СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА Российский патент 2009 года по МПК C12N11/14 G01N33/551 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, иммунохимии и может быть использовано для выявления специфической реакции антиген-антитело с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

Известен способ получения иммуносорбента с магнитными свойствами, по которому предварительно проводят обработку магнитного порошка для придания ему коррозийной стойкости и гидрофильности, затем проводят эмульсионную полимеризацию смеси сомономеров полиакриламида и катализатора с обработанным магнитным порошком. Подготовленный магносорбент активируют 5% глутаровым альдегидом в течение 18-20 ч и иммобилизуют специфичными иммуноглобулинами в течение 18-20 ч. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магноиммуносорбенты дополнительно обрабатывают раствором альбумина в течение 1-3 ч (Патент РФ № 2068703, A61К 39/385, C12N 11/00// C01N 33/53. Способ получения магноиммуносорбентов. Авторы: Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Хорошенький А.Г., Бинатова В.В., Климова И.М., Пушкарь В.Г. Опубл. 10.11.96; Бюл. № 31).

Недостатком способа являются длительность, многостадийность процесса его получения, использование дорогостоящих импортных токсичных реактивов, что ограничивает организацию промышленного производства и ухудшает экологические условия процесса.

Известен способ получения иммуносорбента на основе аэросила, который включает модифицирование носителя 0,2-0,4% раствором декстрана, окисление продукта перхлоратом натрия, ковалентную иммобилизацию иммуноглобулинов (Патент РФ № 2102134, В01J 20/10. Способ получения иммуносорбента. Авторы: Брыкалов А.В., Жарникова И.В. Опубл. 20.01.98 г., Бюл. № 2). Недостатком способа является низкий уровень чувствительности иммуноферментного анализа.

Известен способ получения магноиммуносорбента, который включает активацию носителя (смесь алюмосиликата с магнитным порошком) и ковалентное связывание с ним лиганда белковой природы, при этом модификацию носителя осуществляют 0,3-0,4% раствором полиглюкина, а после высушивания активируют его вторичным алкилсульфатом натрия (Патент РФ № 2138813, G01N 33/543, А61К 39/385 // G01N 33/531, 33/551, 33/569, C12N 11/14. Способ получения иммуносорбента (варианты). Авторы: Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев Е.Н., Бинатова В.В. Опубл. 27.09.99. Бюл. № 27).

Полученные по этому способу иммуносорбенты имеют недостаточную специфическую емкость и чувствительность в иммуноанализах.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения иммуносорбента (Патент РФ № 2253871, G01N 33/552, 33/553. Авторы: Грядских Д.А., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Брыкалов А.В. Опубл. 10.06.2005 г. Бюл. №16). Способ включает модифицирование аэросила 3-4% раствором хитозана в 3% растворе уксусной кислоты и активирование бензохиноном.

Недостатком способа является низкий уровень чувствительности иммуносорбента.

Цель изобретения - повышение специфической емкости, чувствительности иммуносорбента, обладающего магнитными свойствами.

Цель достигается тем, что для увеличения специфической емкости, чувствительности иммуносорбента проводят модифицирование алюмосиликатного носителя 1-1,5% раствором карбоксиметилированного лигнина и активируют карбодиимидом (N-циклогексил-N^I-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-метил-n-толуолсульфонатом).

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят активирование носителя органическим полимером карбоксиметилированным лигнином, содержащим карбоксильные группы. При последующем модифицировании сорбента карбодиимидом (N-циклогексил-N^I-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-метил-n-толуолсульфонатом) полученный продукт активирован функциональными группами, способными к взаимодействию с лигандами белковой природы (иммуноглобулинами).

Возможность практического осуществления предлагаемого способа с использованием полной совокупности заявляемых признаков иллюстрируется примерами.

Пример 1. К 1,5 г алюмосиликата добавляют 100 мл 0,5% раствора карбоксиметилированного лигнина и далее магнетит (Fe₃O₄) в количестве 1 г. Смесь выдерживают 1 час при температуре 24°С. Затем полученный продукт высушивают при 100-115°С в течение 30 минут. К сорбенту в последующем добавляют 9 мл ацетатного буфера pH 4,0, содержащего 40 мг карбодиимида (N-циклогексил-N^I-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-метил-n-толуолсульфонат), инкубируют смесь 1 час. Затем сорбент отмывают ацетатным буфером рН 4,0 и 50 мл дистилированной воды. К 0,2 г магносорбента приливают 1 мл иммуноглобулинов, выделенных из мышиной иммунной асцитической жидкости против вируса лихорадки Западного Нила (ЛЗН) с концентрацией по белку 10 мг/мл. Смесь оставляли при (37±1)°С в течение 12 часов, далее надосадочную жидкость удаляют, а носитель трижды промывают 0,85% раствором хлорида натрия до «0» экстинции на спектрофотометре. Длительность получения иммуносорбента составляет 3-4 часа.

Результаты определений специфической емкости иммуносорбента проводят иммуноферментным анализом (ИФА). К 50 мкл 10% взвеси иммуносорбента приливают 200 мкл антигена ЛЗН и инкубируют смесь 30 мин при (37±1)°С. Далее иммуносорбент отмывают 50 мл фосфатно-солевым буферным раствором с твином. Вносят 200 мкл рабочего разведения иммунопероксидазного коньюгата для выявления антигена ЛЗН и инкубируют при (37±1)°С в течение 15 мин, промывают, как описано выше. После чего вносят субстрат-индикаторный раствор. Как только появляется желтый цвет, реакцию останавливают 2М раствором серной кислоты. Учет результатов проводят на регистрирующем устройстве Мультискан при длине волны 492 нм. Параллельно с опытной пробой проводят аналогичную операцию с контрольным образцом (иммуносорбент без контакта с вирусом). Положительными считают пробы, если их оптическая плотность (ОП) в 2 и более раз превышает ОП отрицательного контроля. Измеренная таким образом чувствительность ИФА с использованием иммуносорбента составляет 50 нг/мл (по водорастворимому антигену).

Пример 2. Способ получения магноиммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования алюмосиликатного носителя используют 1% раствор карбоксиметилированного лигнина. Чувствительность метода ИФА с использованием иммуносорбента составляет по водорастворимому антигену 25 нг/мл.

Пример 3. Способ получения магносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования алюмосиликатного носителя используют 1,5% раствор карбоксиметилированного лигнина. Чувствительность метода ИФА с использованием иммуносорбента составляет по водорастворимому антигену 25 нг/мл.

Пример 4. Способ получения магноиммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования алюмосиликатного носителя используют 2% раствор карбоксиметилированного лигнина. Чувствительность метода ИФА с использованием иммуносорбента составляет по водорастворимому антигену 25 нг/мл.

Пример 5. Способ получения магноиммуносорбента осуществляют по методике примера 2, но на последнем этапе синтеза к 0,2 г активированного носителя приливают 1 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 10 мг/мл. Чувствительность метода ИФА с использованием иммуносорбента составляет по корпускулярному антигену 10¹ м.т./мл чумного микроба, а по водорастворимому антигену 25 нг/мл.

Пример 6. Способ получения магноиммуносорбента осуществляют по методике примера 2, но на последнем этапе синтеза к 0,2 г активированного носителя приливают 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 10 мг/мл. Чувствительность метода ИФА с использованием иммуносорбента составляет по корпускулярному антигену 10¹ м.т./мл туляремийного микроба, а по водорастворимому антигену 25 нг/мл.

В отличие от прототипа способ получения иммуносорбента повышает чувствительность ИФА по корпускулярному антигену на порядок, а по водорастворимому антигену в 4 раза. Сопоставление предлагаемого способа и прототипа представлено в таблице 1.

Как показали экспериментальные испытания, для модифицирования алюмосиликатного носителя оптимален раствор карбоксиметилированного лигнина с концентрацией 1-1,5%. При увеличении концентрации модификатора до 2% не наблюдается увеличения уровня чувствительности иммуносорбента, тогда как уменьшение концентрации модификатора до 0,5% снижает чувствительность метода.

Преимущества и положительный эффект предлагаемого способа получения иммуносорбента объясняется тем, что в процессе синтеза органоалюмосиликатного сорбента осуществляется активирование его поверхности карбоксиместилированным лигнином. При последующем взаимодействии поверхности сорбента с карбодиимидом (N-циклогексил-N^I-(2-морфоли-ноэтил)-карбодиимид-метил-n-толуолсульфонатом) протекает ковалентная иммобилизация с лигандами белковой природы (иммуноглобулинами).

Таким образом, магноиммуносорбенты, полученные по предлагаемому способу, обеспечивают повышение уровня чувствительности ИФА. Кроме того, предлагаемый способ отличается простотой технологии получения, исключающей дорогостоящие химические реагенты. Наличие магнитосоставляющего компонента в магносорбенте повышает его эффективность использования для концентрирования и идентификации патогенов.

Таблица 1. Способ получения иммуносорбента Способ получения иммуносорбента Модификатор - раствор карбоксиметилированного лигнина, % Чувствительность по водорастворимому антигену, нг/мл по корпускулярному антигену, м.т./мл Известный способ
(лиганд-иммуноглобулины чумные) - 100 10³-10² Предлагаемый способ
(лиганд-иммуноглобулины ЛЗН) 0,5 50 - 1 25 - 1,5 25 - 2 25 - (лиганд-иммуноглобулины чумные) 1 25 10¹

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает ковалентное связывание лиганда белковой природы с модифицированным носителем. В качестве носителя используют алюмосиликат, содержащий магнетит. Носитель модифицируют 1-1,5% раствором карбоксиметилированного лигнина. Последующее активирование сорбента осуществляют карбодиимидом (N-циклогексил-N¹-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-метил-n-толуолсульфонатом). Способ позволяет получить магноиммуносорбенты с повышенной специфической емкостью. Чувствительность метода ИФА с использованием магноиммуносорбента составляет по корпускулярному антигену 10¹ м.т./мл, по водорастворимому антигену 25-50 нг/мл. 1 табл.

Способ получения иммуносорбента с магнитными свойствами, предусматривающий ковалентное связывание лиганда белковой природы (иммуноглобулинов) с модифицированным носителем, отличающийся тем, что в качестве носителя используют алюмосиликат, модифицированный 1-1,5%-ным раствором карбоксиметилированного лигнина, активированный карбодиимидом (N-циклогексил-N^I-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-метил-n-толуол-сульфонатом) и содержащий магнетит.