АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ МИКС-98 ВИРУСА МИКСОМЫ КРОЛИКОВ (СЕМЕЙСТВО POXVIRIDAE, РОД LEPORIPOXVIRUS, MYXOMA VIRUS OF RABBITS) Российский патент 2002 года по МПК C12N7/00 A61K39/275 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса миксомы кроликов, и может быть использовано для изготовления вакцины против миксоматоза в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности.

В настоящее время в различных регионах России зарегистрировано большое количество вспышек миксоматоза, которые различаются как по продолжительности циркуляции вируса на поголовье животных, так и по тяжести течения болезни. Выделенные вирулентные изоляты вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых животных.

Для профилактики миксоматоза кроликов в России и за рубежом широкое распространение получили живые вакцины из аттенуированных штаммов вируса миксомы (Саулите Э. Г., Камель И.А., Осе В.П., Виянис А.Э. Изучение вируса миксомы кроликов и перспективы профилактики миксоматоза. // Труды ЛСХА, 1984, вып. 177, - с. 88, 89).

За рубежом для профилактики миксоматоза кроликов используют вакцинные препараты, изготовленные на основе высокотехнологичных, адаптированных к росту в перевиваемых культурах клеток вакцинных штаммов вируса миксомы, таких как штамм SG 33 или вакцина Меварекс (Чехия, фирма "Мевак").

В России для специфической профилактики миксоматоза применяют вакцинный штамм В-82 вируса миксомы кроликов производства ВГНКИ (Гуненков В.В., Кузнецова Г. Д., Смыченко Е.Л., Чистова З.Я. О диагностике и профилактике миксоматоза кроликов. // Ветеринария. 1987, 12, - с. 44, 45). Штамм аттенуирован длительным пассированием в первично трипсинизированных культурах клеток с использованием перемежающихся пассажей на ФЭК (фибробластах эмбрионов кур) и ПК (клетках почки крольчонка). На основе данного штамма была разработана живая вакцина (Тетемадзе И.И., Гуненков В.В. Культивирование вакцинного вируса миксомы кроликов в культуре клеток. // Разработка методов проверки биологических свойств производственных штаммов микроорганизмов и диагностических препаратов. Сб. науч. трудов ВГНКИ. Москва, 1983, - с. 103, 104).

Аттенуированный штамм В-82 вируса миксомы кроликов, полученный во ВГНКИ, имеет следующие характеристики: накапливается в первично трипсинизированных культурах клеток ФЭК и ПК в титре 6,0-6,5 lg при температуре 33^oС. Сроки накопления варьируют в зависимости от дозы заражения от 3-4 до 6-8 суток (Кузнецова Г. Д. Сухая культуральная вирусвакцина против миксоматоза кроликов из аттенуированного штамма "В-82". /Автореф. дис./ Москва, 1988, - 17 с.).

Использование первично трипсинизированных культур для производства вакцин дорого и трудоемко, кроме того, велика вероятность контаминации вакцинного сырья посторонними микроорганизмами.

Первичные культуры клеток, в том числе и первичная культура клеток почки крольчонка, не стандартны по своим свойствам и зависят от индивидуальных характеристик используемых эмбрионов и животных.

Целью изобретения является получение нового, адаптированного к росту в перевиваемых культурах клеток, генетически маркированного, стабильного, аттенуированного штамма вируса миксомы, пригодного для изготовления вакцины против миксоматоза кроликов и использования в качестве эукариотического вектора.

Новый, адаптированный к росту в перевиваемых культурах клеток, вакцинный штамм вируса миксомы кроликов получен путем селекции по скорости адсорбции на клетках перевиваемой культуры CV-1 с последующим трехкратным клонированием в присутствии НАТ-среды (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин) и дальнейшим пассированием в этой культуре клеток.

Использование для селекции НАТ-среды позволило отобрать популяцию вируса, имеющего активный ген тимидинкиназы (ТК⁺ признак), а трехкратное клонирование обеспечило генетическую однородность данного штамма.

Наличие генетического ТК⁺ маркера позволяет использовать данный штамм в качестве эукариотического вектора для получения рекомбинантных вакцин и альтернативных источников антигенов.

Данный штамм отличается от вирулентных штаммов и исходного вакцинного штамма вируса миксомы отсутствием в рестрикционной карте генома фрагментов размером 16,3 и 6,35 т.п.о., что выявляется при использовании рестриктазы Hind III для расщепления ДНК (таблица 1). Стабильность данного признака сохранялась с 10 по 30 пассаж (срок наблюдения).

Штамм Микс-98 вируса миксомы кроликов размножается в культурах клеток CV-1, ПС и ПЭАК, в которых накапливается в титре 7,0-7,5 lg .

С помощью электронно-микроскопических исследований в вируссодержащем материале обнаруживают вирусные частицы размером 230-280 нм, которые морфологически тождественны представителям рода Leporipoxvirus.

Контроль иммуногенности и иммунологического соответствия аттенуированного штамма Микс-98 проводили на кроликах 6-месячного возраста массой около 2 кг, иммунизируя их полученным штаммом в дозе 2,0-4,0 lg ТЦД₅₀ на голову, с последующим контрольным заражением вирулентным штаммом МР вируса миксомы в дозе 4,0 lg HI₅₀ на голову или титрованием вакцинного штамма В-82 на иммунизированных кроликах. Результаты представлены в таблице 2.

Эти результаты подтверждают иммуногенность аттенуированного штамма Микс-98 и его принадлежность к вирусу миксомы кроликов, так как все иммунизированные кролики выжили, в то время как контрольные пали на 10-14 сутки, а при титровании на иммунизированных кроликах штамма В-82 снижение его титра составило 4,0 lg .

Исследования показали, что полученный штамм характеризуется высокой репродуцируктивной способностью в культуре клеток CV-1 с проявлением характерного ЦПД и накоплением вируса в титре до 7,0-7,5 lg , безвредностью, ареактогенностью, высокой иммуногенной активностью, отсутствием контаминации другими микроорганизмами.

Иммунобиологические свойства штамма Микс-98 проверены в комиссионных испытаниях при депонировании штамма во ВНИИВВиМ.

Новый штамм депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ВНИИВВиМ за инв. 2229 от 29 декабря 2000 г.

Аттенуированный штамм Микс-98 характеризуется следующими признаками.

Происхождение. Новый адаптированный к перевиваемой культуре клеток CV-1 вакцинный штамм вируса миксомы кроликов получен из вакцинного штамма В-82 путем селекции по скорости адсорбции на клетках перевиваемой культуры CV-1 с последующим трехкратным клонированием в присутствии HAT-среды и дальнейшим пассированием на культуре этих клеток.

Таксономия. При электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают вирусные частицы размером 230-280 нм, морфологически тождественные представителям рода Leporipoxvirus.

Маркерные характеристики. Штамм Микс-98 вируса миксомы кроликов размножается в перевиваемых культурах клеток CV, ПС и ПЭАК с выраженным ЦПД, проявляющемся в характерном округлении и стягивании клеток к центрам поражения в виде "паучков" с последующей деструкцией клеточного монослоя. Титр вируса в указанных культурах клеток достигает 7,0-7,5 lg
Стандартные условия выращивания. Штамм культивируют в монослое перевиваемых клеток в стационарных культурах. При оптимальных условиях максимальное накопление вируса достигается через 96 часов культивирования. В качестве поддерживающей среды используют среду ИГЛА с 5% сыворотки КРС.

Особенности репродукции. Данный штамм отличается от аттенуированных штаммов вируса миксомы способностью размножаться при 37^oС в перевиваемых культурах клеток без повышения реактогенности и потери иммуногенности, высокими титрами накопления, а также тем, что не требует затрат средств и времени на адсорбцию и смену среды.

Генетические свойства. Рестрикционная картина отличается от исходной штамма В-82 отсутствием фрагментов рестрикции Hind III размером 16,3 и 6,35 т.п.о. и имеет активный ген тимидинкиназы (ТК⁺ признак).

Иммуногенные свойства. Индуцирует у кроликов формирование иммунитета против миксоматоза на 7-10 сутки.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков. Данные признаки сохранялись, начиная с 10 по 30 пассаж (срок наблюдения).

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Штамм Микс-98 обладает высокой репродуктивной способностью в культуре клеток CV-1, безвредностью, аректогенностью, высокой иммуногенной активностью. Штамм генетически стабилен, неконтагеозен, нереверсибелен. Штамм используется для изготовления вакцины против миксоматоза кроликов или в качестве эукариотического вектора. 2 табл.

Аттенуированный штамм Мухоma virus кроликов, депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ВНИИВВиМ 2229, для использования в качестве эукариотического вектора и изготовления вакцины.