СИНЕРГЕТИЧЕСКОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ВИРУСНОЙ РЕПЛИКАЦИИ ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНЫМИ УГЛЕВОДОРОДАМИ И НУКЛЕОЗИДНЫМИ АНАЛОГАМИ Российский патент 2005 года по МПК A61K31/45 A61K31/522 A61K31/19 A61K9/00 A61P31/12 

Существующий уровень техники

Данное изобретение относится к лечению вирусных инфекций с помощью длинноцепочечных углеводородов в сочетании с нуклеозидными аналогами и, в частности, к местному применению терапевтических составов, содержащих n-докозанол в сочетании с нуклеозидным аналогом или фосфорно-муравьиной кислотой (ФМК).

Вирусные инфекции создают серьезную угрозу здоровью общества. Такие вирусы, как вирусы простого герпеса (ВПГ-1 и ВПГ-2), цитомегало-вирус (ЦМВ), вирус Эпстайна-Барра (ЭБВ), вирус ветряной оспы (ВВО), вирусы гриппа, лимфотрофные вирусы человека (например, вирус Т-клеточной лимфомы человека, ВТЛЧ-1) и вирусы иммунодефицита человека (например, ВИЧ-1), приводят к значительной заболеваемости и смертности. Вирусы ВПГ-1 и ВПГ-2 связаны с воспалением и поражениями кожи и слизистых оболочек, в том числе, с поражениями герпетической лихорадкой, поражениями простым герпесом губ и поражениями генитальным герпесом. ВВО вызывает опоясывающий лишай, а ЭБВ связан с мононуклеозом. Вирусы гриппа вызывают симптомы эпидемического гриппа и могут приводить к летальному исходу. Вирусы ВИЧ вызывают приобретенный иммунодефицит, который ослабляет и убивает зараженных людей. Хотя эти вирусы могут оставаться латентными в некоторых клетках в течение различных периодов времени, обычно вирусная репликация приводит к необратимым разрушениям инфицированной клетки, создавая в результате различные клинические проявления вызываемых этими вирусами заболеваний.

Большинство современных антивирусных терапий используют нуклеозидные аналоги, такие как пуриновый нуклеозидный аналог, ацикловир (АЦВ) и пиримидиновый нуклеозидный аналог, азидотимидин (АЗТ), которые вмешиваются в вирусную репликацию в инфицированных клетках хозяина. Эти нуклеозидные аналоги преобразуются в свои трифосфорилированные (нуклеотидные) производные посредством вирусных и/или клеточных киназ, при этом они блокируют удлинение вирусной ДНК. Гуанниновый аналог, 9-(2-гидрокси)-этоксиметилгуанин, называемый АЦВ, обладает мощной антивирусной активностью. Примеры терапевтических нуклеозидных аналогов, связанных с АЦВ, и способы их получения раскрыты в патентах США №№4199574, 4294831 и 4360522, выданных Schaeffer, в патенте США №5580571, выданном Hostetler, в патенте США №5756737, выданном Turchetta et al., и в патенте США №5567816, выданном Schloemer et al.; описания этих изобретений включены сюда посредством ссылки. Главными проблемами, связанными с использованием этих нуклеозидных аналогов, являются их ограниченное фосфорилирование в некоторых клетках и цитотоксические побочные эффекты трифосфатов нуклеозидных аналогов. Кроме того, данные антивирусные медикаменты потенциально могут действовать в качестве мутагенов и/или тератогенов в клетках хозяина. Таким образом, несмотря на сильное антивирусное воздействие нуклеозидных аналогов, ведется поиск менее токсичных эффективных терапевтических средств.

Среди альтернатив нуклеозидным аналогам для лечения вирусных инфекций фигурируют разнообразные длинноцепочечные спирты, жирные кислоты, алканы и подобные соединения. Сначала работа с такими соединениями была сфокусирована на их непосредственном антивирусном действии. Например, сообщалось, что ненасыщенные спирты, имеющие от 14 до 20 атомов углерода и от одной до четырех двойных связей, обладают антивирусной активностью. Наиболее эффективным из этих ненасыщенных спиртов был γ-линолениловый спирт, С 18-спирт с двойными связями в позициях б, 9 и 12 (Sands et'al., Antimicrob. Agents & Chemother. 15:67-73, 1979). Также было показано, что составы, содержащие олеиновую кислоту (С 18, одна двойная связь), проявляют антивирусную активность в отношении вируса герпеса (патентная заявка РСТ WO 9602244A1).

Было показано, что алифатические спирты, имеющие от 20 до 32 атомов углерода, обладают антивирусной и антивоспалительной активностью. Терапевтические составы, содержащие такие длинноцепочечные алифатические спирты и подобные соединения, описаны в патенте США №4874794, патенте США №5071879, патенте США №5166219, патенте США №5194451 и патенте США №5534554, описания которых включены сюда посредством ссылки.

Сообщалось, что некоторые соединения, структурно относящиеся к длинноцепочечным алифатическим спиртам, обладают антивирусной активностью. К примеру, патент США №4513008 раскрывает антивирусную активность линейных полиненасыщенных кислот, альдегидов или спиртов, содержащих от 20 до 24 атомов углерода, имеющих от пяти до семи двойных связей. Соединения, имеющие длинноцепочечную жирную ациловую группу, содержащую по меньшей мере три ненасыщенные связи, прикрепленную к нуклеозиду или нуклеозидному аналогу, также раскрываются в качестве антивирусных медикаментов в патенте США №5216142. Связанный с ним патент США №5276020 раскрывает антивирусные соединения, имеющие длинноцепочечную жирную ациловую группу с 16, 18 или 20 атомами углерода, прикрепленную к нуклеозидному аналогу, и способ лечения вирусной инфекции с помощью этих соединений. Действительно, Hostetler et al. недавно сообщили об улучшенной пероральной абсорбции и антивирусной активности 18-углеродного производного АЦВ, 1-D-октадецил-sn-глицеро-3-фосфо-АЦВ (Hostetler et al., Biochem. Pharmacol. 53:1815-1822, 1997).

Также сообщалось о местных терапевтических составах, содержащих различные спирты, жирные кислоты и амины. Например, было сообщено об антивирусной активности липосомного AL721, смеси нейтральных глицеридов, фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина (Antonian et al., Neurosci. Biobehav. Rev, 11:399-413, 1987). Антимикробные соединения для местного лечения, содержащие сложный глицероловый моноэфир лауриновой кислоты с 15 атомами углерода или сложный эфир многоатомного спирта лауриновой кислоты со смесью жирных кислот (каприновой кислоты с 10 атомами углерода и каприловой кислоты с 8 атомами углерода), были раскрыты в патенте США №5208257. Лечение герпетических поражений с помощью наносимых местно составов, содержащих анестетик, поверхностно-активное вещество и местный носитель, было раскрыто в патенте США №5380754. Способ лечения воспаления путем местного нанесения этил-цис,цис(9,12)октадекадиеноата (этил линолеата) был раскрыт в патенте США №4025645 в качестве лечения герпетической лихорадки.

Katz et al. {Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10825-10829, 1991; патент США №5534554) показали, что один из длинноцепочечных алифатических спиртов, n-докозанол (22 атома углерода), обладает сильной системной и местной антивирусной активностью в отношении ряда вирусов, в том числе вируса простого герпеса (in vitro и in vivo), ВИЧ-1 (in vitro), респираторно-синцитиального вируса (in vitro) и вируса Френда (in vitro и in vivo). В отличие от ненасыщенных спиртов, имеющих от 10 до 18 атомов углерода, которые проявляют детергентно-подобную антивирусную активность, n-докозанол не дезактивирует вирусы непосредственно (Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10825-10829, 1991; Snipes et al., Antimicrob. Agents Chemother, 11:98-104, 1977). Прогрессивное связывание и восприятие n-докозанола клетками можно отнести на счет его антивирусной активности, поскольку предварительное инкубирование клеток спиртом дает оптимальную антивирусную активность. Более того, 70% связанного с клетками n-докозанола обнаруживается в компонентах клеточной мембраны, а остальное связано с растворимыми частями клеток (Pope et aL, J. Lipid. Res. 37:2167-2178, 1996). Внедрение n-докозанола в плазматическую мембрану не ингибирует связывание вируса с поверхностью клетки. Ранний синтез вирусного белка ингибировался более чем на 80% и вирусы не локализовывались в ядрах (Katz et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10825-10829, 1991). Слияние вируса с плазматической мембраной клетки ингибируется (Pope et al., Antiviral. Res. 40:85-94, 1998).

Представляется, что для ингибирования синтеза вирусного белка и антивирусной активности n-докозанола требуется клеточный метаболизм спирта (Pope et al., J. Lipid Res. 37:2167-2178, 1996; Katz et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 724:470488, 1994). Кроме того, хотя внутриклеточные метаболические преобразования n-докозанола можно отнести на счет его антивирусной активности (Katz et al., Annals. N.Y. Acad. Sci. 724:470488, 1994), n-докозанол не является цитотоксичным при концентрациях вплоть до 300 мМоль.

Такие соединения, как n-докозанол, фармакологические действия которых опосредуются клеточным метаболизмом, могут изменять способ метаболизации и экспрессии второго лекарства. В дополнение к этому, известно, что вирусы сильно изменяют метаболизм клетки-хозяина. Такие взаимодействия медикаментов могут давать нежелательные воздействия на пациентов, проходящих лечение с помощью нескольких медикаментов. Однако могут проявляться также и полезные медикаментозные взаимодействия. Разумеется, существует множество отчетов о взаимодействиях между нуклеозидными аналогами, такими как АЦВ, и соединениями, модулирующими клеточный метаболизм (Spector et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1051-1055, 1989; O'Brien et al., Antimicrob. Agents Chemother. 34:1178-1182, 1990; Hirsch et al., 1996 Antiviral Agents. В Fields Virology Third Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, eds. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, pp. 431-466). Обычно этот механизм содержит один или несколько шагов при поглощении или метаболизме нуклеозида, приводящих к более эффективному выражению антивирусной активности.

Поскольку пациенты с рецидивирующим герпесно-вирусным заболеванием могут конкурентно лечиться с помощью 10% крема n-докозанола и ацикловира (ZOVIRAX™), исследовалась возможность как вредных, так и полезных медикаментозных взаимодействий. Настоящее изобретение основано на том открытии, что n-докозанол синергически интенсифицирует антивирусную активность нуклеозидных аналогов, направленную против репликации нескольких герпесных вирусов и вируса коровьей оспы.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к антивирусному составу, содержащему длинноцепочечное алифатическое соединение и нуклеозидный или нуклеотидный аналог или фосфорно-муравьиную кислоту (ФМК) в фармацевтически приемлемом носителе. В частности, длинноцепочечное алифатическое соединение выбирается из группы, состоящей из первичных спиртов, содержащих 18-28 атомов углерода, эруцилового спирта, брассидилового спирта, n-докозана, n-докозановой кислоты, эрукамида и стеариновой кислоты, или их смесей.

Алифатическое соединение представлено в концентрации в диапазоне от приблизительно 0,05% до приблизительно 40%. Нуклеозидный или нуклеотидный аналог в антивирусном составе выбирается из группы, состоящей из АЦВ, адефовира, азидотимидина, бривудина, цидофовира, ddC, ddI, фамцикловира, ганцикловира, идоксуридина, ламивудина, лобукавира, пенцикловира, рибавирина, соривудина, трифлуридина, триметоприма, валацикловира и Аrа А. Нуклеозидный или нуклеотидный аналог ФМК представлен в концентрациях в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%.

В предпочтительном выполнении этот антивирусный состав также содержит неионное поверхностно-активное вещество. Это поверхностно-активное вещество может содержать двухфункциональный блок-полимер, который является полиоксиалкиленовым производным пропиленгликоля с молекулярным весом от приблизительно 1000 до приблизительно 25000, блок-сополимер этиленоксида и пропиленоксида с молекулярным весом от приблизительно 6000 до приблизительно 12000, или же неионным поверхностно-активным веществом является октоксинол-9 или октоксинол-10.

Предпочтительно антивирусный состав по настоящему изобретению содержит n-докозанол и нуклеозидный аналог из группы, состоящей из АЦВ, или пирофосфатного аналога ФМК, рибавирина, трифлуридина и Аrа-А, в фармацевтически приемлемом носителе, причем n-докозанол представлен в концентрации в диапазоне от приблизительно 0,05% до приблизительно 40%, а нуклеозидный аналог представлен в концентрации в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%.

Фармацевтически приемлемый носитель в соответствии с настоящим изобретением содержит стеарат сахарозы в концентрации от приблизительно 1% до приблизительно 25%, минеральное масло в концентрации от приблизительно 1% до приблизительно 25%, пропилен гликоль USP в концентрации от приблизительно 1% до приблизительно 25%, бензиловый спирт в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% и воду.

Раскрытые антивирусные составы могут использоваться при лечении вирусной инфекции, причем длинноцепочечное алифатическое соединение вводится в сочетании с нуклеозидным или нуклеотидным аналогом. Длинноцепочечное алифатическое соединение и нуклеозидный или нуклеотидный аналог могут быть независимо адаптированы для введения от одного до пяти раз в день любым путем из группы, состоящей из местного, перорального, пермукозального, чрезмембранного проникновения и внутривенного.

На использование длинноцепочечного алифатического соединения и нуклеозидного или нуклеотидного аналога по настоящему изобретению также делается ссылка при приготовлении лекарства для лечения вирусной инфекции. Это лекарство может вводиться с дозировкой от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 г с частотой приблизительно от одного до пяти раз в день в течение приблизительно от одного до четырнадцати дней. Лекарство может вводиться любым путем из группы, состоящей из местного, перорального, пермукозального, чрезмембранного проникновения и внутривенного.

Раскрывается также способ лечения вирусной инфекции. Этот способ содержит введение состава, содержащего алифатическое соединение и нуклеозидный аналог или ФМК в фармацевтически приемлемом носителе, причем этот состав может вводиться местным образом от трех до пяти раз в день, либо парентерально, либо посредством чрезмембранного проникновения, через желудочно-кишечный тракт, через дыхательную систему или через мочеполовую систему.

В предпочтительном выполнении способ для лечения вирусной инфекции содержит введение состава, содержащего n-докозанол и либо АЦВ, ФМК, рибавирин, трифлуридин, либо Аrа-А в фармацевтически приемлемом носителе.

Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и последующее подробное описание приводятся только для примера и объяснения и не ограничивают изобретение, описанное в формуле изобретения. Сопроводительные чертежи иллюстрируют различные выполнения изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 является диаграммой, показывающей ингибирование образования бляшки ВПГ-2 в клетках Веро in vitro суспензиями n-докозанола (22 атома углерода, ), n-тетракозанолового (лигноцерилового) спирта (24 атома углерода, ⋄), n-гексакозанола (26 атомов углерода, ) и n-октакозанола (28 атомов углерода Δ), при концентрациях, показанных на оси Х (данные представляют процент наблюдаемых бляшек по сравнению с контрольными культурами, на которые воздействовали суспензии поверхностно-активных веществ без длинноцепочечного спирта).

Фиг.2А является диаграммой, показывающей, что увеличение отношения поверхностно-активного вещества к n-докозанолу уменьшает образование вирусной бляшки при инкубировании клеток Веро с суспензией в течение 12 часов перед добавлением вируса ВПГ-2; соотношения поверхностно-активное вещество: n-докозанол были следующими: 1:1 (), 3:1 (Δ), 5:1 () и 10:1 (О).

Фиг.2Б показывает контрольные образцы, соответствующие образцам по фиг.2А, использующие те же самые концентрации поверхностно-активного вещества в суспензии, как для каждого соотношения поверхностно-активное вещество: спирт, показанного на фиг.2А, но без n-докозанола (используются те же самые символы, что и на фиг.2А).

Фиг.3 является диаграммой, показывающей, что суспензии n-докозанола с поверхностно-активным октоксинолом () ингибируют образование бляшки ВПГ-2 в клетках Веро, инкубированных с суспензией и ВПГ-2 в течение 48 часов, при усилении ингибирования, коррелирующем с увеличением концентрации n-докозанола, в то время, как контрольные культуры, инкубированные с ВПГ-2 и поверхностно-активным октоксинолом (О), не проявляли ингибирования (то есть были эквивалентны необработанным контрольным культурам, имеющим приблизительно 50 бляшек на углубление); прямоугольники сверху и снизу точек данных показывают стандартное отклонение для дублирующихся образцов.

Фиг.4 является диаграммой, показывающей, что суспензии поверхностно-активного вещества/n-докозанола () и поверхностно-активного вещества/n-докозана () ингибируют образование вирусной бляшки ВПГ-2 в культурных клетках Веро, инкубированных с этими веществами в течение 12 часов перед добавлением ВПГ-2.

Фиг.5 является диаграммой, показывающей, что суспензии стеарилового спирта (18 атомов углерода, ) и арахидилового спирта (20 атомов углерода, Δ) токсичны для культурных опухолевых В-клеток, инкубированных в течение 48 часов с суспензиями при концентрациях, показанных на осях X, по сравнению с контрольными культурами, инкубированными с суспензиями поверхностно-активного вещества без спирта (О), как определялось по внедрению 3Н-тимидина в ДНК (данные являются процентом контрольных культур, инкубированных только со средой).

Фиг.6А и 6Б схематически показывают противопролиферативное клеточное действие суспензий поверхностно-активное вещество/n-докозанол () на фибробластах крайней плоти по сравнению с клетками, инкубированными с суспензиями поверхностно-активное вещество/n-докозан (Δ) или с контрольными культурами, инкубированными с суспензией поверхностно-активного вещества без активного ингредиента (О), при концентрациях, показанных на осях Х (средние значения дублирующихся испытаний, рассчитанные после 96 часов инкубирования клеток, зараженных при 1000 клеток/углубление (фиг.6А) или 30000 клеток/углубление (фиг.6Б) в пластинах с 96 углублениями).

Фиг.7 является диаграммой, показывающей временную зависимость противопролиферативного клеточного воздействия суспензии поверхностно-активное вещество/n-докозанол после 72 часов () и 96 часов (О) инкубирования посредством способов, описанных для фиг.6А.

Фиг.8 показывает ингибирование кожного заболевания ВПГ-2 у безволосых морских свинок с помощью комбинированной формулы крема, состоящего из n-докозанола и АЦВ. Данные являются средними результатами двух независимо проведенных экспериментов и были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента с двумя "хвостами".

Фиг.9 показывает синергическую направленную против ВПГ активность n-докозанола и АЦВ в культурах клеток Веро. Данные выражены в виде средних и среднеквадратичных ошибок для бляшек, наблюдавшихся в трипликационных углублениях/анализ.

Фиг.10 показывает синергическое ингибирование n-докозанолом и АЦВ воспроизведения ВПГ-1 в культурах клеток Веро. Данные выражают среднее значение ЕОБ, наблюдавшееся при трипликации изначальных клеточных культур; среднеквадратичные ошибки не превышали 15% соответствующего среднего значения (не показаны).

Фиг.11 показывает синергическое ингибирование репликации ВПГ-1 in vitro n-докозанолом и отличными от АЦВ нуклеозидными аналогами. Данные выражены в виде ЕС₉₀ для ингибирования воспроизведения ВПГ-1, выведенные из среднего значения ЕОБ, наблюдавшегося при трипликации изначальных клеточных культур/анализ.

Фиг.12 показывает дополнительную антивирусную активность n-докозанола и ФМК в отношении репликации ВПГ-1 и отсутствие взаимодействия с вирусом коровьей оспы. Данные выражены в виде средних значений ЕОБ при квадруплицировании культур.

Фиг.13 показывает улучшение с помощью n-докозанола антивирусной активности нуклеозидных аналогов по отношению к репликации вируса коровьей оспы. Данные выражены в виде ЕС₅₀ (панель А) и ЕС₉₀ (панель Б) для ингибирования воспроизведения ВПГ-1, производные от средних значений ЕОБ, наблюдавшихся при трипликации изначальных клеточных культур.

Подробное описание предпочтительного выполнения

В своем наиболее широком выполнении настоящее изобретение представляет собой состав, полезный в качестве лечения для вирусных инфекций. Этот состав содержит длинноцепочечное алифатическое соединение в сочетании с нуклеозидным или нуклеотидным аналогом или ФМК в фармацевтически приемлемом носителе. Также раскрывается способ лечения вирусных инфекций, содержащий введение длинноцепочечного алифатического соединения в сочетании с нуклеозидным или нуклеотидным аналогом или ФМК.

Алифатические соединения, пригодные для использования в настоящем изобретении, выбираются из группы, состоящей из насыщенных алифатических спиртов, моно-ненасыщенных алифатических спиртов, алифатических алканов, моно-ненасыщенных алифатических амидов и алифатических кислот, имеющих длину углеродной цепочки от 18 до 28 атомов углерода (С18-С28). Предпочтительный состав содержит стеариловый спирт, эруциловый спирт, брассидиловый спирт, арахидиловый спирт, n-докозанол, n-докозан, n-докозановую кислоту, эрукамид и стеариновую кислоту, либо их смеси. Наиболее предпочтительно алифатическим соединением является n-докозанол. Алифатическое соединение может использоваться в соответствии с предпочтительным вариантом настоящего изобретения в концентрациях в диапазоне от приблизительно 0,05% до приблизительно 40%. Наиболее предпочтительно n-докозанол используется при концентрации в диапазоне от приблизительно 1% до приблизительно 20%.

Способы синтеза n-докозанола и эруцилового спирта (цис-13-докозен-1-ол) известны специалистам (например, см. патент США №4186211). Стеариловый спирт может синтезироваться в соответствии со способом, описанным Brown et al. (J. Am. Chem. Soc. 78:2582, 1956). Способы синтеза алканов, алифатических спиртов, амидов и алифатических кислот хорошо известны из существующего уровня техники (например, см. A. Streitwieser, Jr. & С. Н. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2nd ed., Macmillan Publishing Co., New York, NY, 1981, на страницах 160, 243-247, 303-307, 311-312, 315-317, 401-406, 447-453, 515-516, 544, 548-555, 604-605, 670, 753-754 и 950).

Нуклеозидный или нуклеотидный аналог в антивирусном составе по настоящему изобретению может выбираться из группы, состоящей из АЦВ, адефовира, азидотимидина, бривудина, цидофовира, ddC, ddI, фамцикловира, ганцикловира, идоксуридина, ламивудина, лобукавира, пенцикловира, рибавирина, рифампина, соривудина, трифлуридина, валацикловира и Аrа А. Нуклеозидный аналог или ФМК присутствует в концентрациях в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%. Наиболее предпочтительно используются АЦВ, ФМК, рибавирин, трифлуридин или Аrа-А в концентрациях в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%.

Способы синтеза нуклеозидных или нуклеотидных аналогов в соответствии с настоящим изобретением хорошо известны из существующего уровня техники. Синтез ацикловира раскрыт в патенте США №4199574, выданном Schaeffer, патенте США №5567816, выданном Schloemer, и в патенте США №5756737, выданном Turchetta, и хорошо известны специалистам.

Фосфорно-муравьиная кислота может синтезироваться посредством алкалинового гидролиза триэтилфосфоноформата, как описано у Nylen, P. (Chemische Berichte 57:1023-1038, 1924).

Антивирусный состав в соответствии с одним из выполнений может содержать поверхностно-активное вещество, которое является таким неионным детергентом, как двухфункциональный блок-полимер, являющийся полиоксиалкиленовым производным пропиленгликоля, имеющим молекулярный вес от приблизительно 1000 до приблизительно 25000 или выше. Предпочтительно поверхностно-активным веществом является блок-сополимер пропиленоксида и этиленоксида (полоксамер 188), имеющий молекулярный вес между 6000 и 12000, более предпочтительно приблизительно 8400 (например, PLURONIC F-68®). Прочими предпочтительными поверхностно-активными веществами являются октоксинол-9 и/или октоксинол-10 (например, TRITON Х-100®), деоксихолат или смеси неионных детергентов. Активные ингредиенты (длинноцепочечное алифатическое соединение и нуклеозидный аналог либо ФМК) составляют от приблизительно 0,1% до приблизительно 50% веса конечного состава, предпочтительно от 1% до 10% по весу. Оптимальная антивирусная активность активных ингредиентов зависит от соотношения поверхностно-активного вещества и активных ингредиентов, которое может варьироваться от 1:1 (по весу) до 10:1 (по весу), а предпочтительно составляет 5:1 (по весу).

Активные агенты и опциональные поверхностно-активные вещества комбинируются с носителем, который физиологически совместим с кожной и мембранной тканью человека или животного, которому он вводится. То есть носитель является практически неактивным, за исключением поверхностно-активных свойств, используемых при приготовлении суспензии активных ингредиентов. Составы могут содержать прочие физиологически активные составляющие, которые не вмешиваются в эффективность насыщенных алифатических спиртов, моно-ненасыщенных алифатических спиртов, алифатических алканов и алифатических кислот или нуклеозидных аналогов. Пример состава раскрывается в патенте США №3592930.

Подходящие носители включают в себя водные и масляные носители, такие как, к примеру, белый вазелин, изопропиловый миристат, ланолин или ланолиновые спирты, минеральное масло, моноолеат сорбитана, пропиленгликоль, цетилстеариловый спирт (совместно или в различных комбинациях), с детергентом (например, полиоксил стеаратом или сульфатом натрий-лаурила), смешанные с водой для получения лосьона, геля, крема, или полутвердого состава. Прочие подходящие носители включают в себя смеси эмульгаторов и смягчающих веществ с такими растворителями, как стеарат сахарозы, кокоат сахарозы, дистеарат сахарозы, минеральное масло, пропиленгликоль, 2-этил-1,3-гександиол, полиоксипропилен-15-стеариловый эфир и вода. В носитель могут также добавляться такие консерванты, как метилпарабен, пропилпарабен, бензиловый спирт и тетраацетатные соли этилендиамина. Растворимые суспензии без загустителей являются наиболее пригодными для нанесения на поверхность кожи в виде аэрозольных спреев с помощью хорошо известных способов нанесения. Состав может также содержать пластификатор, такой как глицерол или полиэтиленгликоль (молекулярный вес от 800 до 20000), и такие улучшающие проникновение вещества, как азон. Состав носителя может варьироваться в таких пределах, пока он не вмешивается в фармакологическую активность активных ингредиентов.

Составы могут также содержать антимикробные агенты, прочие антивирусные агенты, антигрибковые агенты, антиоксиданты, буферные агенты, солнцезащитные и косметические агенты, такие как окрашивающие агенты, ароматические вещества, смазывающие вещества и смачивающие или сушащие агенты. Антимикробными агентами, которые полезно вводить в состав, являются полимиксин В и тетрациклин. Прочими антивирусными агентами, входящими в формулы, могут быть цитокины. Антигрибковыми агентами, которые могут вводиться в состав, являются микатин или толнафтат. Могут вводиться такие антиоксиданты, как витамин Е. Могут вводиться такие солнцезащитные вещества, как парааминобензойная кислота. Сушащие агенты, которые могут вводиться в состав, хорошо известны, таковы, к примеру, фенол и бензиловый спирт. Могут также вводиться такие смазывающие вещества, как синтетический или натуральный пчелиный воск. Загустители, добавляемые в составы, могут включать в себя пуллулин, ксантан, поливинил пирролидон или карбоксиметилцеллюлозу.

Оптимально эти составы эффективно уменьшают вирусный титр у всего излечиваемого индивида, в частности, для системного лечения, и в местах поражения, в частности, для местного лечения пораженных участков кожи или слизистой оболочки. Раскрываемые способы лечения уменьшают также симптомы вирусной инфекции (например, боль, связанную с вызванными вирусом поражениями) и помогают более быстрому выздоровлению, чем без лечения.

Способ по настоящему изобретению содержит введение состава, содержащего активные ингредиенты и, опционально, поверхностно-активное вещество, человеку или животному для лечения или предотвращения вирусной инфекции. Введение предпочтительно осуществляется на кожу или слизистую оболочку с помощью крема, лосьона, геля, мази, суспензии, аэрозольного спрея или полутвердой формулы (например, свечи), которые все сформулированы с помощью хорошо известных из существующего уровня техники способов. Тем не менее, парентеральное и чрезмембранное проникновения также подразумеваются в соответствии с некоторыми выполнениями настоящего изобретения. Если в качестве маршрута введения используется местный маршрут или чрезмембранное проникновение, состав может опционально содержать улучшающее проникновение вещество, хорошо известное из существующего уровня техники, такое как азон и диметилсульфоксид. Нанесения состоят из от одного до десяти нанесений состава в количестве от 10 мг до 10 г за одно нанесение в течение от одного до четырнадцати дней. Обычно нанесения происходят раз в двенадцать часов и чаще, вплоть до раза в четыре часа. Наиболее предпочтительно производить от двух до пяти нанесений состава в день, от 0,1 до 5 г за нанесение, в течение от одного до семи дней, и этого достаточно для предотвращения или лечения вирусной инфекции. При местных нанесениях составы предпочтительно наносятся ежедневно на места поражений, как только появляются симптомы (например, боль, сведение или воспаление).

Эти составы и способы полезны для предотвращения или лечения разнообразных вирусных инфекций, таких как вызываемые вирусами герпеса, в том числе, ВПГ-1, ВПГ-2 и ВПГ-6, ЦМВ, ЭБВ или ВВО, вирусами гриппа, лимфотрофными вирусами человека (например, ВТЛЧ-1), вирусами иммунодефицита человека (например, ВИЧ-1), вирусом папилломы и респираторно-синцитиальным вирусом. Из-за цитостатической активности некоторых составов и потенциальных взаимодействий с антираковыми медикаментами с нуклеозидными аналогами, составы и способы могут также быть полезны для ингибирования злокачественного роста клеток и/или метастаза. Данное клеточное ингибирование и комбинированная хемиотерапия могут комбинироваться с хорошо известными способами лечения рака (например, облучением и/или хирургическими вмешательствами), приводя к полной или частичной ремиссии опухоли или другого ракового роста клеток.

Если не оговорено обратное, все научные и технические термины, используемые здесь, имеют значение, общепринятое для специалистов в соответствующей области. Если не оговорено обратное, методы, используемые и подразумеваемые здесь, являются стандартными методологиями, хорошо известными специалисту. Примеры выполнений приводятся исключительно в иллюстративных целях.

Рабочие примеры

Источник химикатов и реагентов - n-докозанол (>98% чистоты, молекулярный вес 326) был куплен у компании М. Michel and Company, Inc., New York, NY. Бензиловый спирт, минеральное масло, полипропиленгликоль, стеариновая кислота и стеарат сахарозы были получены от компании Croda Inc., New York, NY. Порошок ацикловира был получен у компании Burroughs Wellcome Co., Research Triangle Park, NC. Аденин 9-b-D-арабинофуранозид, фосфорно-муравьиная кислота, рибавирин, рифампицин и трифлуридин деоксирибозид были куплены у компании Sigma Chemical Co., St. Louis, МО. PLURONIC F-68® (полоксамер 188) был куплен у компании BASF, Parisappany, NY.

Источник животных, вирусов, клеточных линий - штамм МакИн-тайра вируса ВПГ-1 (#VR-539), штамм MS вируса ВПГ-2 (#VR-540), штамм Эллен вируса ветряной оспы (ВВО, #VR-1367), штамм Тауна цито-мегаловируса (ЦМВ, #VR-977) и штамм WR вируса коровьей оспы (#VR-119) были получены из American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Вирусный материал ВПГ и вируса коровьей оспы были приготовлены в культурах клеток Веро (почка африканской зеленой обезьяны, ATCC #CCL-81), в то время, как материалы ВВО и ЦМВ были выработаны в клеточной линии MRC-5 легкого эмбриона человека (ATCC #CCL-171). Уровни единиц образования бляшки (ЕОБ) для этих вирусов определялись в изначальной клеточной линии, и материалы хранились при -85°С.

Способы приготовления антивирусного состава - Если не отмечено иначе, местная кремовая эмульсия n-докозанола, используемая в рабочих примерах, была приготовлена с помощью (в весовых %) 10% n-докозанола, 5% стеарата сахарозы, 8% минерального масла, 5% пропиленгликоля USP, 2,7% бензилового спирта, остальное - вода (Katz et al., в Slow Infections of the Central Nervous System. Ann. N.Y. Acad. Sci. 724:472-488, 1994). Контрольный наполнитель для крема содержал 10% стеариновой кислоты, так что присутствовали суммарные 10% алифатического углеводорода. Составляющие нагревались до 80°С и смешивались при остывании до комнатной температуры. Обычно смесь застывает, когда температура падает до 30°С. Каждый день во время лечения 0,3 мл свежевосстановленного (водой) АЦВ смешивались с 2,7 мл содержащего n-докозанол крема, давая препарат с 5% АЦВ и 9% n-докозанола; соответствующие контрольные кремы смешивались с 0,3 мл воды. Смеси смешивались в течение 5 минут в сосуде SPEX (SPEX Industries, Inc., Metuchen, NJ) с помощью SPEC Mixer.

n-Докозанол суспендировался также в PLURONIC F-68® (полоксамер 188; молекулярный вес 8400), как описано (Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10825-10829, 1991; Pope et аl., J. Lipid Res. 37:2167-2178, 1996). PLURONIC F-68® разбавлялся до 12 мМоль в стерильном солевом растворе при 37°С, а затем нагревался до 50°С. n-Докозанол добавлялся в раствор PLURONIC F-68® до 90 мМоль, и смесь подвергалась обработке ультразвуком с помощью ультразвукового устройства Branson 450 (Branson Ultrasonics, Danbury, CT) в течение 21 минуты при выходной мощности 65 Вт; таким образом смесь нагревалась до 86°С. Полученная суспензия состоит из очень мелких круглых частиц средним размером 0,1-0,5 микрон, что было измерено посредством трансмиссионной электронной микроскопии (Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10825-10829, 1991). Контрольный наполнитель для этой суспензии содержал только PLURONIC F-б8® в солевом растворе.

Способы оптимизации антивирусной активности - Антивирусная активность фармацевтических составов, содержащих длинноцепочечное алифатическое соединение и нуклеозидный аналог, оптимизировалась с помощью четырех различных тестов, в том числе (1) инфицирования кожи морской свинки вирусом ВПГ, (2) формирования вирусной бляшки ВПГ, (3) множества инфицированных вирусом герпеса клеток и (4) ингибирования воспроизводства потомства вируса.

Система исследований in vivo использовала безволосых морских свинок (250-400 г), которые были получены в Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Их спинки очищались этанолом и стерильным солевым раствором и инокулировались вирусом ВПГ-2 под общей анестезией с помощью Кетамина (компания Parke-Davis, Morris Plains, NJ) и Нембутала (компания Abbott Laboratories, North Chicago, IL). Солевой раствор (75 мкл), содержащий 5×10⁵ ЕОБ ВПГ-2, наносился на участки размером 4×4 см на спинках морских свинок с последующей инокуляцией с помощью татуировочного инструмента. Это является общепринятым экспериментальным способом для оценивания местной терапии при лечении опосредованного ВПГ кожного заболевания (Spruance et al., Antiviral Res. 9:295-313, 1988). Каждое животное имело 6 участков инокуляции. Лечение с помощью 200 мкл крема производилось стеклянной палочкой посредством легкого кругового потирания 2 раза в день. Участки оценивались с точки зрения количества везикулярных поражений в отмеченные моменты времени.

Исследование образования бляшки in vitro для ВПГ проводилось с помощью клеток Веро, нанесенных по 1,5×10⁵/мл в 16-миллиметровые углубления (1 мл) или в 35-миллиметровые углубления (2 мл) в DMEM с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки, 1 мМоль пиравата натрия, 4 мМоль L-глутамина, 50 ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина и 10 мМоль буфера HEPES. Варьирующиеся концентрации суспензии n-докозанола или соответствующий контрольный наполнитель (без n-докозанола) добавлялись на начальном этапе развития культуры. После 24-часового инкубирования добавлялся тестовый антивирусный медикамент (например, АЦВ), а затем все культуры инокулировались с требуемым значением ЕОБ ВПГ. Культуры инкубировались (10% СO₂ в воздухе; повышенная влажность) в течение дополнительных 44 часов, окрашивались (окрашиватель/связыватель состоит из 1,25 мг/мл карбол-фуксина плюс 2,5 мг/мл метиленового синего в метаноле), и подсчитывалось количество вызванных ВПГ бляшек с помощью препарационного микроскопа (увеличение 10 крат).

Исследования воспроизведения вирусов in vitro для ВПГ и вируса коровьей оспы были инициированы и описаны для образования бляшки ВПГ в клетках Веро в 16-миллиметровых углублениях, но пластины инкубировались в сумме 3 дня после инокуляции с помощью 500 ЕОБ/углубление, как показано. В этот момент культурные поверхностно-активные жидкости собирались и растворялись в свежие культуры клеток Веро (1×10⁵/мл, 0,1 мл/углубление в пластине с 96 углублениями) для исследования содержания ЕОБ. Эти вторичные пластины инкубировались в течение 72 часов перед фиксацией, окрашиванием и подсчетом цитопатологии для ВПГ.

Исследования инфекции ЦМВ и ВВО инициировались с помощью клеток MRC-5, как описывалось выше для получения ЕОБ ВПГ в 16-миллиметровых углублениях. Через два дня после инфицирования культурная среда была заменена свежей средой без ингибитора. После дополнительных 2 дней инкубирования клетки собирались посредством трипсинизирования и исследовались на предмет инфицированных клеток в тесте инфекционного центра с помощью клеток MRC-5. Коротко говоря, трипсинизированные клетки разбавлялись в клеточных культурах MRC-5 в пластинах с 24 углублениями. После 6 дней инкубирования вторичные культуры окрашивались, и подсчитывалась цитопатология для ВВО и ЦМВ.

ПРИМЕР 1

Антивирусная активность алифатических спиртов С21-С28

Алифатические спирты суспендировались в поверхностно-активном веществе PLURONIC F-68® с помощью следующей процедуры, описанной для спирта n-докозанол. Поверхностно-активное вещество разбавлялось до 10 мг/мл в среде Игла, модифицированной высшей глюкозой Дульбекко при 37°С (DMEM; Whittaker Bioroducts, Walkersville, MD); и раствор нагревался до 50°С. n-Докозанол добавлялся до окончательной концентрации 30 мМоль к раствору поверхностно-активного вещества, и смесь обрабатывалась ультразвуком в течение 21 минуты при начальной мощности 65 Вт с помощью ультразвукового устройства (Branson 450), что вызывало нагрев суспензии до 88°С. Получившаяся суспензия содержала круглые частицы средним размером приблизительно 0,3 мкм, что было определено с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Контрольные растворы, содержащие PLURONIC F-68® без добавленного алифатического спирта и суспензии, содержащие отличные концентрации поверхностно-активного вещества и/или n-докозанола, приготавливались с помощью практически той же самой процедуры.

Суспензии стеарилового спирта (С18), арахидилового спирта (С20), генеикозанола (С21), лигноцерилового спирта (С24) и n-гексакозанола (С26) были приготовлены с помощью практически такого же протокола, который описан для суспензий n-докозанола. Для алифатических спиртов, более длинных, чем С22, смеси нагревались перед обработкой ультразвуком до 80°С для лигноцерилового спирта (С24) и до 90°С для n-гексакозанола (С26) и 1-октакозанола (С28). n-Гексадеканол был получен от компании Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI); стеариловый спирт и арахидиловый спирт были получены от компании М. Michel (New York, NY), а остальные соединения - от компании Sigma Chemical Co. (St. Louis, МО).

Штамм MS вируса простого герпеса 2 (ВПГ-2; получен из American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC No. VR-540) использовался для инфицирования клеток почки африканской зеленой обезьяны (клетки Веро; ATCC No. CCL 81), чтобы определить воздействие суспензий алифатического спирта на эффективность формирования бляшки. Клетки Веро культивировались при 6×10⁵ клеток в 1,8 мл среды на 35-мм углубление или 3×10⁵ клеток в 0,8 мл среды на 16-мм углубление в DMEM, дополненной 5% сывороткой плода теленка, пируватом натрия, L-глутамином, пенициллином/стрептомицином и 1 мМоль буфера Hepes при 37°С в увлажненном инкубаторе, содержащем 10% CO₂. Контрольные суспензии поверхностно-активного вещества или суспензии, содержащие алифатические спирты, добавлялись в начале культивирования. Через 24 часа к культурам добавлялся вирус ВПГ-2 с помощью 175 еоб/35-мм углубление и/или 50 еоб/16-мм углубление.

Приблизительно через 42 часа после добавления ВПГ-2 культуры промывались однократно с помощью физиологического солевого раствора. Клетки были зафиксированы и окрашены метанолом, содержащим карбол-фуксин (1,25 мг/мл) и метиленовым синим (2,5 мг/мл), и был произведен подсчет бляшек. Представленные данные являются средними значениями дублированных культур, которые в целом варьируются менее чем на 10%, а статистические сравнения делались с помощью критерия Стьюдента.

Суспензии, содержащие алифатические спирты С21, С24, С26 или С28, ингибировали формирование бляшки вируса ВПГ-2 в клетках Веро по кривым дозового отклика, подобным кривым для n-докозанола (С22). Типичные результаты показаны в Таблице 1. Эффективные концентрации (мМоль), требуемые для 50% ингибирования (ЕС₅₀) формирования бляшки, приведены в таблице 1.

Не было установлено очевидного влияния длины цепочки на ингибирование формирования бляшки ВПГ-2. Все спирты от С21 до С28 ингибировали формирование бляшки вируса ВПГ-2, и ни одно из соединений не проявило существенно большей активности, чем С22. Соединение с нечетной длиной цепочки, генеикозанол (С21), также ингибировало формирование бляшки вирусом ВПГ-2, показывая, что не существует очевидного влияния длины цепочки (то есть молекулы с нечетной длиной цепочки функционируют так же, как и молекулы с четной длиной).

Суспензии стеарилового спирта (С 18) и арахидилового спирта (С20) были токсичны для клеток Веро при добавлении в таких количествах, при которых наблюдалась ингибирующая вирус активность с n-докозанолом. При концентрациях, которые не являлись цитотоксичными (0,2 мкМоль для стеарилового спирта и 2 мкМоль для арахидилового спирта) эквивалентные концентрации алифатических спиртов С 18 и С20 не проявляли ингибирования формирования вирусной бляшки. Контрольные суспензии поверхностно-активного вещества, в которых отсутствовал алифатический спирт, не были цитотоксичными и не проявляли антивирусной активности.

ПРИМЕР 2

Действия увеличения соотношения поверхностно-активного вещества к алифатическому спирту

Антивирусное действие увеличения соотношения (весового) поверхностно-активного вещества к алифатическому спирту было продемонстрировано с помощью увеличения соотношений PLURONIC F-68® и n-докозанола (по сравнению с Примером 1, в котором использовалось соотношение 1:1 (по весу) поверхностно-активного вещества к спирту). Суспензия 1:1 имела молекулярное отношение 26:1 для молекул n-докозанола (молекулярный вес 326,57) и поверхностно-активного вещества (молекулярный вес 8400). В целом, увеличение количества поверхностно-активного вещества уменьшает размер частицы в суспензии и вызывает образование меньших однопластинчатых, а не многопластинчатых пузырьков (Sandra et al., J. Biol. Chem. 254:2244-2249, 1979). Это приводит к тому, что больше спирта оказывается на поверхности частицы, где это возможно, для взаимодействия с клетками.

Суспензии n-докозанола были получены практически так же, как описано в Примере 1, с помощью постоянного количества спирта, но с увеличением количества поверхностно-активного вещества для достижения соотношений 3:1, 5:1 и 10:1 (по весу) между PLURONIC F-68® и n-докозанолом в конечной суспензии. Увеличение соотношения между поверхностно-активным веществом и спиртом увеличивает антивирусную эффективность суспензии в культуре клеток Веро (Фиг.2). То есть суспензия с соотношением 3:1 между поверхностно-активным веществом и спиртом проявила большую антивирусную активность, чем суспензия с соотношением 1:1 (при концентрации n-докозанола ≥8 мМоль); суспензия с соотношением 5:1 проявила увеличенную антивирусную активность по сравнению с суспензией с соотношением 1:1 (при концентрации n-докозанола ≥4 мМоль); а суспензия с соотношением 10:1 проявила большую антивирусную активность по сравнению с суспензией с соотношением 1:1 (при концентрации n-докозанола ≥1 мМоль). Антивирусная активность зависела от n-докозанола в суспензии, поскольку контрольные культуры, инкубированные с такими же концентрациями поверхностно-активного вещества в суспензии, как и для каждого протестированного выше соотношения, практически не проявляли антивирусной активности (фиг.2Б).

Увеличенное соотношение между поверхностно-активным веществом и спиртом коррелировало также с увеличением количества связанного с клетками n-докозанола, что было определено с помощью клеток Веро, инкубированных в течение 24 часов с суспензиями поверхностно-активного вещества-n-[1-¹⁴С] докозанола. Клетки, инкубированные с суспензиями, содержавшими соотношение 4:1 между поверхностно-активным веществом и n-докозанолом, связывали 7,8×10^-6 мкг/клетку, в то время, как эквивалентная культура, инкубировавшаяся в суспензии с соотношением 1:1, связывала 3,1×10^-6 мкг/клетку. Оптимальная антивирусная активность n-докозанола была достигнута при соотношении между поверхностно-активным веществом и спиртом приблизительно от 4:1 до 5:1 (по весу).

Антивирусная активность алифатических соединений не являлась свойством уникальной комбинации алифатического соединения и отдельного неионного поверхностно-активного вещества в суспензии. То есть другие детергенты давали эффективные антивирусные суспензии алифатического спирта. Суспензии n-докозанола с неионным октоксиноловым детергентом (TRITON Х-100®, Rohm & Haas) были приготовлены путем: а) расплавления 2,5 г n-докозанола с 1,5 г детергента при 90°С, б) смешивания расплавленного раствора с 500 мл солевого раствора при 90°С и 1,15 г поливинилпирролидона (ПВП), в) обработки горячей смеси микросжижителем при 1300 фунтах на кв. дюйм в течение 5 циклов, и г) ультрафильтрации обработанной смеси через картридж с пустотелым волокном для устранения избытка детергента и ПВП. Контрольная суспензия детергента была приготовлена подобным образом, за исключением отсутствия n-докозанола. Деоксихолатовые суспензии/n-докозанола (весовое соотношение 1:1 между поверхностно-активным веществом и спиртом) были приготовлены практически так же, как описано выше.

И октоксиноловые, и деоксихолатовые суспензии n-докозанола ингибировали формирование бляшки вируса ВПГ-2 в тесте на клетках Веро. Типичные результаты приведены в Таблице 3. Суспензия октоксинола/n-докозанола ингибировала формирование бляшки по сравнению с октоксиноловой контрольной суспензией при концентрациях n-докозанола, больших или равных 2 мМоль с ЕС₅₀, равной приблизительно 4,5 мМоль. Неионное поверхностно-активное вещество, использованное для приготовления суспензии алифатического спирта, не влияло на антивирусную активность суспензии.

Увеличение соотношения между поверхностно-активным веществом и n-докозанолом значительно увеличивало антивирусную активность суспензии. То есть количество n-докозанола в суспензии, необходимое для 50% ингибирования формирования бляшки, уменьшалось (например, с 15 мМоль до 3 мМоль).

ПРИМЕР 3

Антивирусная активность алифатического алкана, n-докозана

Суспензия поверхностно-активного вещества/n-докозана (Sigma Chemical Co.) была приготовлена практически так же, как описано в Примере 1. Антивирусная активность суспензии поверхностно-активного вещества/n-докозана сравнивалась с активностью подобной суспензии поверхностно-активного вещества/n-докозанола с помощью теста на клетках Веро для измерения ингибирования формирования бляшки ВПГ-2 практически так же, как описано в Примере 1.

Как показано на фиг.4, суспензия поверхностно-активного вещества/n-докозана ингибировала формирование бляшки вирусом ВПГ-2 в культурах клеток Веро с кривой дозового отклика, подобной кривой дозового отклика суспензии поверхностно-активного вещества/n-докозанола. Суспензии n-докозанола () и n-докозана () в PLURONIC F-68® ингибировали формирование вирусной бляшки ВПГ-2 в культивированных клетках Веро, инкубированных с суспензиями в течение 12 часов до добавления ВПГ-2. Контрольные суспензии поверхностно-активного вещества не проявляли антивирусной активности (данные не показаны). Следовательно, и алифатический спирт с 22 атомами углерода, и алкан проявили сравнимую антивирусную активность, показывающую, что гидроксиловая доля не требуется для активности, измеренной по ингибированию формирования вирусной бляшки.

ПРИМЕР 4

Окисление 1-гидроксиловой доли n-докозанола вызывает цитотоксичность

Суспензия неионного детергентного поверхностно-активного вещества/n-докозановой кислоты (Sigma Chemical Co.) была приготовлена и протестирована на антивирусную активность с помощью клеток Веро и ВПГ-2 практически так же, как описано в Примере 1. Жирная кислота с 22 атомами углерода была токсична для клеток Веро при использовании в концентрациях, эквивалентных концентрациям, при которых появлялась ингибирование вируса n-докозанолом (см. Таблицу 2). Когда к культурам добавлялись суспензии n-докозановой кислоты при концентрациях от 4 мМоль до 15 мМоль, клетки округлялись и отходили от пластины. При переносимых концентрациях n-докозановой кислоты (≤ 2 мМоль) антивирусная активность была приблизительно подобна активности, наблюдавшейся с суспензиями n-докозанола при тех же концентрациях, но значительно меньшая, чем наблюдалась с суспензиями n-докозанола при концентрациях от 4 до 15 мМоль. Таким образом, жирная кислота С22 проявила некоторую антивирусную активность, будучи разбавленной до переносимых клетками концентраций, но имела увеличенную по сравнению с соответствующим алифатическим спиртом цитотоксичность.

ПРИМЕР 5

Антивирусная активность мононенасыщенных алифатических спиртов с 22 атомами углерода

Суспензии поверхностно-активного вещества/эруцилового спирта (цис-13-докозен-1-ол; Sigma Chemical Co.) были приготовлены и протестированы на антивирусную активность с помощью клеток Веро и ВПГ-2 практически так же, как описано в примере 1, чтобы определить влияние ненасыщенности углеводородной цепи. Суспензия поверхностно-активного вещества/эруцилового спирта была токсичной для клеток Веро, будучи добавленной к культурам в концентрациях, при которых был эффективен n-докозанол (2-15 мМоль). Однако, как показано в Таблице 2, переносимые клетками концентрации (≤ 1 мМоль) показали значительное ингибирование формирования бляшки вируса ВПГ-2 (до 93%). Кроме того, при концентрации эруцилового спирта 1 мМоль не наблюдалось никакой токсичности для клеток. Эффективная концентрация, требуемая для 50% ингибирования формирования бляшки эруциловым спиртом (ЕС₅₀=0,15 мМоль), была в 60 раз ниже концентрации, необходимой для n-докозанола (ЕС₅₀=9 мМоль). Терапевтический индекс больше или равен 6,7 (то есть 1 мМоль/0,15 мМоль).

Подобным же образом определялась антивирусная активность транс-изомера мононенасыщенного спирта с 22 атомами углерода, брассидилового спирта (транс-13-докозен-1-ол). Суспензии были приготовлены с другим неионным поверхностно-активным веществом, TETRONIC-908® (BASF), а тесты на ингибирование вируса были проведены с помощью ВПГ-1 вместо ВПГ-2 посредством практически тех же процедур, что описаны в Примере 1. Как показано в Таблице 2, брассидиловый спирт проявил антивирусную активность, подобную активности n-докозанола. Клеточная токсичность брассидилового спирта была значительно более низкой, чем токсичность эруцилового спирта.

На основании этих результатов добавление одной двойной цис-связи (но не транс-) в позиции 13 алифатического спирта с 22 атомами углерода сильно увеличивает антивирусную активность. Спирт с двойной транс-связью был менее токсичен, чем спирт с двойной цис-связью. Увеличенная цитотоксичность может вызываться изгибом молекулы за счет двойной цис-связи.

Суспензии поверхностно-активного вещества/эруцилового спирта не имели прямого вирусоуничтожающего действия. То есть инкубирование вируса ВПГ-2 с суспензией поверхностно-активного вещества/эруцилового спирта в течение 2 часов не дезактивировало вирус, что было определено по последующему формированию бляшки на клетках Веро.

ПРИМЕР 6

Тестирование эрукамида в культурах клеток млекопитающего

Эрукамид (цис-13-докозеноамид; молекулярный вес=337,59) является длинноцепочечным амидом с 22 атомами углерода с одной двойной связью, подобным по структуре эруциловому спирту. Суспензия неионного поверхностно-активного вещества/эрукамида (Aldrich Chemical Co.) была приготовлена с помощью TETRONIC-908® и протестирована на антивирусную активность с помощью клеток Веро и ВПГ-2 практически так же, как описано в Примере 1. Амид с 22 атомами углерода был токсичным для клеток Веро при использовании в концентрациях 3 мМоль и выше, подобно токсичности, наблюдавшейся у эруцилового спирта и n-докозановой кислоты (см. Таблицу 2). Когда к культурам добавлялись суспензии эрукамида с концентрациями от 3 мМоль до 15 мМоль, клетки округлялись и отделялись от пластины. При более низких концентрациях эрукамида в суспензии наблюдалась значительная антивирусная активность. При переносимых концентрациях эрукамида (≤ 1,7 мМоль) антивирусная активность суспензии эрукамида была меньше, чем у суспензий эруцилового спирта с практически эквивалентными концентрациями, но больше, чем у суспензий n-докозанола, n-докозана, n-докозановой кислоты или брассидилового спирта. То есть процент ингибирования формирования бляшки для суспензий эрукамида составлял 78% при 1,7 мМоль, 68% при 1,5 мМоль, 58% при 1,2 мМоль, 44% при 0,89 мМоль, 42% при 0,59 мМоль и 34% при 0,03 мМоль. Таким образом, амид с 22 атомами углерода проявил значительную антивирусную активность при переносимых клетками концентрациях, но повышенную цитотоксичность по сравнению с насыщенным алифатическим спиртом с 22 атомами углерода (n-докозанолом) и подобную токсичности моно-ненасыщенного эруцилового спирта, имеющего 22 атома углерода.

ПРИМЕР 7

Цитотоксичность в культурах клеток млекопитающего

n-докозанол проявляет минимальную цитотоксичность по отношению к культивированным клеткам даже при продолжительной инкубации. Три теста использовались для расчета воздействия алифатических спиртов на выживание клеток и пролиферацию: 1) подсчет клеток с помощью гемоцитометра и определение количества клеток без трипанового синего; 2) измерение внедрения ³Н-тимидина в клеточную ДНК посредством добавления ³Н-тимидина (полученного у компании New England Nuclear) к культурной среде, лизирования клеток водой и сбора ДНК на фильтровальную бумагу; и 3) измерение общего клеточного белка с помощью сульфородаминного теста, адаптированного для использования пластин микротитра с 96 углублениями (Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112, 1990). Все эти способы являются хорошо известными тестами на выживаемость клеток и цитотоксичность.

Протестированными клетками были клетки Веро (см. Пример 1), WI-38, диплоидная клеточная линия легкого человеческого эмбриона (АТСС №CCL 75), HFL1, диплоидная клеточная линия легкого человеческого плода (АТСС №CCL 153) и клетки крайней плоти человеческого плода (АТСС №CCL 1635). Гибридомная линия В-клеток мыши (обозначенная MBI-9) была сконструирована и культивирована, как описано ранее (Marcelletti et al., J. Immunol. 148:3857-3863, 1992), однако прочие опухолевые линии и гибридомы, такие, как любые из клеточных линий АТСС TIB или НВ, могут эквивалентно использоваться для определения воздействий алифатических соединений в суспензиях на пролиферацию клеток. Все клетки культивировались в DMEM, дополненной 10% сыворотки плода теленка, пируватом натрия, L-глутамином и пенициллином/стрептомицином с помощью процедур, хорошо известных из существующего уровня техники. Суспензии алифатических спиртов были приготовлены практически так же, как описано в Примере 1.

В первом тесте клетки Веро культивировались до 72 часов в присутствии 9 мМоль n-докозанола, содержавшегося в суспензии с поверхностно-активным веществом без заметных разрушительных воздействий при инокуляции культур в количестве 6×10⁵ клеток в 1,8 мл среды на 35-мм углубление или 3×10⁵ клеток в 0,8 мл среды на 16-мм углубление. Типичные данные представлены в Таблице 3, они показывают, что общее количество жизнеспособных клеток Веро и фибробластов крайней плоти оставалось неизменным после инкубирования с суспензией алифатического спирта в течение от 24 часов до 72 часов. Прочие протестированные клеточные линии, в том числе, фибробласты нормальной кожи (АТСС CRL 1900), легочные клетки WI-38, клетки легкого человеческого плода и гибридома В-клеток, проявляли подобную жизнеспособность клеток в присутствии суспензий n-докозанола, если клетки были инокулированы с достаточно высокими плотностями. Контрольные суспензии поверхностно-активного вещества без алифатического спирта также не проявляли цитотоксичности для клеток Веро, но проявляли зависящую от времени цитотоксичность для клеток крайней плоти плода, которая не наблюдалась для содержащей спирт суспензии. Для клеточной линии крайней плоти плода добавление алифатического спирта очевидно уменьшало цитотоксическое воздействие поверхностно-активного вещества.

Несмотря на то, что клеточные линии оставались невосприимчивыми к трипановому синему даже после 72 часов инкубации с n-докозанолом, фибробласты нормальной кожи, фибробласты крайней плоти, клетки WI-38 и клетки легкого человеческого плода обнаруживали заметное изменение морфологии при анализе с помощью световой микроскопии. После 72 часов инкубирования с суспензиями спирта в цитоплазме клеток появлялись многочисленные светопропускающие участки и клетки становились вакуолизованными. Клетки, обработанные контрольными суспензиями поверхностно-активного вещества, не проявляли вакуолизации после 72-часового инкубирования.

В противоположность отсутствию цитотоксичности, обычно наблюдаемому с суспензиями n-докозанола, суспензии стеарилового спирта (С 18) и арахидилового спирта (С20) были крайне цитотоксичны для всех перечисленных клеточных линий. В присутствии этих алифатических спиртов с 18 и 20 атомами углерода клетки, растущие в виде монослоя, отделялись от пластины и лизировались. Суспендированные клетки также лизировались при обработке суспензиями стеарилового и арахидилового спиртов.

Жизнеспособность рассчитывалась для различных клеточных линий либо путем измерения проникновения ³Н-тимидина в ДНК, либо путем измерения общего клеточного белка посредством окрашивания сульфородамином. Типичные результаты проиллюстрированы на фиг.5 и показывают ингибирование проникновения ³Н-тимидина в ДНК гибридомы В-клетки при различных концентрациях алифатических спиртов с 18, 20 и 22 атомами углерода. IС₅₀ для стеарилового спирта (С 18) для линии В-клеток и прочих клеточных линий равнялось менее чем 35 мкМоль; для арахидилового спирта (С20) IС₅₀ составляло приблизительно 1,7 мМоль. Напротив, IС₅₀ для n-докозанола, оцененное путем экстраполяции, равнялось приблизительно 20 мМоль и было больше, чем наблюдавшееся при использовании только поверхностно-активного вещества. Таким образом, наблюдалось приблизительно 50-кратное уменьшение IC₅₀ при укорачивании алифатического спирта с 20 атомами углерода на 2 атома углерода.

Данные, приведенные на фиг.5, были получены спустя 48 часов инкубирования с суспензиями; тем не менее, очевидная токсичность была заметна в течение 24 часов инкубирования. Суспензии генеикозанола (С21) и суспензии спиртов с более длинной углеродной цепочкой, лигноцерилового спирта (С24), n-гексакозанола (С26), и n-октакозанола (С28) проявили такой же минимальный уровень цитотоксичности, что наблюдался и для суспензий n-докозанола.

Воздействия суспензий n-докозанола и n-докозана на пролиферацию клеток (цитостаз) рассчитывались с помощью теста окрашивания сульфородамином, выполнявшимся на культурах фибробластов крайней плоти человека, инкубированных в пластинах с 96 углублениями. Результаты, приводимые на фиг.6А и 6Б, показывают, что ингибирующие воздействия суспензии n-докозанола зависели от начальной плотности клеток in vivo-культур, в то время, как суспензии n-докозана не проявляли заметного антипролиферативного воздействия по сравнению с контрольной суспензией поверхностно-активного вещества при любой плотности клеток. Результаты, приведенные на фиг.7, демонстрируют, что клетки, связанные с суспензией n-докозанола, проявляли большее ингибирование пролиферации в зависимости от общего времени инкубирования. То есть более длительное инкубирование приводило к большему ингибированию пролиферации клеток.

Фибробласты крайней плоти наносились на пластину с суспензиями алифатического спирта или без них или с контрольными суспензиями поверхностно-активного вещества с плотностью 1000 клеток/углубление (фиг.6А и фиг.7) или 30000 клеток/углубление (фиг.6Б) на пластине с 96 углублениями. После инкубирования в течение 72 часов или 96 часов при 37°С клетки осаждались с помощью трихлоруксусной кислоты, окрашивались сульфородамином и подсчитывались путем измерения OD₅₄₀ в считывателе пластины микротитра. Фиг.6 показывает результаты, полученные для клеток, инкубированных в течение 96 часов, а фиг.7 показывает результаты для клеток, инкубированных в течение 72 часов в сравнении с 96 часами (1000 клеток/углубление).

Суспензии с концентрацией n-докозанола более 3 мМоль ингибировали пролиферацию клеток, нанесенных на пластину с плотностью 1000 клеток/углубление, протестированных после 96-часового инкубирования (фиг.6А). Напротив, суспензия алкана с 22 атомами углерода, n-докозана, проявила минимальное антипролиферационное воздействие по сравнению с контрольной суспензией поверхностно-активного вещества (фиг.6А). При более высоких начальных плотностях клеток (фиг.6Б) или более коротком времени инкубирования (фиг.7) или при концентрациях менее 3 мМоль n-докозанол не ингибировал клеточную пролиферацию по сравнению с контрольными суспензиями (только поверхностно-активное вещество в суспензии). Подобные результаты наблюдались, когда n-докозанол инкубировался с клетками WI-38, клетками легкого человеческого плода и фибробластами нормальной кожи, с помощью того же теста на пролиферацию, который описан для фиг.6 и 7.

Суспензии, содержащие алифатические спирты с более чем 20 атомами углерода, проявляли небольшую клеточную токсичность. Очевидный цитотоксический эффект наблюдался, только если клетки располагались на пластине с низкими плотностями и инкубировались с концентрациями n-докозанола более 3 мМоль в течение 72 часов и дольше. Контрольные суспензии, в которых отсутствовал алифатический спирт, не проявляли цитостатического действия.

Длина углеродной цепочки алифатического спирта влияет на его токсичность для клеток, в противоположность результатам, представленным в Примере 1, показывающим отсутствие видимого воздействия длины цепочки на антивирусную активность. IC₅₀ уменьшились с более чем 15 мМоль для спиртов с 22 или 21 атомами углерода до 1,5 мМоль для спирта с 20 атомами углерода и до менее чем 35 мкМоль для спирта с 18 атомами углерода. Значительное увеличение токсичности для алифатического спирта, содержащего всего на четыре атома углерода меньше, чем у спирта с 22 атомами углерода, не ожидалось.

ПРИМЕР 8

Антивирусная активность составов со стеариновой кислотой

Была измерена антивирусная активность и цитотоксичность стеариновой кислоты (молекулярный вес 284,5), растворенной в этаноле или суспендированной в TETRONIC 908®, практически так же, как описано в Примере 1. Антивирусная активность была измерена в виде процента ингибирования формирования бляшки ВПГ-2 в культуре клеток Веро, практически так же, как описано в Примере 1. Цитотоксичность исследовалась путем изучения под микроскопом клеток на предмет роста клеток и целостности клеток на культивационных пластинах по сравнению с необработанными контрольными культурами. Не определялось заметной токсичности, если монослои обработанных клеток были неотличимы от необработанных клеток. Умеренная токсичность определялась, если монослой клеток утончался по сравнению с контрольными культурами. Токсичность определялась при таких концентрациях, которые разрушали монослой обработанных клеток, о чем свидетельствовало отделение клеток от культивационной пластины. Не наблюдалось заметной токсичности при суспензиях стеариновой кислоты в TETRONIC 908® с концентрацией стеариновой кислоты 11 мкМоль и 22 мкМоль и для раствора стеариновой кислоты в этаноле с концентрацией стеариновой кислоты 3,5 мкМоль. Все эти обработки проявили не более чем 10% ингибирование формирования бляшки ВПГ-2 по сравнению с инфицированными контрольными культурами. Умеренная токсичность наблюдалась после обработки суспензией стеариновой кислоты в TETRONIC 908® с концентрацией стеариновой кислоты 11 мкМоль 44 мкМоль и раствором стеариновой кислоты в этаноле с концентрацией стеариновой кислоты 35 мкМоль; антивирусная активность не могла быть определена из-за состояния клеток. Все суспензии и растворы с концентрацией стеариновой кислоты 88 мкМоль и 350 мкМоль были токсичными, а антивирусная активность не могла быть определена, поскольку монослой клеток был разрушен.

ПРИМЕР 9

Антивирусная активность нанесенных местно составов, содержащих n-докозанол или стеариновую кислоту, для животной модели

Антивирусная активность составов, содержащих стеариновую кислоту, была подтверждена in vivo с помощью модели инфицирования морской свинки вирусом ВПГ-2. Безволосые морские свинки (шесть самцов в тесте, каждый массой 200-300 г; получены из Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) были подвергнуты анестезии и инокулированы вирусом ВПГ-2 (штамм АТСС VR-540, выращенный в клетках Веро и очищенный с использованием стандартных способов). В день 0 каждое животное было инокулировано в шести местах инокуляции в пределах участка площадью 4 см² на спине 75 мкл физиологического солевого раствора, содержащего 9,75×10⁶ ЕОБ/мл. Спустя 24 часа после инокуляции (день 1) животные обрабатывались местно от трех до пяти раз в день кремами, описанными ниже, или водой в качестве отрицательного контроля, и обработка продолжалась при тех же условиях в течение дней 2, 3 и 4. Места инокуляции оценивались на предмет раздражения кожи и формирования пузырьков ежедневно в дни 2, 3 и 4. Раздражение оценивалось по шкале от 0 до 4: 0 для нормальной кожи без эритемы; 1 для легкой эритемы; 2 для умеренной эритемы; 3 для тяжелой эритемы и 4 для сильной эритемы, сопровождающейся кровотечением. Пузырьки определялись как белые, наполненные жидкостью пустулы.

Составами для местного нанесения являлись: крем, содержащий n-докозанол; крем, содержащий стеариновую кислоту; и плацебо. n-Докозаноловый крем содержал 10% по весу n-докозанола (Michel and Co., New York, NY), 5% по весу стеарата сахарозы (Croda, Inc., New York, NY), 8% по весу минерального масла NF (Witco Corp., Newark, NJ), 5% по весу пропиленгликоля USP, 2,7% по весу бензилового спирта NF (Ruger Chemical Co., Irvington, NJ) и 69,3% очищенной воды USP. Крем со стеариновой кислотой содержал 10% по весу стеариновой кислоты (Henkel, Cincinnati, ОН), 5% по весу стеарата сахарозы (Croda, Inc., New York, NY), 8% по весу минерального масла NF (Witco Corp., Newark, NJ), 5% по весу пропиленгликоля USP, 2,7% по весу бензилового спирта NF (Ruger Chemical Co., Irvington, NJ) и 69,3% очищенной воды USP. Оба крема были приготовлены путем комбинирования всех ингредиентов, за исключением воды, нагрева до 80°С и перемешивания ингредиентов при скорости 400±5 об/мин (с помощью перемешивателя Heidolph RZR), к которым при 85°С добавлялась вода при увеличении скорости перемешивания до 1900±5 об/мин. Спустя 3 минуты при температуре 80°С смесь оставлялась остывать при постоянном перемешивании до 30°С (приблизительно 8 минут). Плацебо приготавливалось путем нагревания 70% полиэтиленгликоля (ПЭГ) 400 NF и 30% ПЭГ 3350 NF до 65°С, пока ПЭГ 3350 не расплавлялся полностью, затем непрерывным перемешиванием смеси при 400 об/мин до тех пор, пока смесь не охлаждалась до 30°С.

Результаты данных тестов приводятся в виде средних значений в Таблице 4. Показания в день 2 снимались через 48 часов после инокуляции; в день 3 - через 72 часа после инокуляции; а в день 4 - через 96 часов после инокуляции (общие для шести мест при каждом снятии показаний). Как видно из таблицы 4, на второй день ни один из кремов не повлиял заметно на количество пузырьков по сравнению с обрабатывавшимися водой контрольными экземплярами, и ни оно из мест не проявило раздражения. На третий день места, обработанные n-докозаноловым кремом, показали значительное ингибирование количества пузырьков по отношению к обработанному водой контролю. Представляется, что трех нанесений крема, содержащего n-докозанол, в день было достаточно, поскольку пять нанесений в день дали практически тот же уровень ингибирования. На третий день места, обработанные кремом стеариновой кислоты три раза в день, проявили умеренное ингибирование пузырьков по сравнению с обработанными водой контрольными местами, в то время, как места, обработанные пять раз в день, проявили статистически значительное ингибирование пузырьков. Нанесение полиэтиленгликолевого плацебо пять раз в день не уменьшало заметно количества пузырьков по сравнению с обрабатываемыми водой контрольными местами в любой момент времени.

На третий день некоторое раздражение наблюдалось и для крема с n-докозанолом, и для крема со стеариновой кислотой. На четвертый день обработка три раза в день кремом, содержащим n-докозанол, значительно уменьшала количество пузырьков по сравнению с контрольными местами, несмотря не то, что наблюдалось небольшое раздражение. На четвертый день обработка пять раз в день кремом, содержащим n-докозанол, или кремом, содержащим стеариновую кислоту, значительно уменьшало количество пузырьков по сравнению с контролем и с плацебо, несмотря на то, что легкая эритема наблюдалась при обеих обработках.

Эти полученные in vivo результаты показывают, что местное лечение инфекции ВПГ-2 кремами, содержащими n-докозанол в качестве активного ингредиента, либо стеариновой кислоты в качестве активного ингредиента, может значительно уменьшить количество пузырьков, вызванных инфекцией. Крем, содержащий n-докозанол в качестве активного ингредиента, представляется более эффективным при лечении вирусных инфекций, поскольку значительные уменьшения количества пузырьков наблюдались при всего лишь трех нанесениях в день, в то время, как для того, чтобы заметить уменьшения количества пузырьков при использовании крема, содержащего только стеариновую кислоту в качестве активного ингредиента, требовалось пять нанесений в день.

ПРИМЕР 10

Антивирусная активность местно нанесенных n-докозанола и стеариновой кислоты при клиническом исследовании на людях

Антивирусная активность составов, содержащих стеариновую кислоту, была подтверждена in vivo при клинических исследованиях по лечению орального герпеса у 648 иммунокомпетентных пациентов, которые начали лечение в течение 12 часов после локализованного эпизода орального герпеса (то есть при начальном ощущении продрома, эритеме или папуле, но не при пузырьках). Эти пациенты имели историю острых случаев губного герпеса со средней зафиксированной продолжительностью эпизодов 8,9 дней (от начала ощущений и/или эритемы до полного излечения). Эта продолжительность согласуется с обычной продолжительностью от 8 до 10 дней для эпизодов орального герпеса в опубликованных отчетах об этой болезни (R. J. Whitley, в Fields Virology, p. 2316).

В этих исследованиях пациенты случайным образом получали либо кремы, содержащие 10% n-докозанол, либо 10% стеариновую кислоту, приготовленные практически так же, как описано в Примере 9. Пациенты наносили крем местно на локализованный участок, подверженный герпесу, пять раз в день в течение по меньшей мере пяти дней (25 нанесений по расписанию с повторными нанесениями после активных упражнений, приема душа или мытья, повторные нанесения не считались нанесениями по расписанию). Если эпизод герпеса продолжался после пяти дней, пациенты продолжали наносить крем до десяти дней (50 нанесений по расписанию). Пациенты вели дневник времени нанесений, очаговой боли и чесоточных симптомов и обследовались дважды в день в течение периода лечения для изучения эффективности лечения.

Критерии, использованные для оценки лечения, содержали время выздоровления, которое содержит прерывание эпизода (определяемое как полное устранение связанных с эпизодом симптомов до достижения пузырьковой стадии) или полное выздоровление (определяемое как отсутствие корки без следов активного поражения, независимо от того, были ли какие-либо остаточные после поражения изменения кожи, такие как эритема, отшелушивание или асимметрия); время прекращения размножения вируса (только для исследования номер 1); время уменьшения боли; время прекращения боли; время прекращения зуда и время корковой стадии.

Для сравнения, использовались данные истории болезни пациентов и опубликованные результаты (Spruance et al., New Engl. J. Med. 297:69-75, 1977) для не подвергшихся лечению поражений.

Таблица 5 показывает результаты двух независимых исследований (обозначенных цифрами в скобках в таблице). Эти данные показывают, что продолжительность герпесной лихорадки значительно уменьшается в среднем до 5,5 дней после лечения либо с помощью крема, содержащего n-докозанол, либо с помощью крема, содержащего стеариновую кислоту, по сравнению с отмеченными для пациентов прежними 8,9 днями продолжительности не подвергавшихся лечению герпесными лихорадками. Таким образом, продолжительность была значительно снижена на более чем 35% (Р≤0,0001), если пациенты лечились с самого начала эпизода с помощью либо крема, содержащего n-докозанол, либо крема, содержащего стеариновую кислоту. Кроме того, лечение на ранней стадии с помощью любого такого крема укорачивало продолжительность болевых симптомов, связанных с возвратными эпизодами герпеса с приблизительно 6 дней, когда заболевание не лечилось, до менее чем 3 дней для обработанных участков.

ПРИМЕР 11

Улучшенное излечение поражений вирусом ВПГ-1 после местного лечения с помощью формулы, содержащей n-докозан

Десяти пациентам с предшествующими историями возникновения поражений вирусом ВПГ-1 на лице (герпесные лихорадки) давались кремовые формулы с 5,0 мг/мл n-докозана, суспендированного в 20 мг/мл полоксамерного блок-сополимерного поверхностно-активного вещества; формулы крема содержали 5-8% по весу минерального масла NF в качестве смягчителя, 5% по весу пропиленгликоля USP в качестве увлажнителя и консерванта, 1-3% по весу бензилового спирта NF в качестве вспомогательного консерванта и сбалансированную очищенную воду в качестве водного носителя.

Людям давались инструкции по нанесению крема на пораженные участки или ранние воспаления вокруг рта, когда человек обнаруживал герпесную лихорадку. Эти люди прежде имели герпесные лихорадки, не подвергавшиеся лечению, в течение в среднем десяти дней, при этом все не подвергавшиеся лечению герпесные лихорадки развивались в пузырьки, которые превращались в струпья и проходили. Люди были проинструктированы наносить крем на пораженные участки кожи по меньшей мере дважды в день и вплоть до четырех раз в день. Люди также были проинструктированы записывать стадии инфекции (от эритемы до папулы и до пузырьков до отека и до струпа), которые они наблюдают, и записывать субъективные наблюдения относительно боли, связанной с поражениями вирусом ВПГ-1.

Каждый человек лечил по меньшей мере одну герпесную лихорадку в течение исследования. Все пациенты отметили уменьшение боли при лечении герпесных лихорадок кремом, содержащим n-докозан, по сравнению с предыдущими поражениями, которые не подвергались лечению. Для каждого человека продолжительность инфекции ВПГ-1 по сравнению с предыдущими случаями инфекции уменьшалась на от 20% до 60% (то есть продолжительность составляла от 4 до 8 дней в зависимости от человека). По меньшей мере у половины людей, принимавших участие в исследовании, лечивших герпесные лихорадки четыре раза в день с помощью крема, содержавшего n-докозан, герпесные лихорадки не прогрессировали до пузырьковой стадии. Вместо этого при местном лечении поражений вирусом ВПГ-2 на стадии эритемы или папулы поражения обычно не прогрессировали дальше стадии папулы и излечивались без дальнейшего развития поражения. Эти результаты показывают, что формулы, содержащие n-докозан, являются эффективными при предотвращении и лечении вирусных инфекций при местном применении.

ПРИМЕР 12

Лечение грипповой инфекции с помощью формул, содержащих эруциловый спирт и эрукамид

Водная суспензия 0,15 мМоль эруцилового спирта в 1,4 мМоль неионного полоксамера 188 в качестве поверхностно-активного вещества, содержащая пропиленгликоль USP (0,5% по весу) и бензиловый спирт NF (2% по весу) в качестве консервантов, приготавливалась в стандартной гибкой бутылочке для назального спрея, способной при сжатии выдавать суспензию в виде аэрозоля. Подобным же образом препарат, содержащий 1,5 мМоль эрукамида, приготавливался в контейнерах для назального спрея для получения суспензии в виде аэрозоля. Препараты вводились во время гриппового сезона двум группам (одной для тестирования эруцилового спирта и одной для тестирования эрукамида) по двадцать здоровых людей в каждой, которые не были привиты от вируса гриппа в течение предыдущих 12 месяцев.

Люди обеспечивались инструкциями по использованию полученной ими суспензии в качестве назального спрея от одного до пяти раз в день (от одного до двух впрыскиваний в каждую ноздрю с интервалами 2-4 часа) при обнаружении симптомов гриппа (застой в дыхательных путях, боли в теле, повышенная чувствительность глаз, лихорадка, тошнота или любая их комбинация). Людей инструктировали записывать свои субъективные и объективные наблюдения о тяжести симптомов гриппа (продолжительность симптомов, температура тела при лихорадке, продолжительность и тяжесть болей в теле) в течение периода, во время которого они обнаружили симптомы. Людей также инструктировали записывать данные об использовании ими суспензии в виде назального спрея (количество впрыскиваний и время приема) в течение этого периода. Людей просили обобщить их субъективные наблюдения о тяжести симптомов при использовании аэрозоля из поверхностно-активного вещества/эруцилового спирта или аэрозоля из поверхностно-активного вещества/эрукамида по сравнению с предшествующим опытом перенесения грипповой инфекции.

Приблизительно половина принимавших участие в исследовании людей, использовавших аэрозоль из поверхностно-активного вещества/эруцилового спирта, как было предписано, отметили уменьшение симптомов гриппа по сравнению с предыдущими эпизодами заболевания гриппом. Те, кто использовал аэрозоль в среднем по пять раз в день (одно-два впрыскивания в каждую ноздрю), отметили сильно уменьшенные застои в дыхательных путях, связанные с инфекцией гриппа, по сравнению с людьми, не подвергнутыми лечению. Те, кто использовал аэрозоль в среднем по пять раз в день, отметили значительное уменьшение частоты лихорадки (от одного до трех раз за один эпизод заболевания гриппом) по сравнению с людьми, не подвергнутыми лечению (от двух до пяти раз за один эпизод заболевания гриппом), и значительное уменьшение наивысшей зафиксированной температуры тела (в среднем 37,8°С) по сравнению с людьми, не подвергнутыми лечению (в среднем 38,9°С). Средняя продолжительность симптомов гриппа у приблизительно половины людей, лечившихся аэрозолем из поверхностно-активного вещества/эруцилового спирта, составляла 1,7 дня, в то время, как у людей, не подвергнутых лечению, средняя продолжительность симптомов гриппа составляла 3 дня. Эти результаты показывают, что суспензия поверхностно-активного вещества/эруцилового спирта обладает терапевтическим антивирусным эффектом при нанесении на слизистые оболочки.

Аналогичные результаты были получены для пациентов, лечившихся назальным спреем суспензии эрукамида. Приблизительно половина пациентов отметили уменьшение симптомов гриппа по сравнению с предшествующими эпизодами заболевания гриппом при использовании спрея поверхностно-активного вещества/эрукамида сразу же после обнаружения симптомов. Большинство людей испытывали сильно уменьшенные застои в дыхательных путях при использовании аэрозоля в среднем по три раза в день (одно-два впрыскивания в каждую ноздрю) по сравнению с испытываемыми ранее гриппозными состояниями. Большинство из тех, кто использовал аэрозоль в среднем по три раза в день, отметили один эпизод лихорадки в течение периода проявления симптомов гриппа со средней наивысшей отмеченной температурой тела приблизительно 37°С. Средняя продолжительность симптомов гриппа для людей, использовавших аэрозоль по меньшей мере три раза в день, составляла два дня, по сравнению с продолжительностью симптомов гриппа у людей, не подвергнутых лечению, составлявшей три дня. Эти результаты показывают, что аэрозоль суспензии поверхностно-активного вещества/эрукамида имеет терапевтическое антивирусное воздействие при нанесении на слизистые оболочки дыхательной системы.

ПРИМЕР 13

Лечение инфекции ВПГ-2 через слизистую оболочку с помощью брассидилового спирта

Свечи, содержащие 8 мМоль брассидилового спирта в суспензии неионного детергента, приготовленные практически так же, как описано в Примерах 1 и 5, формулировались посредством добавления безводной декстрозы (300-400 мг/свечу), растительного крахмала (300-400 мг/свечу) и стеарата магния (5-10 мг/свечу) для получения смеси, которая спрессовывалась в свечи (1-10 г одна свеча) для вагинального применения.

Пятнадцать инфицированных ВПГ-2 женщин с предшествующей историей вагинальных и/или перивагинальных герпесных поражений снабжались свечами и инструктировались по поводу использования от одной до четырех свечей в день при обнаружении герпесных поражений или связанного с герпесными поражениями дискомфорта. Женщинам были даны инструкции записывать свои наблюдения о продолжительности активной инфекции, тяжести поражений (фазы эритемы, папулы, пузырька, отека или струпа), относительных количествах зафиксированных поражений по сравнению с предшествующими проявлениями активной инфекции и субъективные оценки боли или дискомфорта, связанных с эпизодом активной инфекции. Женщинам предписывалось использовать свечи сразу же после обнаружения активной инфекции или симптомов активной инфекции. Эти женщины имели в прошлом 12-дневную среднюю продолжительность поражений, развивавшихся в пузырьки при отсутствии лечения.

Во всех случаях каждая женщина лечила по меньшей мере один эпизод активной герпесной инфекции в течение исследования. Все пациенты отметили уменьшение боли и дискомфорта при лечении инфекции данными свечами по сравнению с предшествующими эпизодами инфекции без лечения. Во всех случаях средняя продолжительность активной инфекции ВПГ-2 до 7-8 дней при лечении свечами, а пять женщин сообщили о средней продолжительности 3-4 дня. В большинстве случаев при использовании свечей четыре раза в день и начале лечения на стадии эритемы или папулы инфекция не прогрессировала до пузырьковой стадии и излечивалась после достижения стадии папулы.

Альтернативно суспензия поверхностно-активного вещества/брассидилового спирта формулировалась в виде мази, содержащей приблизительно 50-80% белого мягкого парафина, который расплавлялся при 60°С для добавления и диспергирования суспензии поверхностно-активного вещества/брассидилового спирта перед охлаждением. Мазь раздавалась в сжимающихся тюбиках с предписанием использовать от двух до пяти раз в день по необходимости для внешнего генитального лечения активных герпесных инфекций. Людям предписывалось использовать количество, достаточное для покрывания поражений вирусом ВПГ-2 на генитальных или перивагинальных участках от одного до четырех раз в день сразу же после обнаружения симптомов. По меньшей мере половина пациентов, использовавших мазь, сообщили об уменьшении боли и дискомфорта, сокращенном времени излечения и поражениях, не прогрессировавших до пузырьковой стадии перед излечением.

Эти результаты показывают, что суспензии поверхностно-активного вещества/брассидилового спирта обладают терапевтическим антивирусным воздействием при местном нанесении на слизистые оболочки.

ПРИМЕР 14

Лечение инфекции ЭБВ (инфекционного мононуклеоза) с помощью суспензий длинноцепочечного алифатического спирта

Десять юношей (в возрасте 14-19 лет), которым был поставлен диагноз инфекционный мононуклеоз (острая боль в горле, лихорадка, недомогание, общая лимфаденопатия, нетипичные мононуклеозные Т-лимфоциты в периферийной крови, общее количество белых кровяных телец в крови 12000-18000) системно лечились посредством стерильной водной суспензии неионного детергентного поверхностно-активного вещества, содержащей 10 мМоль n-гексакозанола, приготовленной практически так же, как описано в Примере 1. Суспензия инъецировалась (внутримышечно или внутривенно) в дозировках от 0,1 мг/кг до 0,2 мг/кг алифатического спирта, вводимого врачом в клинических условиях. Симптомы пациентов отслеживались ежедневно в течение недели и еженедельно в течение трех месяцев на предмет проявления инфекционного мононуклеоза. Все пациенты оказались ЭБВ-позитивными в результате теста, проведенного в конце периода исследования, что было определено по обнаружению антител к вирусу ЭБВ в их сыворотке с помощью стандартных иммунных исследований.

У всех пациентов наблюдалось излечение симптомов острых болей в горле и лихорадки в течение одной недели подачи суспензии поверхностно-активного вещества/n-гексакозанола и уменьшение симптомов лихорадочного заболевания в целом в течение двух недель введения. У восьмерых из проходящих лечение пациентов обнаружилось уменьшение общей лимфаденопатии в течение от двух до трех недель введения суспензии алифатического спирта с возвращением жизненной энергии. У всех излечиваемых пациентов наблюдалось уменьшение нетипичных мононуклеозных Т-лимфоцитов в периферийной крови в течение четырех недель введения при нормальном количестве белых кровяных телец в крови спустя два месяца после лечения.

Аналогичные результаты были получены для инфицированных ЭБВ пациентов, проявлявших симптомы инфекционного мононуклеоза, которые системно лечились с помощью суспензий n-докозанола, лигноцерилового спирта и n-октакозанола в эффективных концентрациях.

Данные результаты показывают, что системное введение выбранных длинноцепочечных алифатических спиртов в виде водных суспензий имеет терапевтическое антивирусное воздействие.

ПРИМЕР 15

n-докозанол и АЦВ проявляют антивирусную активность по отношению к ВПГ у безволосых морских свинок

Потенциал антивирусного взаимодействия n-докозанола и АЦВ был исследован in vivo с помощью модели кожной инфекции ВПГ-2 у безволосых морских свинок. Кожные участки на спинках безволосых морских свинок инокулировались посредством ВПГ-2 с помощью татуировочного инструмента. Инфицированные участки кожи обрабатывались по два раза в день по предписанию, начиная через 2 часа после инокуляции. Обработка дважды в день вместо обычного режима, содержащего от трех до пяти обработок, выбиралась потому, что могли лучше наблюдаться различия между комбинированным кремом и одноформульными кремами, и контрольным наполнителем, который содержал стеариновую кислоту и не давал положительного отклика при нанесении менее 5 раз в день.

Вызываемые вирусом ВПГ-2 пузырьки были очевидны через 72 часа после инокуляции ВПГ-2 (панель А фиг.8). Не подвергавшиеся лечению участки проявляли в среднем по 54 пузырька в этот момент времени. Количества пузырьков уменьшались на 31% при использовании либо n-докозанолового крема, либо крема АЦВ, но такое ингибирование не было статистически значимым по сравнению с необработанной группой. Большее ингибирование (65%) наблюдалось для крема, содержащего и n-докозанол, и АЦВ, а среднее значение 19 пузырьков статистически отличалось и от необработанной группы, и от группы, обработанной наполнителем. Ни n-докозанол, ни АЦВ не вызывали воспаления или токсичности, даже если оба медикамента наносились попеременно.

Через 96 часов после инокуляции вируса ВПГ-2 необработанные места проявляли в среднем по 27 пузырьков. Значительное ингибирование количества пузырьков наблюдалось на всех обработанных участках за исключением обработанных контрольным наполнителем. Участки, обработанные тестовыми формулами, содержащими только n-докозанол или только АЦВ, уменьшали среднее количество пузырьков на 63% и 50% соответственно. Еще большая ингибирующая активность наблюдалась на участках, обработанных комбинированным кремом с n-докозанолом и АЦВ, 89%. Ингибирование, наблюдавшееся для комбинированного крема, было статистически больше, чем наблюдавшееся для тестовых формул, содержащих только n-докозанол или АЦВ, р=0,003 и р=0,0015, соответственно. Опять же, не было обнаружено воспалений или токсичности, вызванных n-докозанолом и АЦВ, даже при их использовании в комбинации.

Анализ площади под кривой (ППК), определяемой как среднее количество пузырьков, умноженное на количество часов, в течение которого наблюдаются пузырьки, дает основания предполагать синергию комбинации n-докозанола и АЦВ. Средняя ППК для необработанной группы составляла 698 пузырько-часов. Обработка только n-докозанолом или только АЦВ приводила к соответствующим средним ППК, равным 464 (34% ингибирования) и 496 (30% ингибирования). Теоретический дополнительный эффект сочетания n-докозанол плюс АЦВ дал бы ППК, равную 322 (698 × оставшуюся часть после обработки n-докозанолом [0,66] × оставшуюся часть после обработки АЦВ [0,7]). Средняя ППК для комбинированного крема равнялась 206 пузырько-часам, с 70% ингибированием, р=0,01 против теоретического дополнительного эффекта. Таким образом, эти наблюдения in vivo предполагают синергию n-докозанола и АЦВ при ингибировании вызванного вирусом ВПГ-2 кожного заболевания и указывают на то, что n-докозанол и АЦВ не взаимодействуют in vivo вредным образом, по меньшей мере при нанесении на кожу.

ПРИМЕР 16

n-Докозанол и АЦВ проявляют синергическую активность против ВПГ в культурах клеток Веро

Потенциал антивирусного взаимодействия n-докозанола и АЦВ исследовался более полно на инфицированных ВПГ-2 культурах клеток Веро. Клетки Веро были культивированы в среде отдельно или в среде, содержащей 3 мМоль n-докозанол или 0,4 мМоль PLURONIC F-68® (количество в культуре с 3 мМоль n-докозанола). Культуры инкубировались 24 часа, затем подвергались воздействию АЦВ и инфицировались с помощью 50 единиц образования бляшки вируса ВПГ-2; формирование бляшки оценивалось спустя 44 часа после этого. Как показано на фиг.9, необработанные (только среда) культуры проявляли в среднем 46 бляшек, а АЦВ ингибировал формирование бляшки с 50% эффективной концентрацией (ЕС₅₀), равной 5 мкМоль. Подобная ЕС₅₀ для АЦВ была получена для клеток, культивированных в среде, содержащей PLURONIC F-68®. Культуры, содержавшие n-докозанол, проявили на 40% меньше бляшек, чем необработанные или обработанные PLURONIC F-68® контрольные культуры, что отражает антивирусную активность этого медикамента. В частности, отметим, что ЕС₅₀ для АЦВ у содержащих n-докозанол культур была уменьшена до 0,2 мкМоль. Сравнение кривой для теоретического добавочного эффекта АЦВ плюс n-докозанола подтверждает, что это 25-кратное улучшение активности АЦВ было больше, чем ожидалось для добавочного эффекта. Клеточная токсичность, такая как цитоплазматические вакуоли, не отмечалась у содержащих АЦВ культур, независимо от присутствия или отсутствия n-докозанола.

ПРИМЕР 17

Синергическое ингибирование воспроизводства ВПГ-1 n-докозанолом и АЦВ

Исследовалось также влияние АЦВ на ЕС₅₀ n-докозанола для ингибирования формирования бляшки ВПГ-2. Несмотря на отсутствие графического представления, для n-докозанола наблюдалась ЕС₅₀, равная 2-3 мМоль для ингибирования формирования бляшки ВПГ-2 при использовании отдельно, а при использовании в сочетании с АЦВ в диапазоне 0,2-10 мкМоль, наблюдались ЕС₅₀ для n-докозанола, равные 2-3 мМоль. Как вычерчено на изоболограмме (не показана), эти результаты предполагают, что АЦВ имеет небольшое воздействие на антивирусную активность n-докозанола, даже несмотря на то, последний медикамент значительно улучшает активность первого.

Значительное уменьшение ЕС₅₀ для АЦВ с помощью n-докозанола наблюдалось также при ингибировании формирования бляшки вируса ВПГ-1 (не показано). Это было связано со значительным уменьшением ЕС₉₀ для АЦВ для ингибирования потомства ВПГ-1 (панель А на фиг.10). Клетки Веро было обработаны как прежде указанными концентрациями n-докозанола, PLURONIC F-68® и АЦВ и инфицированы вирусом ВПГ-1 (500 ЕОБ на культуру, 0,002 ЕОБ/клетка). Всплывшие на поверхность культуры собирались спустя 72 часа и исследовались на ВПГ-1. В культурах, содержащих только среду или среду плюс PLURONIC F-68®, наблюдались ЕС₉₀ для АЦВ, равные 10 мкМоль для ингибирования воспроизводства ВПГ-1. n-Докозанол в концентрации 3,3 мМоль ингибировал воспроизводство ЕОБ на 55% и понижал ЕС₉₀ для АЦВ в 17 раз. Еще большая синергия наблюдалась при концентрации n-докозанола, равной 10 мМоль (фиг.10), когда ЕС₉₀ была уменьшена в 40 раз. Синергия была выражена еще сильнее при концентрации медикамента 30 мМоль (ЕС₉₀ для АЦВ <0,1 мкМоль, не показано).

Для того чтобы дополнительно подтвердить, что эффекты комбинирования n-докозанола и АЦВ являлись синергическими, данные были преобразованы в изоболограмму (панель Б фиг.10). Ломаная линия, проходящая диагонально, показывает теоретический график для независимых ингибиторов, смещение кривой влево отображает синергическое взаимодействие, в то время, как смещение вправо отображало бы антагонизм (Spector et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1051-1055, 1989). Ясно, что экспериментальные наблюдения за воспроизводством ЕОБ ВПГ-1 указывают на синергию комбинации медикаментов n-докозанола и АЦВ.

ПРИМЕР 18

Синергия n-докозанола и АЦВ при ингибировании репликации вируса ветряной оспы (ВВО) человека и цитомегаловируса (ЦМВ) человека в клетках MRC-5

Результаты, показанные в Таблице 6, указывают на два важных момента. Во-первых, наблюдалось, что синергическая активность n-докозанола и АЦВ не зависела от использования клеток Веро и могла также быть задокументирована для нормальной человеческой клеточной линии фибробластов MRC-5. Во-вторых, наблюдалось, что такая активность не ограничивалась вирусом ВПГ и могла также быть продемонстрирована при ингибировании репликации человеческих ВВО и ЦМВ. Заболевания, вызываемые вирусами ВВО и ЦМВ, обычно проявляют тенденцию к сопротивлению лечению с помощью АЦВ (Hirsch et al., в Fields Virilogy Third Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, eds. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, pp. 431-466, 1996). Таким образом, улучшение антивирусной активности с помощью n-докозанола может быть клинически значительным.

Клетки MRC-5 культивировались (16-мм углубления, 10⁵ клеток/мл, 1 мл/углубление) только в среде, или в среде, содержащей 30, 10 или 3,3 мМоль n-докозанола или то же количество Pluronic F-68, что содержалось в культурах с концентрацией n-докозанола 30 мМоль. После инкубирования в течение ночи добавлялся ацикловир с различными концентрациями, и культуры инфицировались вирусами ВВО (группы I-V) или ЦМВ (группы VI-X). После двух дней инкубирования ко всем культурам добавлялись среда без n-докозанола, Pluronic F-68 или ацикловир. Спустя еще два дня клетки культур собирались и исследовались на предмет наличия инфицированных клеток (ИК) посредством исследования в инфекционном центре. Данные об инфицированных клетках выражены в виде средних значений инфицированных клеток/культуру, выведенных из четверных экземпляров (ВВО) или тройных экземпляров (ЦМВ) углублений на начальную группу культур (Ref. JM 1290, 460L-134/9-23-96) rvsd 4-4-97.

Как показано для групп I-V в Таблице 6, 350000 инфицированных вирусом ВВО клеток могут быть обнаружены в культурах, содержащих только среду, через четыре дня после инфицирования клеток MRC-5 с помощью 500 ЕОБ вируса ВВО. АЦВ ингибировал инфекцию ВВО при ЕС₅₀, равной 3 мкМоль, и ЕС₉₀, равной 10 мкМоль. Репликация ВВО ингибировалась n-докозанолом при ЕС₅₀, равной приблизительно 10 мМоль. ЕС₅₀ и ЕС₉₀ для АЦВ уменьшались соответственно на 90% и 80% высокой концентрацией n-докозанола, равной 30 мМоль.

Подобные результаты были получены для ЦМВ (группы VI-X, Таблица 6). Через четыре дня после инфицирования клеток MRC-5 с помощью 500 ЕОБ вируса ЦМВ в контрольных культурах можно было обнаружить 200000 инфицированных клеток MRC-5, и АЦВ ингибировал такую инфекцию при ЕС₅₀ и ЕС₉₀, равных соответственно 30 и 250 мкМоль. n-Докозанол ингибировал репликацию ЦМВ при ЕС₅₀, равной приблизительно 10 мМоль. ЕС₅₀ и ЕС₉₀ для АЦВ для ингибирования репликации ЦМВ были уменьшены на 90% с помощью n-докозанола в концентрациях 10-30 мМоль.

ПРИМЕР 19

Нуклеозидные аналоги, отличные от АЦВ, также синергически взаимодействуют с n-докозанолом при ингибировании репликации ВПГ-1 in vivo

Было интересно определить, ограничивается ли антивирусная синергия с n-докозанолом АЦВ, или прочие нуклеозидные аналоги могут также взаимодействовать с n-докозанолом. Вопрос исследовался с помощью воспроизводства ЕОБ ВПГ-1 в культурах клеток Веро (фиг.11). Не подвергнутые обработке, подвергнутые обработке n-докозанолом (15 мМоль) и подвергнутые обработке PLURONIC F-68® клетки Веро инфицировались посредством 500 ЕОБ/культуру вируса ВПГ-1 и подвергались воздействию различных концентраций упомянутых нуклеозидно-аналоговых антивирусных медикаментов. Спустя три дня всплывшие культурные жидкости были собраны и проанализированы на предмет потомства ЕОБ ВПГ-1. В контрольных культурах наблюдалась типичная анти-ВПГ-1 ЕС₉₀ для АЦВ, равная 19 мкМоль, которая уменьшалась до 0,9 мкМоль (уменьшение в 21 раз) в присутствии n-докозанола. Нуклеозидный аналог аденин арабинозид (Ага-А) проявил ЕС₉₀, равную приблизительно 22 мкМоль при отдельном использовании, и ЕС₉₀, равную приблизительно 1,4 мкМоль (16-кратное уменьшение), когда в культуру был включен n-докозанол. Трифлуридин проявил ЕС₉₀, равную приблизительно 6,8 мкМоль, в отсутствие n-докозанола и ЕС₉₀, равную приблизительно 1,35 мкМоль (уменьшение в 5 раз), когда присутствовали оба медикамента. Подобным же образом, рибавирин, используемый отдельно, ингибировал репликацию ВПГ-1 с EC₉₀, равной приблизительно 24,6 мкМоль, которая уменьшалась до приблизительно 0,33 мкМоль (уменьшение в 75 раз) в присутствии n-докозанола. Несмотря на то, что эти данные не показаны, рифампицин не ингибировал репликацию ВПГ независимо от того, присутствовал или отсутствовал n-докозанол.

ПРИМЕР 20

n-Докозанол и фосфорно-муравьиная кислота (ФМК) проявляют дополнительную антивирусную активность против репликации ВПГ-1

Потенциал антивирусного взаимодействия между n-докозанолом и ФМК, органическим аналогом неорганического пирофосфата, представлен на Фиг.12. Как показано на панели А, необработанные культуры клеток Веро производили приблизительно 10⁷ ЕОБ вируса ВПГ-1 через три дня после инфицирования, а ФМК ингибировала такое производство ЕОБ с ЕС₉₀, равной приблизительно 18 мкМоль. Аналогичные уровни производства ЕОБ и опосредованного ФМК ингибирования наблюдались для культур, обработанных контрольным наполнителем, PLURONIC F-68®. Культуры, обработанные с помощью только 15 мМоль n-докозанола, проявляли приблизительно в 10 раз меньше ЕОБ ВПГ-1, и ФМК дополнительно уменьшала производство ЕОБ с ЕС₉₀, равной 17 мкМоль. Комбинированные воздействия n-докозанола и ФМК совпадало с графиком для теоретических добавочных эффектов.

Панель Б на фиг.12 иллюстрирует два момента. Во-первых, результаты для культур, в которых отсутствовала ФМК, показывают, что n-докозанол не ингибирует репликацию вируса коровьей оспы; 5-6×10⁵ ЕОБ вируса коровьей оспы были воспроизведены независимо от присутствия или отсутствия n-докозанола или PLURONIC F-68®. Во-вторых, присутствие или отсутствие n-докозанола или PLURONIC F-68® не улучшало и не подавляло антивирусной активности ФМК, направленной против репликации вируса коровьей оспы, то есть не происходило межмедикаментного взаимодействия для этого отдельного вируса.

ПРИМЕР 21

n-Докозанол увеличивает ингибирование репликации вируса коровьей оспы нуклеозидными аналогами

Поскольку вирус коровьей оспы нечувствителен к антивирусному воздействию n-докозанола, было возможно исследовать зависимость между антивирусной активностью n-докозанола и синергию с нуклеозидными аналогами. Как описывалось выше для панели Б фиг.12, необработанные клетки Веро проявляли в среднем воспроизведение 5-6×10⁵ ЕОБ потомства вируса коровьей оспы спустя 3 дня после инфицирования, независимо от присутствия или отсутствия n-докозанола или PLURONIC F-68®. Как показано на панели А фиг.13, репликация вируса коровьей оспы в контрольных культурах (среда или PLURONIC F-68®) ингибировалась трифлуридином, Аrа-А и рибавирином с ЕС₅₀, равными приблизительно 2, 20 и 25 мкМоль соответственно. ЕС₅₀ для каждого из этих нуклеозидных аналогов была уменьшена по меньшей мере в 10 раз в культурах, содержащих 15 мМоль n-докозанола. Вирус коровьей оспы обычно нечувствителен к антивирусным воздействиям АЦВ, и обработка клеток n-докозанолом не изменяла этой выборочности. Панель Б фиг.13 представляет ЕС₉₀ для тех же самых нуклеозидных медикаментов, и сравнимые заключения могут быть выведены из этих результатов. Эти данные показывают, что вирус не должен быть чувствительным к антивирусной активности n-докозанола для того, чтобы n-докозанол увеличивал антивирусную активность нуклеозидных аналогов, направленную против этого вируса.

В итоге n-докозанол не проявляет вредного межмедикаментозного взаимодействия с АЦВ в любой тестовой системе. Кожные раздражения кожи морской свинки не наблюдались, когда эти два медикамента наносились отдельно или в комбинации. Кожа морской свинки имеет тенденцию проявлять большую чувствительность к раздражению, чем кожа человека, при этом предполагается, что попеременное лечение пациентов n-докозанолом и АЦВ также не вызовет раздражения. Клеточная токсичность in vitro также не наблюдалась для этих двух медикаментов, отдельно либо в комбинации. Напротив, n-докозанол значительно улучшает антивирусную активность АЦВ против ВПГ in vitro и in vivo. Это улучшение было синергическим in vitro. Эти результаты предполагают, что сопутствующее лечение возвратного заболевания ВПГ с помощью n-докозанола плюс АЦВ могло бы быть очень выгодной терапевтической стратегией.

Антивирусная синергия n-докозанола с АЦВ не ограничивалась вирусами ВПГ-1 и ВПГ-2, а наблюдалась также с вирусами ВВО и ЦМВ. Эти последние результаты являются резонными, поскольку все эти герпесные вирусы чувствительны к АЦВ (Hirsch et al., в Fields Virology Third Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley. eds. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, pp. 431-466, 1996), хотя и в разной степени. Такая синергия наблюдалась также для других протестированных нуклеозидных аналогов, которые ингибировали репликацию ВПГ. Это было ожидаемым, поскольку различные нуклеозидные и нуклеотидные аналоги имеют тенденцию использовать общие клеточные и вирусные механизмы для транспорта по плазменной мембране, метаболической активизации и антивирусного экспрессирования. Поскольку вирусы ВВО и ЦМВ имеют общие с вирусом ВПГ шаги репликации, вероятно, что n-докозанол будет также проявлять синергию с нуклеозидными аналогами, отличными от АЦВ, для ингибирования также и этих вирусов.

n-Докозанол проявляет синергию с определенными протестированными нуклеозидными аналогами при ингибировании репликации вируса коровьей оспы. Репликация вируса коровьей оспы не ингибируется n-докозанолом, что показывает, что вирусу не обязательно быть чувствительным к n-докозанолу для наблюдения синергии со вторым классом медикаментов. Это важный результат по двум причинам. Во-первых, сравнение отклика вируса коровьей оспы с откликом вируса герпеса может дать информацию о молекулярных механизмах такой синергии. Во-вторых, что более важно, это предполагает, что использование n-докозанола не обязательно ограничивать лечением заболеваний, вызванных вирусами, которые чувствительны к антивирусным воздействиям этого медикамента. Эти результаты показывают также, что n-докозанол может использоваться для улучшения активности нуклеозидного аналога независимо от вирусной инфекции, для лечения прочих заболеваний, таких как воспаление, аутоиммунитет и рак.

Антивирусная выборочность протестированных нуклеозидных и нуклеотидных аналогов представляется неизменной при обработке n-докозанолом. Выборочность антивирусного медикамента типа АЦВ зависит от характеристик вируса, таких как экспрессия вирусно-закодированной тимидиновой киназы. Это объясняет отсутствие ингибирования репликации вируса коровьей оспы АЦВ независимо от присутствия или отсутствия n-докозанола.

Степень, до которой n-докозанол может взаимодействовать с данным антивирусным медикаментом для данного класса вирусов, следует определять эмпирически. Антивирусная синергия ФМК и n-докозанола не наблюдалась для ВПГ или вируса коровьей оспы, показывая, что этого не произойдет со всеми антивирусными соединениями. Тем не менее, возможны некоторые прогнозы, такие как антивирусная синергия n-докозанола с нуклеозидными аналогами, такими как AZT, при ингибировании репликации ВИЧ. Вирус гриппа и респираторный синцитиальный вирус также являются вероятными кандидатами на синергический отклик для нуклеозидного аналога/n-докозанола.

Независимо от механизмов, лежащих в основе синергической антивирусной активности n-докозанола и АЦВ, существует несколько преимуществ стратегии комбинированной терапии при помощи нуклеозидного или нуклеотидного аналога плюс n-докозанол. Во-первых, доказано последними успехами в лечении ВИЧ-инфекций и рака, что комбинированная терапия в целом является высокоэффективной. Общей характеристикой такой терапии является использование двух или более медикаментов, имеющих различные механизмы действия. Даже без синергической антивирусной активности комбинированная терапия возвратного заболевания ВПГ с помощью n-докозанола и АЦВ была бы предпочтительной за счет их непересекающихся механизмов действия. Тем не менее, n-докозанол проявляет синергическую антивирусную активность с нуклеозидными аналогами, вероятно, заставляя инфицированную вирусом клетку концентрировать повышенные уровни медикаментов. Поэтому вторым преимуществом конкурентного использования такого безопасного медикамента, как n-докозанол, является способность к выборочному адресному действию на популяцию клеток и увеличению эффективности нуклеозидных или нуклеотидных аналогов, укорачиванию времени излечения, уменьшению вероятности селекции стойких к медикаменту мутантов, и уменьшению воздействия на пациента потенциально токсичных и аллергенных нуклеозидных медикаментов.

Логичным применением комбинированной терапии из нуклеозидного аналога и n-докозанола было бы использование гомогенного крема, мази или суспензии из смеси медикаментов. Этот тип применения хорошо работал при исследованиях на животных (фиг.8) и может быть использован с АЦВ при лечении пациентов, страдающих возвратными ВПГ-заболеваниями. Такие связанные с вирусом герпеса заболевания, как опоясывающий лишай, ЦМВ-ретинит или саркома Капози, также могут лучше откликаться на нуклеозидную терапию в присутствии n-докозанола. Фактически любая больная ткань, которая может быть обработана кремом или суспензией n-докозанола, может являться целью для проводимой таким образом улучшенной нуклеозидной терапии, в том числе кожа, желудочно-кишечный тракт, дыхательная система и определенные органы половой системы. Продолжением этого применения было бы системное введение нуклеозидного или нуклеотидного аналога и местное лечение с помощью n-докозанола. Если предположить, что разработана одобренная системная формула n-докозанола, то комбинированная терапия с помощью n-докозанола и нуклеозидного или нуклеотидного аналога могла бы быть нацелена практически на любой орган тела.

Использование n-докозанола для концентрирования нуклеозидных аналогов в заболевшей ткани может не ограничиваться заболеваниями, вызванными вирусами. Остается определить, будет ли функционировать комбинированная n-докозанол/нуклеозидная терапия с нетронутыми раковыми клетками. Тем не менее, некоторое время назад возник интерес к использованию технологии генного переноса для лечения рака с помощью вирусно-закодированных генов и антивирусных нуклеозидных медикаментов; n-докозанол мог бы в конечном счете сыграть роль в этой стратегии. Разумеется, трансфицированные или меланомные клетки с геном тимидинкиназы ВПГ делают клетки чувствительными к токсическим воздействиям обычного ВПГ-селективного нуклеозидного медикамента ганцикловира (Oliver et al., Virol. 145:84-93, 1985). Возможно, что лечение раковых клеток кожи с помощью n-докозанола сделает отклик более интенсивным. Вирусные заболевания, которые тяжело излечиваются, могут также являться целью такого применения, поскольку подобный отклик наблюдался при использовании суицидной генной терапии и нуклеозидных аналогов на инфицированных вирусом Эпстайна-Барра человеческих В-лимфомных клеток (Franken et al., Nature Medicine 2:1379-1382, 1996) и на инфицированных вирусом ВИЧ-1 человеческих Т-клетках (Caruso et al., Virol. 206:495-503, 1995).

Раскрываемый способ для лечения вирусных инфекций содержит введение длинноцепочечного алифатического соединения в сочетании с нуклеозидным или нуклеотидным аналогом или ФМК. Предпочтительно активные ингредиенты вводятся совместно. В еще одном выполнении активные ингредиенты смешиваются и вводятся в фармацевтически приемлемом носителе. В используемой здесь терминологии введение алифатического соединения в сочетании с нуклеозидным аналогом или ФМК означает, что соединения могут вводиться одному пациенту в различное время и в соответствии с различными дозировками и режимами лечения, но при этом режимы лечения дают перекрывающиеся in vivo концентрации обоих соединений, тем самым упрощая полезные взаимодействия между двумя классами медикаментов. Совместное введение алифатического соединения и нуклеозидного аналога означает, что эти два активных ингредиента вводятся одновременно, хотя и не обязательно по одному и тому же маршруту.

Алифатическое соединение может вводиться от одного до пяти раз в день перорально, пермукозально, внутривенно или путем чрезмембранного проникновения. Аналогичным образом нуклеозидный аналог или ФМК может также вводиться от одного до пяти раз в день перорально, пермукозально, внутривенно или путем чрезмембранного проникновения. Предпочтительно, алифатическое соединение применяется местно на заболевшей ткани, а нуклеозидный аналог вводится системно. Дозировки активных алифатических соединений в соответствии с настоящим изобретением варьируются от 0,05% до приблизительно 40%. Наиболее предпочтительно алифатические соединения используются в концентрациях в диапазоне от приблизительно 1% до приблизительно 20%.

Синергическое взаимодействие n-докозанола и нуклеозидных аналогов может использоваться с помощью режима системного введения нуклеозидного аналога, сочетающейся с местным применением n-докозанола к заболевшей ткани. Например, пероральное введение ацикловира с дозировкой 500 мг, вводимой 5 раз в день, приводит к максимальной средней концентрации ацикловира в плазме приблизительно 0,7 мкг/мл (Tyring et al., Arch Dermatol. 134:185-191, 1998). Пероральное введение ацикловира дважды в день с дозировкой по приблизительно 1000 мг приводит к максимальной концентрации ацикловира в плазме приблизительно 4,3 мкг/мл. Вливание суспензии ацикловира с дозировкой 5 мг/кг путем вливаний 1 раз в час в течение 8 часов приводит к уравновешенной концентрации ацикловира в плазме приблизительно 10 мкг/мл (Blum et al., Am. J. Med. 73:186-192, 1982). Эти схемы дозировок в сочетании с одновременным введением n-докозанола от одного до пяти раз в день местно, перорально, через мочеполовой тракт (пермукозально), чрезмембранно или внутривенно, должны эффективно использовать полезные взаимодействия между этими двумя классами медикаментов.

Хотя настоящее изобретение было описано в контексте отдельных примеров и предпочтительных выполнений, следует понимать, что изобретение не ограничивается такими выполнениями. Напротив, объем настоящего изобретения должен определяться последующей формулой изобретения.

Изобретение относится к антивирусным составам, содержащим алифатический спирт С₂₁-С₂₈ в сочетании с нуклеозидным или нуклеотидным аналогом или фосфорно-муравьиной кислотой в фармацевтически приемлемом носителе. Предпочтительным алифатическим спиртом является n-докозанол. Концентрация алифатического спирта С₂₁-С₂₈ составляет от 0,05% до 40% по весу. Концентрация нуклеозидного или нуклеотидного аналога или фосфорно-муравьиной кислоты составляет от 0,1% до 10% по весу. Также раскрываются способы лечения вирусных инфекций с помощью таких составов. Алифатические спирты C₂₁-C₂₈ синергически интенсифицируют антивирусную активность нуклеозидных аналогов, направленную против репликации нескольких герпесных вирусов и вируса коровьей оспы. 5 н. и 23 з.п. ф-лы, 13 ил., 6 табл.

1. Антивирусный состав, содержащий алифатический спирт С₂₁-С₂₈ в концентрации в диапазоне 0,05-40% по весу и нуклеозидный или нуклеотидный аналог в концентрации в диапазоне 0,1-10% по весу в фармацевтически приемлемом носителе.2. Антивирусный состав по п.1, в котором алифатический спирт С₂₁-С₂₈ выбирается из группы, состоящей из первичных спиртов, эруцилового спирта, брассидилового спирта, n -докозанола и их смеси.3. Антивирусный состав по п.1, в котором нуклеозидный аналог или нуклеотидный аналог выбирается из группы, состоящей из ацикловира, адефовира, азидотимидина, бривудина, цидофовира, ddC, ddl, фамцикловира, ганцикловира, идоксуридина, ламивудина, лобукавира, пенцикловира, рибавирина, соривудина, трифлуридина, валацикловира и Аrа А.4. Антивирусный состав по п.1, дополнительно содержащий фосфорно-муравьиную кислоту в концентрациях в диапазоне 0,1-10%.5. Антивирусный состав по п.1, дополнительно содержащий неионное поверхностно-активное вещество.6. Антивирусный состав по п.5, в котором неионное поверхностно-активное вещество представляет собой дифункциональный блок-полимер, являющийся полиоксиалкиленовым производным пропиленгликоля, имеющим молекулярный вес 1000-25000.7. Антивирусный состав по п.5, в котором неионное поверхностно-активное вещество представляет собой блок-сополимер оксида этилена и оксида пропилена, имеющий молекулярный вес между 6000 и 12000.8. Антивирусный состав по п.5, в котором неионное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из октоксинола-9 и октоксинола-10.9. Антивирусный состав по п.5, дополнительно содержащий вещество, улучшающее проникновение.10. Антивирусный состав по п.1, дополнительно содержащий агенты, выбранные из группы, состоящей из антимикробных агентов, других антивирусных агентов, антигрибковых агентов, антиокислителей, буферных агентов, солнцезащитных веществ, космических агентов, ароматических веществ, смазывающих веществ, увлажнителей, осушителей и загустителей.11. Антивирусный состав по любому из пп.1-10 для использования при лечении вирусной инфекции, в котором алифатический спирт С₂₁-С₂₈ вводится в сочетании с нуклеозидным аналогом или нуклеотидным аналогом.12. Антивирусный состав по п.11, в котором алифатический спирт С₂₁-С₂₈ и нуклеозидный или нуклеотидный аналог независимо адаптированы для введения от одного до пяти раз в день по маршруту, выбираемому из группы, состоящей из местного, перорального, пермукозального, внутривенного и чрезмембранного проникновения.13. Антивирусный состав, содержащий n-докозанол в концентрации в диапазоне 0,05-40% по весу и нуклеозидный или нуклеотидный аналог в концентрации в диапазоне 0,1-10% по весу в фармацевтически приемлемом носителе.14. Антивирусный состав по п.13, в котором нуклеозидный аналог или нуклеотидный аналог выбран из группы, состоящей из ацикловира, адефовира, азидотимидина, бривудина, цидофовира, ddC, ddI, фамцикловира, ганцикловира, идоксуридина, ламивудина, лобукавира, пенцикловира, рибавирина, соривудина, трифлуридина, валацикловира и Аrа А.15. Антивирусный состав, содержащий n-докозанол в концентрации в диапазоне 0,05-40% по весу и фосфорно-муравьиную кислоту в концентрации в диапазоне 0,1-10% по весу в фармацевтически приемлемом носителе.16. Антивирусный состав по п.13, в котором смесь содержит 5-20% (по весу) n-докозанола.17. Антивирусный состав по п.13, в котором смесь содержит 10-12% (по весу) n-докозанола.18. Антивирусный состав по п.13, дополнительно содержащий неионное поверхностно-активное вещество.19. Антивирусный состав по п.18, в котором неионное поверхностно-активное вещество представляет собой дифункциональный блок-полимер, являющийся полиоксиалкиленовым производным пропиленгликоля, имеющим молекулярный вес 1000-25000.20. Антивирусный состав по п.18, в котором неионное поверхностно-активное вещество представляет собой блок-сополимер оксида этилена и оксида пропилена, имеющий молекулярный вес между 6000 и 12000.21. Антивирусный состав по п.18, в котором неионное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из октоксинола-9 и октоксинола-10.22. Антивирусный состав по п.13, дополнительно содержащий вещество, улучшающее проникновение.23. Антивирусный состав по п.13, дополнительно содержащий агенты, выбираемые из группы, состоящей из антимикробных агентов, других антивирусных агентов, антигрибковых агентов, антиокислителей, буферных агентов, солнцезащитных веществ, космических агентов, ароматических веществ, смазывающих веществ, увлажнителей, осушителей и загустителей.24. Антивирусный состав по п.13, дополнительно содержащий стеарат на основе сахара.25. Способ лечения вирусной инфекции составом, приготовленным в соответствии с пп.13-24, в котором упомянутый в составе n-докозанол вводится в сочетании с нуклеозидным аналогом, или нуклеотидным аналогом, или фосфорно-муравьиной кислотой.26. Способ по п.25, в котором n-докозанол и нуклеозидный аналог, или нуклеотидный аналог, или фосфорно-муравьиная кислота независимо адаптированы для введения от одного до пяти раз в день по маршруту, выбираемому из группы, состоящей из местного, перорального, пермукозального, внутривенного и чрезмембранного проникновения.27. Способ по п.25, в котором упомянутая вирусная инфекция вызывается вирусом герпеса, цитомегаловирусом, вирусом Эпстайна-Барра, вирусом ветряной оспы, вирусом гриппа, лимфотрофным вирусом человека и вирусом иммунодефицита человека.28. Способ по п.25, в котором приготовленный состав для лечения вирусной инфекции, вводится в дозировке 0,01-10 г с частотой от одного до пяти раз в день, в течение от одного до четырнадцати дней, при этом упомянутый состав вводится по маршруту, выбираемому из группы, состоящей из местного, перорального, пермукозального, внутривенного и чрезмембранного проникновений.