СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/543 G01N33/531 

Изобретение предназначено для производства иммуносорбентов для микробиологического анализа и концентрирования микроорганизмов и других биополимеров в реакции антиген-антитело.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к иммунохимии, и касается получения магнитных или немагнитных иммуносорбентов для специфического концентрирования белковых полимеров в реакциях типа антиген-антитело и их дальнейшего твердофазного иммунохимического анализа иммуноферментным, иммунофлюоресцентным, хемилюминесцентным, радиоиммунными методами и их вариантами.

Известен способ получения магнитных иммуносорбентов на основе полиакриламидного геля, в структуру которого при совместной полимеризации включен магнитный порошок (В.Г.Пушкарь, В.И.Ефременко и др. SU 1228489 от 03.05.84 г. , И. П.Гонтарь, А.Б.Зборовский. SU 1582657 от 28.12.87 г., SU 1686933 от 08.09.87 г.).

Недостатком способа является сложность, многостадийность и длительность процесса его получения, использование дорогостоящих импортных, токсичных для человека реактивов, ухудшение экологического условия процесса, недостаточная специфическая емкость и чувствительность в иммуноанализах. Полученные препараты не сохраняют требуемые свойства при высушивании.

Известен также способ получения иммуносорбента на основе активированного аминопропилсилохрома с использованием глутарового альдегида (а. с. SU 1517545, G 01 N 33/53 от 15.12.93 г.).

Недостатком способа является низкая стабильность свойств полученных препаратов.

Известен способ получения иммуносорбентов, в том числе с магнитными свойствами, на основе алюмосиликата путем его модифицирования 0,3-0,4%-ным раствором полиглюкина и его последующим активированием вторичным алкилсульфатом натрия для последующего ковалентного связывания с лигандом белковой природы (Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И. и др. Патент RU 2138813, G 01 N от 27.09.99 г., приоритет от 20.11.97 г.) - взят за прототип данного изобретения.

Недостатком этого способа является необоснованно высокая неуправляемая дисперсность алюмосиликата и наличие относительно высокого уровня неспецифической сорбции получаемого препарата.

Целью изобретения является повышение качества иммуносорбента, повышение специфической активности и чувствительности метода, снижение неспецифической сорбции иммуносорбента, снижение стоимости исходных материалов, расширение ассортимента носителей для приготовления иммуносорбентов.

Поставленная цель достигается следующим.

1. Применением вермикулита в качестве основы иммуносорбента.

2. Использованием особого приема покрытия матрицы - насыщенным раствором серы в бензоле.

Вермикулит (вспученный песок) широко применяется в строительстве для повышения теплоизоляционных свойств различных конструкций. Это недорогой материал на основе природных соединений кремния. При необходимости его можно размельчить до требуемой степени дисперсности, что позволяет нормировать заданные характеристики иммуносорбента. Использование вермикулита в качестве иммуносорбента ранее не описано.

Вермикулит имеет высокую инертность по отношению к различным агрессивным воздействиям и стабильность свойств в широком диапазоне. Хорошо развитая поверхность и высокие адгезивные свойства позволяют создать на его базе иммуносорбенты с высокой специфической емкостью и стабильностью требуемых характеристик. Не вступает во взаимодействие с магнитными порошками, что позволяет смешивать их в любой пропорции, управляя величиной магнитного момента частиц иммуносорбента (т.е. получать иммуносорбент с любыми магнитными свойствами от максимальных до нулевых). Максимальным магнитным моментом обладают частицы иммуносорбента при соотношении вермикулит: магнитный порошок 1,5: 2. При увеличении доли магнитного порошка происходит снижение специфической сорбции, что влечет ухудшение качественных характеристик препарата, при снижении магнитный момент уменьшается. При соотношении 1,5:0,5 иммуносорбент еще сохраняет магнитные свойства, достаточные для подвижности иммуносорбента в магнитном поле. Если не требуется использовать магнитные свойства иммуносорбента, магнитный порошок не добавляется. Смесь не является пирогенной. Также полностью отсутствует взаимодействие вермикулита с белковыми и биологически активными веществами, что в конечном итоге не влияет на их нативность и иммунологическую активность в иммунохимических реакциях.

Сера известна с древних времен как минеральный сорбент с высокой поглощающей способностью. Однако ее использование в качестве модификатора поверхности твердофазных носителей в иммунохимии не описано, это связано видимо с ее плохой растворимостью в органических растворителях и других особенностях химических свойств. Однако сера незначительно растворяется в бензоле. Это свойство и было использовано в данном изобретении для создания тонкого слоя осажденной серы на поверхности вермикулита или смеси вермикулита и магнитного порошка. Сочетание высокоразветвленной, хорошо адгезирующей поверхности вермикулита и уникальных сорбционных свойств серы позволило создать матрицу с высокими иммунохимическими характеристиками. Получают иммуносорбент следующим образом.

Пример 1. Приготовление магнитного иммуносорбента.

Вермикулит размельчают до размеров частиц 5-50 мкм. Смешивают 1,5 г вермикулита и 2 г магнитного порошка, добавляют 10 мл насыщенного раствора коллоидной серы в бензоле. Выдерживают 60 мин и высушивают при температуре 20-25^oС под тягой без нагрева. Полученный сорбент суспендируют в 50 мл 3,5%-ного раствора декстрана Т-20 в течение 60 мин при температуре 20-25^oС, затем высушивают при температуре 100-110^oС в течение 30 мин. Препарат растирают в ступке или размалывают на мельнице и просеивают через сито с величиной ячеек 130 мкм.

Ковалентное связывание: К 200 мг полученного магнитного сорбента добавляют 8 мл 0,2 М раствора периодата натрия рН 7,2 и инкубируют на магнитной мешалке при температуре 20-25^oС в течение 1 ч. Реакцию останавливают добавлением 10 мл 0,64 М раствора этиленгликоля. Инкубируют препарат 1 ч при температуре 20-25^oС и промывают трижды 0,1 М раствором фосфатно солевого уфера при рН 7,2.

К 200 мг активированного магнитного сорбента добавляют 0,5 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией белка 3,5 мг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере при рН 9,5. Взвесь инкубируют в течение 60 мин при температуре 20-25^oС. Далее надосадочную жидкость удаляют, а осадок трижды прмывают в 0,9%-ном растворе хлорида натрия до "0" экстинкции на спектрофотометре.

Определение специфической емкости проводят методом хемилюминесцентного анализа (A rapid chemilumminescent enzyme-linked immunosorbent assay for cytomegalovirus IgG antibodies using instant photographi film / G. Nickeless, G. Thorpe, L. Kricka et al. // J.Virol. Meth. - 1985. - V.12. - 3-4. - p.319-321) в нашей модификации.

В опытные и контрольные пробирки вносят по 0,05 мл 10%-ной взвеси приготовленных чумных магнитных иммуносорбентов. В опытные пробирки вносят по 0,05 мл суспензии клеток исследуемого антигена чумы в соответствующих концентрациях: 10⁷, 10⁵, 10³, 10² м.т./мл. В контрольные пробирки - по 0,05 мл промывочного раствора. Инкубируют при 37^oС в течение 30 мин. Удаляют надосадок из пробирок и трижды отмывают промывочным раствором, используя для седиментации постоянный магнит. Во все пробирки вносят по 0,05 мл рабочего раствора коньюгата пероксидазы хрена со специфическими иммуноглобулинами, в который предварительно был добавлен бычий сывороточный альбумин из расчета 10 нг на 1 мл. Инкубируют 30 мин при температуре 37^oС в течение 30 мин. Удаляют надосадок из пробирок и отмывают промывочным раствором 5-6 раз. Во все пробирки вносят по 0,05 мл 1%-ного раствора люминола и по 0,05 мл перекиси водорода в разведении 1:1000. Измерение проводят на люминометре 1250 фирмы LKB, Швеция.

После статистической обработки результатов измерений и оценки критерия достоверности было установлено, что специфическая емкость сорбента составляет 10 у.е., а чувствительность метода - 10² м.к./мл чумного микроба (у.е. - условные единицы, соотношение между люминесценцией иммуносорбента с максимальным насыщением определяемой микробной взвеси и контролем).

Метод ковалентной пришивки можно использовать любой (например, описанный в прототипе).

Пример 2. К смеси, состоящей из 1,5 г размельченного вермикулита и 2 г магнитного порошка, добавляют 10 мл насыщенного раствора коллоидной серы в бензоле. Выдерживают 30 мин при температуре 20-25^oС и далее осуществляют способ по методике примера 1. Результаты измерений показали, что специфическая емкость иммуносорбента составляет 9 у. е. , а чувствительность - 10²-10³ м.к./мл чумного микроба.

Пример 3. К смеси, состоящей из 1,5 г размельченного вермикулита и 2 г магнитного порошка, добавляют 10 мл насыщенного раствора коллоидной серы в бензоле. Выдерживают 15 мин при температуре 20-25^oС. Далее осуществляют способ по методике примера 1. Результаты измерений показали, что специфическая емкость иммуносорбента составляет 7 у.е., а чувствительность - 10⁴ м. к./мл чумного микроба.

Из приведенных примеров 2, 3 видно значительное снижение качественных характеристик иммуносорбента при снижении времени инкубации в растворе коллоидной серы ниже заявляемых пределов (30 и 15 мин). Снижаются как емкость, так и чувствительность определений. Увеличение времени инкубации более 1 ч не изменяет характеристик иммуносорбента и поэтому является нецелесообразным. Оптимальное время инкубации - 60 мин.

Возможность практического применения изобретения для определений различных микроорганизмов, в том числе в сильно загрязненных объектах, иллюстрируются следующими примерами.

Пример 4. Способ получения иммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но использовали туляремийные иммуноглобулины в концентрации 3,5 мг/мл, а на этапе определения специфической емкости - клетки туляремийного микроба.

Результаты измерений показали, что специфическая емкость иммуносорбента составляет 11 у.е., а чувствительность - 10² м.к./мл туляремийного микроба.

Пример 5. Способ получения иммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но использовали сапные иммуноглобулины в концентрации 3,5 мг/мл, а на этапе определения специфической емкости - клетки сапного микроба. Результаты измерений показали, что специфическая емкость иммуносорбента составляет 9 у.е., а чувствительность - 10² м.к./мл сапного микроба.

Пример 6. Способ получения иммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но использовали мелиоидозные иммуноглобулины в концентрации 3,5 мг/мл, а на этапе определения специфической емкости - клетки мелиоидозного микроба.

Результаты измерений показали, что специфическая емкость иммуносорбента составляет 10 у.е., а чувствительность - 10³ м.к./мл мелиоидозного микроба.

Пример 7. Определение чумного микроба в загрязненных объектах внешней среды.

0,1 кг садовой плодородной почвы суспендируют в 1 л физиологического раствора NaCl (0,9%), инкубируют 1 ч при перемешивании, дают отстояться и отбирают надосадок, в который вносят чумной микроб из расчета 100 клеток на 1 мл суспензии.

Определение ведут методом, описанным в примере 1. Во флаконы с 0,5 мл анализируемой суспензии добавляют по 3 мг магнитных сорбентов согласно примера 1, инкубируют при 37^oС в течение 30 мин. Удаляют надосадок из флаконов и трижды отмывают промывочным раствором, используя для седиментации постоянный магнит. Во все флаконы вносят по 0,05 мл рабочего раствора коньюгата пероксидазы хрена со специфическими иммуноглобулинами, в который предварительно был добавлен бычий сывороточный альбумин из расчета 10 нг на 1 мл. Инкубируют 30 мин при температуре 37^oС в течение 30 мин. Удаляют надосадок и отмывают промывочным раствором 5-6 раз. Во все флаконы вносят по 0,05 мл 1%-ного раствора люминола и по 0,05 мл перекиси водорода в разведении 1: 1000. Измерение проводят на люминометре 1250 фирмы LKB, Швеция. После статистической обработки результатов измерений и оценки критерия достоверности было установлено, что чувствительность метода 10² м.к./мл чумного микроба не ухудшается. Микроб уверенно определяется даже в сильно загрязненной среде нестерильной суспензии садовой почвы.

Сравнение препаратов, полученных по методике прототипа с иммуносорбентами, полученными по методике примера 1 данного изобретения, проводили с бруцеллезными иммуноглобулинами, а специфическую емкость соответственно с бруцеллезным микробом.

Результаты измерений приведены в таблице.

Таким образом, из представленной таблицы следует, что предложенные иммуносорбенты имеют более низкую неспецифическую адсорбцию в 3-5 раз и более высокую иммунохимическую активность (более чем в 2 раза) по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к микробиологии. В качестве основы иммуносорбента используют вермикулит или смесь вермикулита с магнитным порошком в соотношении 1,5: 2. Модификацию проводят инкубацией основы с насыщенным раствором коллоидной серы в бензоле в течение 60 мин при температуре 20-25^oС, высушиванием под тягой без нагрева, суспендированием в 3%-ном растворе декстрана Т-20 в течение 60 мин при температуре 20-25^oС. Носитель высушивают при 100-110^oС в течение 30 мин. После его размельчения осуществляют просеивание через сито с размером ячеек 130 мкм. Затем проводят ковалентное связывание с ним лиганда белковой природы. Предлагаемый способ позволяет получить иммуносорбент, который имеет низкую неспецифическую адсорбцию и более высокую иммунохимическую активность. 1 табл.

Способ получения иммуносорбента, включающий модификацию основы с получением носителя, высушивание, размельчение и активацию носителя с последующим ковалентным связыванием с ним лиганда белковой природы, отличающийся тем, что в качестве основы применяют вермикулит или смесь вермикулита с магнитным порошком в соотношении 1,5:2, модификацию проводят инкубацией основы с насыщенным раствором коллоидной серы в бензоле в течение 60 мин при температуре 20-25^oС, высушиванием под тягой без нагрева, суспендированием в 3% растворе декстрана Т-20 в течение 60 мин при температуре 20-25^oС, полученный носитель высушивают при 100-110^oС в течение 30 мин, а после его размельчения дополнительно осуществляют просеивание через сито с размером ячеек 130 мкм.