В процессе дальнейшего культивирования наблюдали состояние ядер клеток. На 21-й день культивирования эксплантант окрасили прижизненным красителем (этидиум бромид) и обследовали под люминесцентным микроскопом. В этом случае живые ядра окрашиваются в зеленый цвет, а мертвые - в красный. В данном примере красных ядер не было совсем, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния авермектинов на нормальные клетки.

Пример 8. Изучали влияние авермектинов на нормальные тимоциты крысы. Авермектины в концентрациях 0,03 - 3,0 мкг/мл добавляли в культуральную жидкость изолированных тимоцитов крысы породы Вистар и инкубировали клетки в течение суток при 37^oC. После этого определяли жизнеспособность клеток по их прокрашиванию раствором трипанового синего. Также определяли фрагментацию ДНК путем выделения ДНК из клеток с последующим разделением при центрифугировании интактной ДНК (осадок) и мелких фрагментов ДНК (супернатант), специфическим прокрашиванием полученных фракций дифениламином и спектрофотометрическим определением доли поврежденной ДНК.

Во всем диапазоне изученных концентраций жизнеспособность клеток, обработанных авермектинами, оставалась на уровне контрольных клеток (94-100%), а доля фрагментированной ДНК не превышала контрольных значений 14 ± 1,5%. То есть в условиях опытов авермектины не оказывали негативного влияния на нормальные тимоциты крысы.

Пример 9. Изолированные сердечные клетки крысы культивировали в нормальной среде (содержание Ca²⁺ составляло 1,8 мМ). Авермектины добавили в концентрации 0,25 мкг/мл. Действие авермектинов на кардиоциты оценивали методом световой микроскопии по ультраструктуре и окраске 0,04%-ным раствором трипанового синего. В присутствии авермектинов кардиоциты переживали в течение 18 ± 5 ч, тогда как при культивировании без авермектинов их переживание наблюдалось только в течение 10 ± 3 ч.

Полученные данные показывают возможность применения авермектинов в качестве вещества, обладающего избирательным противоопухолевым и иммунопротекторным действием, а также в качестве мягкого кальциевого антагониста в клинической медицине.

Изобретение относится к фармакологии и касается нового применения биологически активных веществ, получаемых путем микробиологического синтеза. Предложено новое средство для применения в медицине и ветеринарии при разработке лекарственных препаратов для лечения различных онкологических заболеваний при одновременной защите нормальных клеток. Сущность изобретения заключается в применении авермектинов (16-членных макролидов, продуцируемых актиномицетом Streptomycеs avermitilis) качестве средства, подавляющего пролиферацию, функциональную активность и вызывающего гибель опухолевых клеток при одновременной защите нормальных клеток. Изобретение расширяет арсенал средств указанного назначения.

Применение авермектинов в качестве средства, подавляющего пролиферацию и вызывающего гибель опухолевых клеток при одновременной защите нормальных клеток.