СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ МИКСОМАТОЗА КРОЛИКОВ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/285 C12N7/00 A61P31/12 

Описание патента на изобретение RU2255764C2

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления живой культуральной вакцины против миксоматоза кроликов, и может быть использовано на предприятиях биологической промышленности.

Для профилактики миксоматоза кроликов в России и за рубежом широкое распространение получили живые вакцины из аттенуированных штаммов вируса миксомы. Для их изготовления вируссодержащий материал получают на первичных или перевиваемых культурах клеток.

За рубежом для профилактики миксоматоза кроликов используют вакцинные препараты, изготовленные на основе применения адаптированных к росту в первичных и перевиваемых культурах клеток вакцинных штаммов вируса миксомы (Knezevic N. Adaptacija i imnozavanje virusa miksomatoze na kulturi thiva // Vet. geasnik. - 1986. - №40 - s. 801-807; Cupera Z., Krupka V., Giran E. Aplikace vacciny proti Myxomatose zive MXT prupichen us niho boltce specialni drojjehlon // Vet. Med. - 1982. - №27. - s.617-625).

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сухой культуральной вакцины, содержащей аттенуированный штамм “В-82” вируса миксомы кроликов, выращенный в первичной культуре клеток почки крольчонка (ПК) и фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) (В.В.Гуненков с соавт., патент RU №1169221 от 10.10.95).

Основной недостаток ближайшего аналога состоит в том, что использование первично-трипсинизированных культур для производства вакцин требует высоких материальных затрат, а технологический процесс является трудоемким, поскольку предполагает использование в качестве исходного сырья ткани куриных эмбрионов или крольчат. Первичные культуры клеток, в том числе ПК и ФЭК, не стандартизированы по своим свойствам и зависят от индивидуальных особенностей используемых животных и эмбрионов.

Вторым недостатком известного способа является необходимость использования для определения инфекционной активности посевного и вируссодержащего для изготовления вакцины материала кроликов или первичной культуры клеток ПК.

Целью данного изобретения является стандартизация способа изготовления вакцины против миксоматоза кроликов на основе штамма “В-82”, выращенного на перевиваемой линии клеток; удешевление, упрощение технологического процесса.

Поставленная цель достигается способом изготовления вакцины против миксоматоза кроликов, включающим выращивание вируса в культуре клеток, сбор вируссодержащего материала, определение его инфекционной активности, смешивание его с защитной средой и лиофилизацию, при этом вируссодержащий материал вакцинного штамма “В-82” вируса миксомы получают в перевиваемой культуре клеток RK-13 при 33°С в течение 48-72 часов в бессывороточной среде с рН 7.2-7.4, определяют его инфекционную активность в той же клеточной системе и смешивают с защитной средой в объемном соотношении 85:15.

Сущностью изобретения и его отличительным признаком является адаптация и культивирование аттенуированного штамма “В-82” вируса миксомы в перевиваемой линии клеток почки кролика (RK-13), а не в первично-трипсинизированных культурах клеток.

Другим отличительным признаком изобретения является определение инфекционной активности вируса титрованием в перевиваемой культуре клеток RK-13, а не на кроликах или первичных культурах клеток. В результате исключено использование кроликов, на которых ранее определяли инфекционную активность, а также повышается достоверность результатов.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Клетки RK-13 культивируют в матрацах емкостью 1.5 дм3 в 0.15 дм3 поддерживающей среды (0.1%-ный гидролизат лактальбумина на солевом растворе Хенкса с содержанием пенициллина - 100 ЕД/см3, стрептомицина - 100 мкг/см3) с 5%-ной фетальной сыворотки при 33°С в течение 36-48 часов.

Затем в асептических условиях из матрасов удаляют культуральную жидкость и в монослой RK-13 вносят 3-6 см3 посевного материала. В качестве посевного материала используют матриксный штамм “В-82” с активностью не ниже 6.5 lg ИД50/см3, полученный 2-3-кратным пассированием тканевого вируса штамма “В-82” в монослое культуры клеток ПК или ФЭК.

Адсорбцию вируса проводят при температуре 33°С в течение 1.5 часов, после чего добавляют 0.15 дм3 поддерживающей среды с рН 7.2 и инкубируют зараженную культуру при температуре 33°С в течение 48-72 часов до полного развития цитопатогенного действия вируса. Вируссодержащий материал сливают и замораживают при минус 40-70°С.

По завершении процесса проводят контроль производственной партии вируссодержащего материала на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами и инфекционную активность вируса на кроликах или в культуре клеток RK-13. Инфекционная активность вируса составляла 6.5±0.5 Ig ИД50/см3 при внутрикожном титровании на кроликах и 7.0=1=0.5 lg ТЦД50/см3 при титровании в культуре клеток RK-13.

Вируссодержащий материал после оттаивания отделяют от клеточного субстрата методом сепарирования при 3000xg при 4-8°С. Полученную производственную партию вируссодержащего материала вакцинного вируса миксомы с активностью 7.0=1=0.5 lg ТЦЦ50/см3 смешивают с защитной средой в объемном соотношении 85:15 соответственно, после чего фасуют в ампулы и лиофилизируют.

Лиофилизацию осуществляют при температуре от минус 50°С до 0°С в течение 24-32 часов, затем от 0°С до 21°С в течение 8 ч при вакууме 85 микрон и досушивают в течение 4 часов.

Готовый вакцинный препарат оценивают на безвредность, реактогенность и иммуногенность.

При определении безвредности полученные образцы вакцины вводят по 1000 ТЦД50/см3 кроликам в объеме по 3.0 см3 внутримышечно и внутрикожно в 8 точек по 0.25 см3. Срок наблюдения - 28 суток. На 3-и сутки наблюдений на местах внутрикожного введения вакцины появились локальные поражения кожи - миксомы диаметром 1-1.5 см и меньше, которые постепенно регрессировали на 14-е сутки. На месте внутримышечного введения миксомы отсутствуют. Данный опыт показывает, что вакцина является безвредной для кроликов.

Реактогенность вакцинных препаратов оценивают на пяти кроликах по клиническим признакам (угнетение, снижение аппетита, ринит, конъюнктивит, местная реакция - образование узелков на ушах, веках), появляющимся после внутримышечного или внутрикожного введения кроликам прививной дозы вируса 1000 ТЦД50/см3. Вакцина не обладает выраженными реактогенными свойствами: после внутримышечного введения она не вызывает общего генерализованного заболевания и местной реакции, а после внутрикожного введения вызывает образование обычных локальных миксом.

Контроль иммуногенности вакцины проводят, вакцинируя кроликов полученными образцами в дозе 1000 ТЦД50/см3 на голову с последующим, на 9 сутки после прививки, контрольным заражением вирулентным вирусом миксоматоза штамма “МР” в дозе 1000 ИД50 на голову или титрованием вакцинного штамма “В-82”, выращенного на ФЭК, имеющего инфекционную активность на кроликах не ниже 5.1 lg ИД50/см3. Результаты контроля иммуногенности показали, что все иммунизированные кролики выжили, в то время как контрольные - пали на 10-14 сутки, а при определении на иммунизированных кроликах инфекционной активности штамма “В-82” снижение его активности превышало 3.0 lg ИД50/см3.

Пример 2.

Для получения производственной серии вакцины клетки RK-13 культивируют в матрацах емкостью 1.5 дм3 в 0.15 дм3 поддерживающей среды (0.1%-ный гидролизат лактальбумина на солевом растворе Эрла, гентамицин - 20 ЕД/см3) с 5% сыворотки крови КРС при 33°С в течение 36-48 часов.

Затем в асептических условиях из матрасов удаляют культуральную жидкость и в монослой RK-13 вносят 3-6 см3 посевного материала. В качестве посевного материала используют штамм “В-82” с активностью не ниже 7.0±0.5 lg ТЦД50/см3, полученный в результате 1-10-кратного пассирования вируса штамма “В-82” в монослое культуры клеток RK-13.

Адсорбцию вируса проводят при температуре 33°С в течение 3.0 часов. Затем добавляют 0.15 дм3 поддерживающей среды с рН 7.4 и инкубируют зараженную культуру при температуре 33°С в течение 48-72 часов до полного развития цитопатогенного действия вируса. Вируссодержащий материал сливают и замораживают при минус 40-70°С.

Вируссодержащий материал после оттаивания отделяют от клеточного субстрата методом сепарирования при 3000xg при 4-8°С. Полученную производственную партию вируссодержащего материала вируса миксомы с активностью 7.0±0.5 lg ТЦД50/см3 смешивают с защитной средой в объемном соотношении 85:15 соответственно, после чего фасуют в ампулы и лиофилизируют.

Лиофилизацию осуществляют при температуре от минус 50°С до 0°С в течение 24-32 часов, затем от 0°С до 21°С в течение 8 ч при вакууме 85 микрон и досушивают в течение 4 часов.

Оценка безвредности, реактогенности и иммуногенности проводится аналогично примеру 1.

Изготовленная по предложенному способу вакцина против миксоматоза кроликов сохраняет свои иммунобиологические свойства при температуре 4-8°С не менее 12 месяцев, не зависит от наличия или отсутствия вакуума в ампулах и позволяет обеспечить защиту животных после однократной прививки. Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Похожие патенты RU2255764C2

название год авторы номер документа
ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ МИКСОМАТОЗА КРОЛИКОВ И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ 1983
  • Гуненков В.В.
  • Чистова З.Я.
  • Кузнецова Г.Д.
  • Ночевный В.Т.
  • Сафонов Г.А.
  • Калинина Т.А.
  • Карпов В.М.
RU1169221C
СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СПОСОБЕ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГЕНОМА ВАКЦИННОГО ШТАММА В-82 ОТ ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА МИКСОМЫ КРОЛИКОВ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2013
  • Синдрякова Ирина Петровна
  • Цыбанов Содном Жамьянович
  • Колбасов Денис Владимирович
RU2549705C1
АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ МИКС-98 ВИРУСА МИКСОМЫ КРОЛИКОВ (СЕМЕЙСТВО POXVIRIDAE, РОД LEPORIPOXVIRUS, MYXOMA VIRUS OF RABBITS) 2001
  • Власова Н.Н.
  • Моргунов Ю.П.
  • Цыбанов С.Ж.
  • Колосова М.В.
  • Кадетов В.В.
  • Жестерев В.И.
RU2192465C1
Ассоциированная вакцина против миксоматоза, пастереллёза и вирусной геморрагической болезни кроликов 1 и 2 типов 2020
  • Мороз Наталья Владимировна
  • Малахова Людмила Васильевна
  • Куникова Екатерина Дмитриевна
  • Лозовой Дмитрий Анатольевич
  • Яшин Роман Владимирович
  • Долгов Дмитрий Львович
  • Ручнова Ольга Ивановна
RU2741643C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВИРУС-ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЧУМЫ МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ 2007
  • Калантаенко Юрий Федорович
  • Балышев Владимир Михайлович
  • Курченко Федор Петрович
  • Жестерев Виктор Иванович
  • Луницин Андрей Владимирович
  • Горшкова Татьяна Федоровна
  • Михалкин Илья Петрович
RU2325185C1
АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ОСПЫ КОЗ 2006
  • Балышев Владимир Михайлович
  • Болгова Марина Васильевна
  • Грачев Дмитрий Викторович
  • Жуков Анатолий Николаевич
  • Сатторов Изатулло Турсунович
RU2325437C1
ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ПАРАГРИППА-3, ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ 2012
  • Мищенко Владимир Александрович
  • Кононова Светлана Владимировна
  • Кононов Александр Владимирович
  • Думова Виктория Валентиновна
  • Корпусова Татьяна Ивановна
RU2504400C1
ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ, РОТАВИРУСНОЙ И КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ 2012
  • Мищенко Владимир Александрович
  • Кононова Светлана Владимировна
  • Кононов Александр Владимирович
  • Думова Виктория Валентиновна
  • Корпусова Татьяна Ивановна
RU2515058C1
Штамм "Рич" вируса коронавирусного энтерита собак для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики коронавирусного энтерита собак 2022
  • Галкина Татьяна Сергеевна
  • Комарова Анна Александровна
  • Доронин Максим Игоревич
RU2796988C1
ВАКЦИНА "БИОВАК" ПРОТИВ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ, ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА, ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА, АДЕНОВИРОЗА И ЛЕПТОСПИРОЗА СОБАК 1998
  • Сулимов А.А.
  • Колышкин В.М.
  • Уласов В.И.
  • Бирюкова Т.А.
RU2150296C1

Реферат патента 2005 года СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ МИКСОМАТОЗА КРОЛИКОВ

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Целью данного изобретения является стандартизация способа изготовления вакцины против миксоматоза кроликов на основе штамма "В-82", выращенного на перевиваемой линии клеток; удешевление, упрощение технологического процесса. Используют вируссодержащий материал штамма "В-82" вируса миксомы кроликов, полученный на перевиваемой линии клеток RK-13 в питательной среде без добавления сыворотки в стационарных условиях в течение 48-72 часов при температуре 33°С и значении рН 7.2-7.4, смешивают его с защитной средой в объемном соотношении 85:15 и лиофилизируют. Способ позволяет упростить изготовление вакцины.

Формула изобретения RU 2 255 764 C2

Способ изготовления вакцины против миксоматоза кроликов, включающий выращивание вакцинного штамма "В-82" вируса миксомы в культуре клеток, сбор вируссодержащего материала, определение его инфекционной активности, смешивание его с защитной средой и лиофилизацию, отличающийся тем, что вакцинный штамм "В-82" вируса миксомы выращивают в перевиваемой культуре клеток RK-13 при 33°С в течение 48-72 ч в бессывороточной среде с рН 7.2-74, определяют инфекционную активность в той же клеточной системе и смешивают с защитной средой в объемном соотношении 85:15.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2005 года RU2255764C2

ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ МИКСОМАТОЗА КРОЛИКОВ И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ 1983
  • Гуненков В.В.
  • Чистова З.Я.
  • Кузнецова Г.Д.
  • Ночевный В.Т.
  • Сафонов Г.А.
  • Калинина Т.А.
  • Карпов В.М.
RU1169221C
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 2008
  • Круковская Лариса Леонидовна
  • Полев Дмитрий Евгеньевич
  • Носова Юлия Константиновна
  • Баранова Анна Вячеславовна
  • Козлов Андрей Петрович
RU2384845C1

RU 2 255 764 C2

Авторы

Середа А.Д.

Колосова М.В.

Жестерев В.И.

Луницин А.В.

Юрков С.Г.

Наташкина М.Ю.

Репин В.И.

Малоголовкина Н.В.

Бобровская Н.К.

Даты

2005-07-10Публикация

2003-03-13Подача