СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА НОРОК Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 

Способ относится к иммунологическим методам исследования и используется для оценки иммунного статуса животных, а также в качестве дополнительного теста при диагностике инфекционных болезней. В основе метода заложено определение количества лимфоцитов, способных взаимодействовать с эритроцитарными маркерами в виде "розеток".

Известен способ определения количества Т-лимфоцитов в реакции образования спонтанных розеток (Фримель X. Иммунологические методы. М.,- 1979.-С.501-508.). Способ основан на обнаружении в поле зрения микроскопа комплекса Т-лимфоцитов с эритроцитарными маркерами в виде "розеток". Однако данный способ не позволяет комплексно оценивать иммунный статус животного с учетом количества В-лимфоцитов.

Также известен способ определения количества В-лимфоцитов, основанный на использовании эритроцитов быка, сенсибилизированных антителами и комплементом, содержащемся в сыворотке крови белой мыши. Данный способ ограничивает оценку иммунного статуса животного в пределах определения количества В-лимфоцитов (Методические рекомендации по определению Т-, В-лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов в крови, молозиве и молоке крупного рогатого скота/Сост.: Б.И.Кондауров, М.П.Неустроев, Ю.И.Пацула, А.А.Васильев.- Омск, 1981.-С.13-14).

Ближайшим аналогом выбран способ определения количества розеткообразующих Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов, описанный Бажиным М.А. с соавторами (Методы оценки Т- и В-систем иммунитета у крупного рогатого скота при бруцеллезе и туберкулезе: Метод. рекомендации/Сост.: М.А.Бажин, В.А.Мироненко, С.К.Переходова и др.- Омск, 1989.- С.16-22).

Перед постановкой реакции розеткообразования лимфоциты из периферической крови выделяют дифференциальным центрифугированием форменных элементов в градиенте плотности 17% раствора верографина в объеме 2 мл, на который наслаивают 4 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена. Центрифугирование проводят в течение 20-30 минут при 1600 об/мин. Лимфоциты, сконцентрировавшиеся в верхних слоях верографина, собирают шприцом и трижды отмывают от примесей центрифугированием.

Для определения розеткообразующих лимфоцитов готовят эритроцитарные маркеры. Для определения количества антигенсвязывающих лимфоцитов крови крупного рогатого скота Бажин М.А. с соавторами предлагают использовать в качестве маркера эритроциты быка, на поверхности которых адсорбирован соответствующий антиген туберкулеза или брецеллеза.

Для постановки реакции розеткообразования соединяют равные объемы лимфоцитов крови и соответствующих эритроцитарных маркеров.

Для взаимодействия с соответствующими эритроцитарными маркерами В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов компоненты реакции инкубируют при 37°С в течение 10 минут. Для взаимодействия с эритроцитарными маркерами Т-лимфоцитов компоненты реакции инкубируют сначала при 30°С в течение 30 минут, а затем при 10°С в течение 1080-1200 минут. По окончании инкубирования из суспензии клеток, фиксированных глютаровым альдегидом, делают мазки и окрашивают по Романовскому-Гимза.

Известный метод оценки иммунного статуса не обладает достаточной чувствительностью для определения количества лимфоцитов крови и лимфоидных органов норок.

Задачей предлагаемого способа является повышение эффективности оценки иммунного статуса норок путем повышения чувствительности реакции розеткообразования. Способ осуществляется следующим образом: выделяют лимфоциты из минимального объема периферической крови, 0,5-1 мл, в режиме центрифугирования 1600 об/мин в течение 40-45 минут; исследуют иммунокомпетентные клетки не только в периферической крови, но и в селезенке и лимфоузлах; используют стандартный специфический антиген алеутской болезни (АБ, вирусный плазмоцитоз) в эффективной дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка; инкубируют компоненты реакции для определения В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов при 37,5-40,0°С в течение 60-120 минут; инкубацию компонентов реакции для определения количества Т-лимфоцитов осуществляют вначале при 37,5-40,0°С в течение 60-120 минут, затем при 10°С в течение 1500-2100 минут; учет результатов реакции проводят не только в мазках, но и в камере Горяева.

Совокупность всех признаков предлагаемого способа позволяет повысить эффективность оценки иммунного статуса норок на 25-27%.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

- исследование иммунокомпетентных клеток не только периферической крови, но и селезенки и лимфатических узлов;

- центрифугирование в течение 40-45 минут;

- использование стандартного антигена вируса АБ штамма "П-1" (ФНПВЗЦ "ВЕТЗВЕРОЦЕНТР", Москва) в эффективной дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка;

- продолжительность инкубации компонентов реакции розеткообразования для определения В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов в течение 60-120 минут при 37,5-40,0°С;

- продолжительность инкубации компонентов реакции розеткообразования для определения количества Т-лимфоцитов в течение 1500-2100 минут при 10°С.

Пример 1.

Для достижения поставленной цели отбирали пробы периферической крови, селезенки и лимфатических узлов от 40 норок половозрелого возраста темно-коричневого окраса (стандарт). По результатам диагностического исследования крови норок на вирусный плазмоцитоз с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на нитроцеллюлозных стрипах с антигеном АБ всех животных разделили на две группы. 20 норок первой группы на основании отрицательного результата ИФА считали здоровыми, 20 норок второй группы с положительными результатами ИФА считали инфицированными вирусным плазмоцитозом.

При выделении лимфоцитов из периферической крови норок с помощью дифференциального центрифугирования форменных элементов в градиенте плотности 17% верографина при 1600 об/мин в течение 20-30 минут отмечали недостаточный выход лимфоцитов и наличие в полученной суспензии большого числа неотделившихся форменных элементов крови. Поэтому для большего выхода лимфоцитов и отделения их от форменных элементов крови подбирали необходимую продолжительность дифференциального центрифугирования (Таблица 1).

Из таблицы видно, что более высокий выход лимфоцитов из периферической крови норок и максимально возможное отделение от форменных элементов получали в режиме дифференциального центрифугирования 1600 об/мин в течение 40-45 минут.

Следующим подготовительным этапом реакции розеткообразования являлось приготовление эритроцитарных маркеров. Особенностью приготовления эритроцитарного маркера для определения количества антигенсвязывающих лимфоцитов норок являлось использование стандартного диагностического антигена АБ штамма "П-1". Его применение позволило оценивать иммунный статус норок в норме и при вирусном плазмоцитозе. Полученные критерии оценки иммунного статуса использовались в качестве дополнительного теста при диагностике данной инфекции. Экспериментальным путем была подобрана эффективная доза стандартного диагностического антигена АБ (Таблица 2).

Таблица 1Зависимость выхода лимфоцитов из периферической крови от продолжительности ее центрифугирования в градиенте плотностиСкорость центрифугирования, (об/мин)Время центрифугирования, (минуты)Выход лимфоцитов, (%)Концентрация форменных элементов крови в выделенной суспензии лимфоцитов, (тыс/мкл)16002055,3±0,8120,2±0,81 2561,8±0,8315,3±0,75 3066,2±0,5310,5±0,88 3570,9±0,425,8±0,72 4075,3±0,343,2±0,57 4577,4±0,212,3±0,78 50Лимфоциты вместе с эритроцитами оседают на дно пробирки- 55-  -  -   -   -

Таблица 2Количество выявленных антигенсвязывающих лимфоцитов норок в зависимости от дозы антигена в эритроцитарном маркереДоза антигена АБ (мл, в 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка)Количество антигенсвязывающих лимфоцитов, (%)КровьСелезенкаЛимфоузлыНорки здоровыеНорки больные плазмоцитозомНорки здоровыеНорки больные плазмоцитозомНорки здоровыеНорки больные плазмоцитозом0,0051,2+0,235,3±0,341,3±0,218,3±0,221,1±0,317,3±0,120,0102,3+0,1610,5+0,163,8±0,1610,4±0,242,8±0,2210,8±0,250,0203,9±0,2617,8±0,244,4+0,1413,3±0,104,4+0,0913,5±0,220,0305,0+0,2820,8±0,905,7±0,3015,5±0,845,4±0,5115,4±0,240,0404,5±0,1618,4±0,144,1+0,1514,2±0,124,3±0,2513,5±0,210,0503,5±0,1815,1±0,133,4±0,0711,8±0,143,8+0,1411,8±0,050,0702,8±0,1110,3±0,222,6±0,229,5±0,153,4±0,217,5±0,050,1001,1±0,225,4±0,211,8±0,167,4±0,092,5±0,135,1±0,13 1,4±0,142,3±0,231,2+0,223,4±0,051,5±0,032,4±0,020,150        элементыГемолиза   0,200      

По данным таблицы использование антигена АБ в дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка позволило выявить более высокий процент антигенсвязывающих лимфоцитов периферической крови, селезенки и лимфатических узлов норок.

Пример 2.

Для постановки реакции розеткообразования В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов использовали пробы периферической крови, селезенки и лимфатических узлов животных опытных и контрольных групп согласно описанию в примере 1.

Соединяли равные объемы лимфоцитов и эритроцитарных маркеров с последующим инкубированием. Для достижения поставленной задачи был проведен подбор различных временных интервалов инкубации компонентов реакции при температуре, равной температуре тела исследуемого животного (у плотоядных в пределах 37,5-40,0°С).

Из данных таблицы видно, что более высокий процент розеткообразующих В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов периферической крови, селезенки и лимфатических узлов норок выявили при инкубации компонентов реакции длительностью 60-120 минут.

Пример 3.

Для определения количества Т-лимфоцитов в периферической крови, селезенки и лимфоузлах норок использовали группы животных согласно описанию в примере 1.

Для выявления более высокого процента Т-лимфоцитов подбирали различные временные интервалы инкубации компонентов реакции (Таблица 4). По данным таблицы более высокий процент розеткообразующих Т-лимфоцитов выявляли при инкубации компонентов реакции длительностью 1500-2100 минут.

Использование предлагаемого способа исследования иммунокомпетентных клеток периферической крови здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок выявляет более высокий процент всех популяций розеткообразующих лимфоцитов в сравнении с известным методом, описанным Бажиным М.А., что свидетельствует об эффективности предлагаемого способа (Р<0,001). В группе здоровых норок при использовании предлагаемого способа в сравнении с известным процент выявляемости в периферической крови Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов выше на 18%, 30%, 24%, 35%, соответственно, в группе животных, больных вирусным плазмоцитозом - на 23%, 28%, 25%, 32%, соответственно.

Исследование иммунного статуса больных норок предлагаемым способом выявило в периферической крови достоверное уменьшение количества Т-лимфоцитов (Р<0,001) и достоверное увеличение количества В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров и антигенсвязывающих лимфоцитов в сравнении с количественными показателями соответствующих популяций лимфоцитов у здоровых животных (Р<0,001). Полученные результаты свидетельствуют об иммунологической перестройке организма при АБ норок. Увеличение в крови антигенсвязывающих лимфоцитов служит критерием оценки иммунного статуса зверей, являясь дополнительным тестом при диагностике данной инфекции.

Анализ количественных показателей иммунокомпетентных клеток селезенки здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок свидетельствует о достоверно большем проценте розеткообразующих лимфоцитов, полученном при использовании рекомендуемого нами способа в сравнении с известным (Р<0,001). В группе здоровых норок процент выявляемости Т-лимфоцитов селезенки выше на 26% при использовании предлагаемого способа в сравнении с известным, В-лимфоцитов - на 27%, лимфоцитов-киллеров - на 30%, антигенсвязывающих лимфоцитов - на 30%, в группе норок больных вирусным плазмоцитозом эти показатели составили 27%, 34%, 29%, 32% соответственно.

Сопоставление количественных величин иммунокомпетентных клеток селезенки здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок, исследованных предлагаемым способом, показывает достоверное уменьшение количества Т-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров (Р<0,001) и достоверное увеличение количества В-лимфоцитов, антигенсвязывающих лимфоцитов (Р<0,001) при данной инфекции, что свидетельствует об изменении иммунного статуса животного. Увеличение количества антигенсвязывающих лимфоцитов в селезенке норок больных вирусным плазмоцитозом, вследствии сенсибилизации организма данным возбудителем, служит дополнительным тестом при диагностике данной инфекции.

Изучение количественных показателей Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов лимфатических узлах норок показало достоверно больший процент выявляемости розеткообразующих клеток (Р<0,001). При использовании предлагаемого способа постановки реакции розеткообразования, в сравнении с известным, в группе здоровых животных на 28%, 26%, 29%, 32%, соответственно, в группе норок, больных плазмоцитозом - на 14%, 31%, 28%, 34%, соответственно.

В группе норок, больных вирусным плазмоцитозом, иммунологическое исследование лимфоузлов предлагаемым способом показало уменьшение количества Т-лимфоцитов (Р<0,001), увеличение количества В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров, антигенсвязывающих лимфоцитов (Р<0,001) в сравнении со здоровыми животными. Изменение количества иммунокомпетентных клеток в лимфатических узлах инфицированных вирусным плазмоцитозом норок свидетельствует о развитии иммунного ответа на антиген АБ. Увеличение количества антигенсвязывающих лимфоцитов в лимфатических узлах служит критерием оценки иммунного ответа норок и является дополнительным тестом при диагностике вирусного плазмоцитоза.

Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет повысить эффективность оценки иммунного статуса норок на 25-27% и может использоваться в качестве дополнительного теста для диагностики алеутской болезни.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ исследования иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса норок, включает выделение лимфоцитов путем центрифугирования из периферической крови, приготовление эритроцитарных маркеров, постановку реакции розеткообразования, инкубацию компонентов реакции и учет результатов реакции, и, дополнительно, выделение лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов, причем центрифугирование проводят в течение 40-45 минут, приготовление эритроцитарных маркеров осуществляют с использованием специфического антигена алеутской болезни норок в дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1% суспензии эритроцитов быка и инкубацию компонентов реакции осуществляют при температуре 37,5-40,0°С в течение 60-120 минут, а для определения Т-лимфоцитов дополнительно осуществляют инкубацию при температуре 10°С в течение 1500-2100 минут.

Способ обеспечивает повышение эффективности оценки иммунного статуса норок на 25-27% и может использоваться в качестве дополнительного теста для диагностики алеутской болезни норок. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ исследования иммунокомпетентных клеток для оценки иммунного статуса норок, включающий выделение лимфоцитов путем центрифугирования из периферической крови, приготовление эритроцитарных маркеров, постановку реакции розеткообразования, инкубацию компонентов реакции и учет результатов реакции, отличающийся тем, что дополнительно выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов, центрифугирование проводят в течение 40-45 мин, приготовление эритроцитарных маркеров осуществляют с использованием специфического антигена алеутской болезни норок в дозе 0,020-0,040 мл на 1 мл 1%-ной суспензии эритроцитов быка и инкубацию компонентов реакции осуществляют при температуре 37,5-40,0°С в течение 60-120 мин.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения Т-лимфоцитов дополнительно осуществляют инкубацию при температуре 10°С в течение 1500-2100 мин.