СПОСОБ СНИЖЕНИЯ МАССЫ ТЕЛА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2005 года по МПК A61K38/06 A61K38/39 A61P3/04 

Изобретение относится к фармакологии, биохимии и может быть использовано для подавления аппетита, уменьшения количества потребляемой пищи и снижения массы тела у животных и основано на применении простейших пролинсодержащих пептидов, являющихся дериватами хорошо известных эндогенных пептидов и пищевых белков.

В настоящее время избыточный вес и ожирение - один из основных факторов, способствующих появлению сердечно-сосудистых заболеваний у взрослого населения. Многочисленные исследования, проведенные и опубликованные за последнее время, показали, что помимо всего прочего, риск смертности при сердечно-сосудистых заболеваниях и других патологиях возрастает прямо пропорционально увеличению веса (показатель BMI). Лечение от избытка веса требует значительных затрат и зачастую приводит к потере трудоспособности. Поэтому чрезвычайно важно с точки зрения здоровья, нормального самочувствия, эстетической привлекательности попытаться исправить и убрать избыточный вес. Было показано, что уменьшение веса на 15% может вызвать положительные изменения состояния здоровья.

Стратегия по приведению организма к нормальным или приемлемым весовым показателям должна предусматривать уменьшение калорий и увеличение физической нагрузки, однако осуществить это на практике достаточно сложно без использования дополнительной, медикаментозной или иной помощи.

Известен способ коррекции веса человека путем психотерапевтической установки на снижение аппетита с использованием одновременно лечебно-диетического питания и повышенным контролем за приемом пищи. Указанное лечение рекомендуется проводить только в условиях стационара, что не всегда приемлемо для индивидуума (заявка РФ №99114939, А 61 М 21/00, 1999.07.07, опубл. 2001.05.10).

В заявке РФ №94039527 (A 61 N 5/06, 1994.10.20, опубл. 1997.02.27) отмечается, что снижение веса можно проводить по достаточно простой схеме и в короткие сроки путем воздействия красного и зеленого цвета на центральное зрение и оранжевого - на периферийное, развивая комбинаторную деятельность по созданию зрительных образов, положительно действующих на гомеостаз человека, снижая аппетит.

Широко используется для снижения веса лечебное голодание в различных его вариантах, касающихся диеты и приема жидкости, однако его рекомендуется проводить только в условиях стационара (патент РФ №2005491, А 61 К 35/78, 1991.06.14, опубл. 1994.01.15).

Чувства голода и насыщения регулируются центрами головного мозга, в первую очередь центрами гипоталамической области. В некоторых патологических состояниях, сопровождающихся ожирением, избыточной массой тела, целесообразно использовать в комплексной терапии лекарственные средства, ограничивающие аппетит (анорексигенные средства).

В настоящее время находят применение в качестве анорексигенных средств некоторые синтетические соединения негормональной природы, например фенамин. Лечение последним производят в сочетании с малокалорийной диетой, при необходимости с разгрузочными днями. Назначают внутрь в виде таблеток (25 мг) 2-3 раза в день. Курс лечения - 1,5-2,5 месяца. При необходимости назначают повторный курс через 3 месяца (М.Д.Машковский. Лекарственные средства, М.: Медицина, 1994, т.II, стр.243).

Известно также использование для лечения ожирения и состояний, ассоциирующих с ним, производных 1,5-бензодиазепина, а также их солей и сольватов, путем введения терапевтически эффективного количества, в результате чего достигается аноректический эффект, происходит регуляция аппетита, вызывается чувство насыщения (WO 94/24149, GB, опубл. 27.10.94, патент РФ 2135486, C 07 D 243/12, опубл. 27.08.99).

В опубликованной 1999.07.20 заявке РФ №97113700, А 61 К 31/40 (DK №96/00011, 10.01.96, опубл. 1999.07.20 описывается применение 3,4-дифенилхроманов в композиции с фармацевтически приемлемым носителем для лечения и профилактики ожирения.

Однако химические препараты, как правило, вызывают побочные реакции организма, такие как появление раздражительности, бессонница, сухость во рту, тошнота, аллергия, задержка жидкости в организме и др. При назначении препаратов лицам с заболеванием сердечно-сосудистой системы и при гипертериозе необходима осторожность. Фепранол, в частности, оказывает возбуждающее влияние на центральную нервную систему, что далеко не всегда позитивно для человека. Кроме того, применение медикаментозного лечения все равно требует комплексной терапии в сочетании с низкокалорийной диетой и/или разгрузочными днями.

Учитывая недостатки применения химических препаратов для снижения веса и подавления аппетита, в последние годы ведется поиск аналогичных средств среди соединений эндогенной природы, в частности белков.

Высокомолекулярные белки против ожирения предложены в патентах РФ №97121100, А 61 К 38/16, опубл. 1999.08.27 и №97114945, А 61 К 38/00, опубл. 1999, 07, 20 (страна приоритета - US).

Пептид, включающий аналог карбоксиконцевой последовательности гормона роста, где карбоксиконцевая последовательность содержит остатки 177-191 человеческого гормона роста:

Leu-Arg-Iie-VaI-Gin-Cys-Arg-Ser-VaI-GIy-GIy-Ser-Cys-Giy-Phe, или последовательность гормона роста отличного от человека млекопитающего, в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем и/или разбавителем, предлагается для лечения ожирения у человека (WO 99/12969 (AU), опубл. 1999.18.03, РФ №2000109265, С 07 К 14/61, опубл. 2002.03.10).

Согласно патенту РФ №96109211 (С 07 К 14/47, опубл. 1998.10.27) (страна приоритета - US) предлагается гомогенный или рекомбинантный биологически активный человеческий или мышиный протеин ожирения, содержащий последовательность: SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:3 или его фрагмент, обладающий активностью указанного протеина, или конъюгаты полиэтиленгликоля и/или полипропиленгликоля, связанных с указанным протеином, со средней молекулярной массой от 15 кДа до 60 кДа, для снижения потребления пищи у млекопитающих и снижения скорости прибавления их веса, лечения, предотвращения и регулирования ожирения и связанных с ним болезней.

В патенте РФ №2197261, А 61 К 38/16, 2003, 27.01 (РСТ/ДК 97/00086, 1997, 27.02., PCT/WO 97/31943, 1997, 04.09), взятом за прототип, предлагается использование фармацевтической композиции, содержащей пептид, для подавления аппетита или индукции насыщения у индивидуума, а также для профилактики и лечения болезней или нарушений, связанных с нарушенной регуляцией аппетита. В качестве упомянутого пептида используют подобный глюкагону пептид, названный GLP-2, выделяемый из кишечных L-клеток, со следующей аминокислотной последовательностью:

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (GLP-2-человека)

HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD (GLP-2-крысиный)

HADGSFSDEMNTVLDNLATRDFINWLLHTKITD (GLP-2-свиной)

Пептид GLP-2 или его гомолог можно получить техникой рекомбининтных ДНК в соответствии с методикой, широко известной в этой области, в частности ДНК- последовательность, кодирующую пептид GLP-2, можно выделить или синтезировать на основе опубликованной ДНК-последовательности препроглюкагона человека.

Способ подавления аппетита осуществляют путем инъекции раствора фармацевтической композиции на основе указанного пептида в количестве 5-10 мкг/кг веса тела. Введение препарата подавляло потребление пищи на 24-32%.

Недостатками использования указанных пептидов и композиций на их основе являются:

- сложность получения, выделения, очистки используемых пептидов, поскольку, как правило, требуется или осмотическое разделение, или высокоэффективная жидкостная хроматография, гель-фильтрация и т.д.,

- опасность возникновения побочных эффектов, в том числе гормональных, учитывая родство указанных пептидов с гормонами.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение возможности снижения количества потребляемой пищи с одновременным устранением побочных реакций в процессе подавления аппетита и снижения массы тела.

Поставленная задача достигается тем, что в способе снижения массы тела в эксперименте на опытных животных, включающем введение последним эффективного количества вещества на основе пептида, в качестве указанного вещества используют глипролиновый пептид, представляющий собой трипептид Pro-Gly-Pro или глипролинсодержащий пищевой белок, представляющий собой желатину.

Предпочтительно использовать трипептид Pro-Gly-Pro в виде инъекций в количестве 0,09-1,0 мг/кг массы тела, а глипролинсодержащий пищевой белок в виде добавки к пище в дозе 8-10:1 (мас.ч.) соответственно.

Способ осуществляют следующим образом на примере глипролинового пептида, представляющего собой трипептид Pro-Gly-Pro, не ограничивая при этом использование других глипролинов - Pro-Gly и Gly-Pro, и глипролинсодержащего пищевого белка, представляющего собой желатину в эксперименте на опытных животных.

Определенные количества глипролина Pro-Gly-Pro постоянно присутствуют в живом организме, образуясь в результате деградации ряда более крупных пептидов и белков, что позволяет рассматривать этот пептид как эндогенное соединение, не имеющее серьезных отрицательных побочных эффектов. Известно, что глипролин Pro-Gly-Pro обладает противоязвенными и антитромболитическими свойствами.

Глипролин Pro-Gly-Pro или пищевой белок - желатину, содержащую в большом количестве глипролин Pro-Gly-Pro и его метаболиты Pro-Gly и Gly-Pro, вводят белым беспородным крысам ежедневно в течение 4-14 дней. Желатина используется в качестве добавки к пище. Крысы контрольной группы получают размягченный в воде сухой комбикорм и воду без ограничения, а животные опытных крыс - тот же корм с добавкой в виде желатины в соотношении 9:1 и воду без ограничения, глипролин Pro-Gly-Pro, растворенный в физиологическом растворе, внутрибрюшинно вводят ежедневно в дозе 0.09-1.0 мг/кг массы. Контрольным животным внутрибрюшинно в те же сроки вводят такие же объемы физиологического раствора. В конце эксперимента определяют изменение веса тела на 100 г массы в день или количество потребленной пищи.

В работе использовали глипролин Pro-Gly-Pro, синтезированный в лаборатории регуляторных пептидов Института Молекулярной генетики РАН (Москва) классическими методами синтеза в растворе с применением смешанных ангидридов.

В качестве добавки к пище применяли желатин фирмы ICN Biomedical Inc (Ohio, USA), или российский желатин в составе которых 86-90% белка.

Результаты исследований обработаны с помощью прикладных программ Statistica 5.0 для Windows при использовании LSD теста. Различия считались значимыми при Р<0.05.

На фиг.1 показано влияние глипролина Pro-Gly-Pro на изменение веса тела крыс, получавших глипролин Pro-Gly-Pro (1 мг/кг) ежедневно в течение 5 дней.

На фиг.1 видно, что у контрольных животных увеличение массы тела на 100 г массы в день к 6-му дню составила 1.88 г, а у животных, получавших внутрибрюшинное введение глипролина Pro-Gly-Pro в дозе 1 мг/кг ежедневно в течение 5-ти дней - 0.99 г. Это различие достоверно. Крысы, получавшие глипролин Pro-Gly-Pro, прибавляли в среднем ежедневно на 0.89 г меньше в расчете на 100 г массы.

Сходные результаты получены и при скармливании крысам желатины как добавки к пище, обогащенной Pro-Gly-Pro и его метаболитами.

Фиг.2 иллюстрирует, что у контрольных животных увеличение веса тела на 100 г массы в день за 6 дней составило 2,5 г, а у животных, получавших добавку 4,5 г в течение 6-ти дней.

Еще большее различие выявлено при более длительном получении добавки к пище в количестве 4 г в течение 10 дней.

На фиг.3 представлены результаты экспериментов с 10-дневным скармливанием добавки. Контрольные крысы этой группы прибавили по 3,5 г/100 г массы/день, а крысы получавшие добавку к пище прибавили значительно меньше - 1,95 г/100 г массы/день, т.е. опытные крысы прибавляли в день на 1,5 г меньше, чем контрольные.

Фиг.4 иллюстрирует изменение прибавления веса контрольных и опытных крыс после 14-дневного эксперимента. Прибавление веса у контрольных крыс в среднем составило 2,31 г/100 г/день. Крысы, получавшие добавку к пище в течение 14-ти дней по 3,75 г, прибавили в массе 1,06 г/100 г массы/день, т.е. увеличение их веса было меньше на 1,25 г/100 г/день.

Уменьшение возрастания массы тела крыс при получении пищевой добавки может быть связано с несколькими причинами, в числе которых может быть и анорексия, т.е. меньшее потребление пищи. Оказалось, что 5-дневное внутрибрюшинное введение глипролина Pro-Gly-Pro в дозе 1 мг/кг в день приводило к меньшему потреблению пищи у этих крыс по сравнению с контрольными, которые получали внутрибрюшинное введение физиологического раствора. Крысы, не получавшие глипролин Pro-Gly-Pro, в среднем ежедневно поглощали 13.9 г/100 г массы тела. Животные, получавшие глипролин Pro-Gly-Pro в течение 5-ти дней, съедали в среднем только 9.2 г/100 г массы тела (фиг.5).

Пример 1

Берут 8 беспородных крыс весом 195-210 г и делят их на две группы: контрольную и опытную. Контрольной группе крыс ежедневно в течение 5-ти дней внутрибрюшинно вводят 1 мл физиологического раствора, а опытным - 1 мг/кг массы глипролин Pro-Gly-Pro, растворенный в 1 мл физиологического раствора. На 6-й день крыс взвешивали и рассчитывали изменение веса в г на 100 г массы тела в день. Обнаруживают, что изменение веса, г/100 г массы/день у контрольных крыс равно: 2,5; 2,38; 2,25; 2,16 (в среднем 2,32); у опытных - 1,57; 0,97; 1,0; 1,36 (в среднем 1,23), что составляет 53% от контроля, т.е. эффект уменьшения прибавления веса тела трипептидом составляет 47%.

Пример 2

Берут 20 беспородных крыс весом 130-160 г и делят их на две группы: контрольную и опытную. Опытные крысы ежедневно в течение 5 дней получали растворенную в теплой воде желатину (4 г). Желатину использовали в качестве добавки к обычному корму. Крысы контрольной группы получали размягченный в воде сухой комбикорм и воду без ограничения, а животные опытной группы - тот же корм с добавкой в виде сухой желатины в соотношении 9:1 (мас.ч.) и воду без ограничения. На 6-й день крыс взвешивали и рассчитывали изменение веса в г на 100 г массы тела в день. Обнаруживают, что изменение веса, г/100 г массы/день у контрольных крыс равно: 4,83; 2,22; 1,92; 11,13; 3,4; 3,62; 4,27; 1,29; 2,77; -0,41 (в среднем 3,52); у опытных - -0,54; 0,43; 2,19; 1,2; 0,54; -0,18; 0,27; -1,02; 0,27; 0,54 (в среднем 0,37), что составляет 10,5% от контроля, т.е. эффект уменьшения прибавления веса тела используемой пищевой добавкой равняется 89,5%.

Пример 3

Берут 20 беспородных крыс весом 218-256 г и делят их на две группы: контрольную и опытную. Опытные крысы ежедневно в течение 9 дней получали растворенную в теплой воде желатину. Желатину использовали в глипролине Pro-Gly-Pro в качестве добавки к обычному корму. Крысы контрольной группы получали размягченный в воде сухой комбикорм и воду без ограничения, а животные опытной группы - тот же корм с добавкой в виде сухой желатины в соотношении 9:1 (мас.ч.) и воду без ограничения. На 10-й день крыс взвешивали и рассчитывали изменение веса в г на 100 г массы тела в день. Обнаруживают, что изменение веса, г/100 г массы/день у контрольных крыс равно: 2,05; 2,47; 4,55; 2,58; 3,01; 2,33; 3,07; 6,72; 2,17; 2,3 (в среднем 3,13); у крыс, получавших пищевую добавку, -1,20; 0,75; 1,97; 2,17; 2,19; 2,44; 1,22; 2,48; 1,23; 2,40 (в среднем 1,81), что составляет 57,76% от контроля, т.е. эффект уменьшения прибавления веса тела при использовании пищевой добавкой в течение 9 дней составляет 42,25%.

Пример 4

Берут 10 беспородных крыс весом 200-225 г и делят их на две группы: контрольную и опытную. Опытные крысы ежедневно в течение 14 дней получали растворенную в теплой воде желатину. Желатину использовали в качестве добавки к обычному корму. Крысы контрольной группы получали размягченный в воде сухой комбикорм и воду без ограничения, а животные опытной группы - тот же корм с добавкой в виде желатины в соотношении 9:1 (мас.ч.) и воду без ограничения. На 15-й день крыс взвешивали и рассчитывали изменение веса в г на 100 г массы тела в день. Обнаруживают, что изменение веса, г/100 г массы/день у контрольных крыс равно: 3,30; 6,71; 2,29; 5,01; 3,19 (в среднем 4,10); у крыс, получавших добавку к пище, - 0,20; 1,78; 1,62; 0,43; 0,47 (в среднем 0,90), что составляет 21,95% от контроля, т.е. эффект уменьшения прибавления веса тела при использовании пищевой добавки в течение 14 дней составляет 78,05%.

Пример 5

Берут 8 беспородных крыс весом 195-210 г и делят их на две группы: контрольную и опытную. Контрольной группе крыс ежедневно в течение 5-ти дней внутрибрюшинно вводят 1 мл физиологического раствора, а опытным - 1 мг/кг массы глипролин Pro-Gly-Pro, растворенный в 1 мл физиологического раствора. Каждый день в клетку животных с контрольными или опытными крысами помещали определенное количество комбикорма (из расчета 40 г на 200 г массы тела) и на следующий день взвешивали оставшийся корм и вычисляли количество съеденного корма. На 6-й день определяли общее количество съеденного корма контрольными или опытными крысами. Количество съеденного корма рассчитывали в г на 100 г массы тела крысы в сутки. Обнаруживают, что количество съеденного корма, г/100 г массы тела/день, у контрольных крыс равно: 22,5; 16,3; 12,70; 11,7 (в среднем 15,80); у опытных - 9,09; 6,10; 8,90; 9,1 (в среднем 8,30), что составляет 53,5% от контроля, т.е. крысы на фоне глипролина Pro-Gly-Pro поглощают пищи на 46,50% меньше, чем контрольные.

Из приведенных примеров видно, что предлагаемый принципиально новый физиологический препарат глипролин Рго-Gly-Pro и добавка к пище, содержащая его, весьма эффективны. Основываясь на экспериментальном материале, можно сказать, что аналогичные глипролину Рго-Gly-Pro глипролиновые пептиды будут оказывать подобный эффект снижения количества потребляемой пищи и снижения массы тела. Эффект уменьшения прибавления веса тела составляет от 47,0% за 5 дней до 78,0% за 14 дней приема глипролина. Преимуществом этих препаратов и содержащего глипролин Pro-Gly-Pro добавки к пище перед многими другими известными средствами снижения массы тела также состоит в заведомой физиологичности их состава и происхождения, исключающих побочные реакции.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной медицине, и может быть использовано для разработки вопросов снижения массы тела. Для этого опытным животным вводят трипептид Pro-Gly-Pro в виде инъекций в количестве 0,09-1,0 мг/кг массы тела, а также желатину в виде добавки к пище. Способ позволяет подавлять аппетит, уменьшать количество потребляемой пищи и как результат - снижать массу тела. 2 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ снижения массы тела в эксперименте на опытных животных, включающий введение последним эффективного количества вещества на основе пептида, отличающийся тем, что в качестве указанного вещества используют глипролиновый пептид, представляющий собой трипептид Pro-Gly-Pro или глипролинсодержащий пищевой белок, представляющий собой желатину.2. Способ снижения массы тела в эксперименте на опытных животных по п.1, отличающийся тем, что трипептид Pro-Gly-Pro используют в виде инъекций в количестве 0,09-1,0 мг/кг массы тела.3. Способ снижения массы тела в эксперименте на опытных животных по п.1, отличающийся тем, что глипролинсодержащий пищевой белок используют в виде добавки к пище в дозе 8-10:1 мас.ч. соответственно.