Способ определения иммунокомпетентных клеток Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к иммунологии.

Цель изобретения - интенсификация способа при массовом иммунологическом обследовании, увеличение количества исследуемых образцов, уменьшение количества исследуемого материала и повышение точности способа - достигается тем, что на этапе восстановления осмотического давления после лизиса эритроцитов используют 10-кратный раствор Хенкса, содержащий 3-7% желатина, операции дофиксации и окраски кдеточ-- ных препаратов совмещают, осуществляя их вместо равной по времени и технике исполнения операции подготовки осадка клеток к нанесению мазков (в прототипе) , но вместо дистиллированной воды

к осадку приливают раствор краски, содержащий 10-30% метилового или этилового спирта, ресуспендируют, а мазки готовят не вручную, а механическим способом одномоментно для всей партии проб: планшет накрывают листом бумаги, служащей-в качестве прокладки, с про- битыми в ней отверстиями, соответствующими по диаметру лункам планше-1 та, затем ацетатцеллюлозной пленкой, предварительно покрытой слоем белка, которая используется в данном случае в качестве препаратоносителя, сверху кладут крышку с поролоновой прокладкой, которую плотно прижимают к планшету осадок ресуспендируют, перевернутый вверх дном планшет центрифугируют при 180-400g 5 мин,

сл

00

to

со

315

выдерживают 20-40 мин, после чего полученные окрашенные мазки-отпечатки просушивают, промывают водой и вновь просуживают.

Способ осуществляют следующим образом.

В лунку планшета для агглютинации (объем каждой лунки 2 см3) вливают 1,8 мл дистиллированной воды. 0,02- 0, крови забирают из пальца и сразу же смешивают с водой в лунке. Через 40 с в лунку приливают 0,2 мл 10 кратного раствора Хенкса, содержащего 3-7% желатина, перемешивают. Центрифугируют при 150-200g, над- осадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 0,3 мл среды 199. Получают суспензию лейкоцитов, готовую для постановки реакции.

В лунки планшетов для иммунологических реакций одноразового использования (объем каждой лунки 0,2 см) заливают на 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов и равный объем 0,025%- ной суспензии индикаторных частиц - эритроцитов барана или мыши, или клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием, цнтрифугируют при 200g 5 мин, инкубируют при 4-10 С 30 мин, затем к осадку приливают 0,02- 0,025 мл раствора, содержащего 0,4% глутарового альдегида, 4% формальдегида, остальное - фосфатный буфер, и выдерживают при комнатной температу- ре 10 мин. Надосадочную жидкость вы- тряхивают, а к осадку приливают 0,05 мл раствора метилового зеленого пиронина или азур-эозина, содержащего дополнительно 10-30% метилового или этилового спирта. Затем планшет накрывают пропитанной водой бумажной прокладкой с выбитыми в ней отверстиями, соответствующими лункам планшета, сверху накладывают лист проз- рачной пленки соответствующего планшету размера стороной, предварительно покрытой слоем белка, фиксированного метанолом, затем накрывают крышкой планшета, к которой снизу приклеен поролон. Крышку плотно прижимают к планшету при помощи резинок или зажимов, после чего осадок клеток тщательно ресуспендируют в краске. Далее планшет переворачивают так, чтобы дно лунок находилось вверху, центрифугируют при 1 80-400 g 5 мин и выдерживают в течение 20-40 мин. Затей пленку вместе с бумагой, снимают с планшета,

04

раске дают стечь и высушивают. Плену с полученными мазками отделяют от бумаги, промывают в.одой и высушивают вновь. Полученные мазки заливают канадским бальзамом, покрывают листом аналогичной пленки и получают препараты, готовые к просчету. Предложенный способ позволяет получить на пленке одновременно 96 мазков (по количеству лунок в планшете).

Пленки к работе готовят следующим образом.

Берут лист гибкой прозрачной пленки, например ацетатцеллюлозной пленки, используемой в качестве основы при производстве рентгеновских или фотографических пластин, разрезают прямоугольники размером см, при необходимости (если готовят из отработанных рентгеновских или фотографических пластин) моют и высушивают. Затем при помощи ватного или марлевого тампона наносят слой белка (сыворотки крови, раствора альбумина, яичного белка или желатина), высушивают и фиксируют, выдерживая в метиловом спирте в течение 10 мин.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Из пальца у детей в возрасте от 1 до 3 лет забирали по 0,02 мл крови. Кровь немедленно помещали в лунку планшета для агглютинации, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, перемешивали, выдерживали 40 с. Затем приливали 0,2 мл 10-кратного раствора Хенкса, содержащего 3% желатина, перемешивали. После забора крови указанным способом у 96 детей планшеты плотно закрывали крышками и транспортировали в лабораторию (всего 4 планшета по 24 лунки в каждом). В лаборатории планшеты центрифугировали при 180 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 0,3 мл среды 199. Осадок ресуспендировали, получали суспензию лейкоцитов. В лунки трех чистых иммунологических 96-луночных планшетов (объем каждой лунки 0,2 мл) заливали по 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов. После этого в один планшет приливали по 0,05 мл 0,25%-ной суспензии эритроцитов барана, в другой - по 0,05 мл 0,025%-ной суспензии эритроцитов мыши, в третий - по 0,05 мл 0,025%- ной суспензии клеток пекарских дрож515

жей, убитых нагреванием, Центрифуги ;ювааи при 200 g 5 мыт, инкубиропалт пги 6°С 30 ин. J четв, .ртого гл. (лредваритетыю обработанные 0,05 мл водного рчствора 0,OJ M теофиллина и высушенные) приливали по 0,05 мл полученной от каждого больного суспензии лейкоцитов, планшет инкубировали при 37° С в течение 60 мин, после чего в лунки приливали по 0,05 мл эритроцитов барана (0,025% ной суспензии), центрифугировали при 200 g 5 мин и инкубировали при 6 С 30 мин. По окончании инкубации в хо- лодильнике в лунки планшета заливали по 0,025 мл раствора, закрепляющего розетки (0,4% глутарового альдегида, 4% формальдегида, остальное - фосфат- иый буфер). Выдерживали 10 мин. Над- осадочную жидкость вытряхивали, а к осадку приливали по 0,05 мл раствора метилового зеленого и пиронина в ацетатном буфере, в который введено 10% этилового спирта. После этого каждый планшет накрывали бумажной прокладкой размером см, пропитанной водой, с выбитыми в ней отверстиями диаметром 5 мм, совпадающими с лунками планшета, сверху наклады- вали лист прозрачной пленки, предварительно покрытой слоем белка, размером см (в качестве белка использовали сыворотку крови, раствор альбумина или белок яйца, пленку вы- сушивали, фиксировали в метаноле в течение 10 мин), далее прокладывали сло поролона, крышку планшета и плотно перетягивали полученный комплект резиновыми обхватами. Затем содержимое лунок тщательно ресуспендировали постукиванием планшета. Далее планшеты переворачивали так, чтобы дно лунок находилось вверху, центрифугировали при 180gB течение 5 мин и вы- держивали в перевернутом состоянии 20 мин. После этого крышку снимали, краске давали стечь, а пленку вместе с бумажной прокладкой высушивали. Бумагу снимали, а пленку с мазками про- мывали водой и вновь высушивали. Высушенные мазки заливали канадским бальзамом и накрывали листом аналогичной чистой пленки. 1аким образом на пленке размером 9x1 2 см получали 96 одно- временно приготовленных препаратов, расположение и величина которых соответствовали расположению и диаметру лунок планшета. Все 384 полученных

1-

препарата имели хорошее качество, большинство из них не было загрязне- ьо оболочками эритроцитов, лишь 49 препаратов (,8%) имели небольшое количество оболочек, нисколько не мешающих просчету. Плотность рас-- пределения клеток во всех мазках была одинаковой - нормальной, конгло-, мератов практически не наблюдалось. Поэтому максимальные различия показателей, просчитанных в трех случайно выбранных полях препаратов, составляли не более 1-2%, что свидетельствует о -стабильно высокой точности способа. Общее время приготовления всех 384 препаратов (центрифугирование 5 мин, выдерживание после центрифугирования 20 мин, высушивание до и после промывания мазков 20 мин) составило 45 мин, но из них конкретные затраты труда составляют 10 мин, если Вычесть операции, которые не требуют непрерывной работы лаборанта (для сравнения - на приготовление такого же количества препаратов по базовому способу уходит 150 мин непрерывного труда лаборанта).

Пример 2.У рабочих предприятия из пальца забирали 0,03 мл крови. Кровь немедленно помещали в лунку планшета для агглютинации, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, выдерживали 40 с. Затем приливали 0,2 мл 10-кратного раствора Хенкса, содержащего 4% желатина, перемешивали. После забора крови указанным способом у 96 рабочих планшеты плотно закрывали крышками и транспортировали в лабораторию. В лаборатории планшеты центрифугировали при 150 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 0,3 мл среды 199. Осадок ресуспендировали, получали суспензию лейкоцитов. С полученными клетками осуществляли комплекс тестов розеткообразования (РО) и фагоцитоза (4 теста: Е-РО, М-РО, Д-фаго- цитоза и Е-РО после инкубации клеток с теофиллином, Е,М,Д-маркеры - соответственно эритроциты барана, мыши, дрожжевые клетки) вплоть до получения осадка и вытряхивания надосадоч- ной жидкости так же, как в примере 1. После этого к осадку клеток приливаи по 0,05 мл раствора метилового зееного и пиронина в ацетатном буфере, который добавляли 20% метилового пирта. После этого планшеты на-

крывали бумажной прокладкой размером см, пропитанной водой, с выбитыми в ней отверстиями диаметром 5 мм, соответствующими лункам планшета, сверху накладывали листы прозрачной пленки, покрытой слоем белка (пленку готовили так же, как в примере 1.), далее прикладывали слой поролона и срышку, все это плотно перетягивали резиновыми обхватами. Затем содержимое лунок тщательно ресуспендировали постукиванием планшета. Далее планшеты переворачивали так, чтобы дно лунок находилось вверху, центрифугировали при 250 g в течение 5 мин и выдерживали в перевернутом состоянии 30 мин. После этого крышку снимали, краске давали стечь, а пленку вместе с бумажной прокладкой высушивали. Бумагу снимали, а пленку с мазками промывали водой и вновь высушивали. Высушенные мазки заливали канадским бальзамом и накрывали листом аналогичной чистой пленки. Таким образом, на прямоугольнике пленки размером 9x12 см получали 96 препаратов Все 384 полученных препаратов имели хорошее качество. Оболочки эритроцитов наблюдались в 62 препаратах (16,1%), но количество их было настолько незначительно, что они не мешали просчету. Плотность распределения клеток во всех препаратах была одинаковой - нормальной, конгломератов практически не наблюдалось. Поэтому максимальные различия показателей, просчитанных в трех случайно выбранных полях препаратов, составляли не более 1-2%, что свидетельствует о стабильно высокой точности способа. Общее время приготовления 384 препаратов составило 55 мин, однако, если вычесть операции, которые не требуют непрерывной работы лаборанта, то на приготовление препаратов уходит всего 10 мин непрерывного труда (по базовому способу - 150 мин) .

Пример З.У рабочих предприятия из пальца забирали по 0,05 мл крови. Кровь немедленно помещали в лунку планшета для агглютинации, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, перемешивали, выдерживали 40 с. Затем приливали 0,2 мл 10-кратного раствора Хенкса, содержащего 7% желатина, перемешивали . После забора крови указанным способом у 96

рабочих планшеты плотно закрывали крышками и транспортировали в лабораторию. В лаборатории планшеты

центрифугировали при 200 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 0,3 мл среды 199. Осадок ресуспендировали, получали суспензию лейкоцитов. С

полученными клетками ставили комплекс тестов розеткообразований (4 теста: Е-РО, М-РО, Д-фагоцитов и Е-РО после инкубации клеток с теофиллином) вплоть до получения осадка и вытряхивания надосадочной жидкости так же, как в примере 1. После вытряхивания надосадочной жидкости к осадку приливали по 0,05 мл раствора метилового зеленого пиронина в ацетатном бу0 фере, в который добавляли 30% этилового спирта. После этого планшеты накрывали бумажными прокладками размером см, пропитанными водой, с выбитыми в них отверстиями диаметром

5 5 мм (каждое отверстие должно находиться против лунки), сверху накладывали листы прозрачной пленки, предварительно покрытой с&тоем белка (пленку готовили так же, как в примере 1),

0 далее прикладывали слой поролона и крышки планшетов. Все. это плотно перетягивали резиновыми обхватами. Затем содержимое лунок тщательно ресуспендировали постукиванием планшета. Далее планшеты переворачивали так, чтобы дно лунок находилось сверху, центрифугировали при 300g в течение 5 мин и выдерживали в перевернутом состоянии 30 мин. После этого

0 крышку снимали, краске давали стечь, а плелку вместе с бумажной прокладкой высушивали. Высушенные мазки заливали канадским бальзамом и накрывали листом аналогичной чистой пленки. Таким

5 образом на прямоугольнике пленки размером см получали 96 препаратов. Все 384 полученных препарата имели хорошее качество. Оболочки эритроцитов наблюдали в 109 препаратах (28,4%)(

5

что связано, вероятно, с большим количеством забираемой для анализа крови (0,05 мл). Однако количество оболочек в препаратах было настолько незначительным, что бни не мешали просчету препаратов. Плотность .распределения клеток во всех препаратах была одинаковой - нормальной , конгломера-- тов практически не наблюдалось.

у15

Подробный анализ качественных характеристик мазков (определяющих воспроизводимость и точность метода), а также затрат времени на их получение для данных примеров показал следующее.

Предлагаемый способ дает возможность получать более точные конечные результаты, что выражается: а) в стабильной равномерно одинаковой нормальной густоте всех препаратов, в то время как при изготовлении мазков „ . вручную (прототип) густ,ота препаратов сильно колеблется и зависит, в част- ности, от индивидуальных особенностей и опыта лаборантов, в связи с чем 10% препаратов не удается просчитать из-за плохого качества мазков4 б) в том, что предлагаемый способ дает воз можность стабильно получать препараты без оболочек эритроцитов или с небольшим количеством оболочек, практически не мешающих просчету препаратов, в то время как при использовании прото- типа более половины всех препаратов были загрязнены оболочками эритроцитов, что в )0% случаев привело к невозможности просчета препаратов. Таким образом, данные свидетельствуют о большей точности предлагаемого способа в сравнении с прототипом.

Предлагаемый способ позволяет практически полностью устранить конгломераты из препаратов, что также ведет к увеличению точности способа Действительно, при просчете результатов в трех параллельных пробах различия в полученных данных были по предлагаемому СПОСОбу ДОСТОВерНО (,01

и существенно (в 2,1-3,3 раза) ниже, чем по прототипу, что непосредственно уже свидетельствует о более высокой точности предлагаемого способа.

Осуществление операций предложен- ного способа и подготовка к ним занимают времени в 4,4-5,4 раза меньше, чем в базовом способе (прототипе). При приготовлении препаратов предложенным способом планшет после центри- фугирования выдерживают в течение 20- 40 мин, не затрачивая труда, в то время как приготовление мазков вручную при базовом способе требует не менее 150 мин непрерывной работы лаборанта. Если учесть, что предыдущие этапы вы- полнения способа, включая подготовку реактивов непосредственно перед реакцией, в предложенном и базовом

30

10

Q e Q 5 Q

д

$ Q -

5

способах практически совпадают и время их выполнения одним сотрудником по данным хронометража около 122 кин, то в целом на осуществление предложенного способа идет в 2,8-2,6 раза меньше рабочего времени, чем на осуществление базового. Имеет место определенная экономия реактивов (спирта, краски) и препаратоносителя (предметных стекол) при использовании предложенного способа по сравнению с базовым.

Таким образом, предложенный способ по отношению к прототипу (базовому способу) является более совершенным и точным за счет существенного улучшения качества приготовляемых препаратов, позволивших получить более стабильные и воспроизводимые результаты, благодаря очистке препаратов от оболочек эритроцитов и равномерного распределения клеток на пленке за счет перехода с ручного труда на стандартный механический способ одновременного и однотипного приготовления большого количества мазков-отпечатков. Он позволяет получить конечные ре. зультаты в 2,8-2,6 раза быстрее, чем при использовании базового способа, что дает возможность выполнить предложенный способ для 96 образцов крови одним сотрудником, по хронометрическим данным, приблизительно за 4- 4,5 ч рабочего времени.

Точность и краткость выполнения предложенного способа, простота и доступность его для всех лабораторий выводит комплекс микрометодов розетко- образования и фагоцитоза на качественно новый уровень - возможности практического применения для массовых обследований населения.

В связи с изложенным можно рекомендовать широкое внедрение способа при массовых иммунологических исследованиях населения (не менее 96 человек за 4-5 ч рабочего времени)j неиспользование его не только в научных лабораториях, но и во всех практических клинических лабораториях для оценки иммунного статуса человека. Способ полностью готов к внедрению, прост в исполнении, дешев, нетрудоемок, точен, краток во времени, требует минимального количества дешевых и доступных реактивов и оборудования.

Формула изобретения

Способ определения иммунокомпетент- ных клеток, включающий отделение лейкоцитов от гемолизированных эритроцитов, смешение лейкоцитов с индикаторными частицами в лунках планшета, центрифугирование смеси, фиксацию клеток, приготовление мазков клеток, их окрашивание с последующим учетом JQ иммунекомпетентных клеток, отличающийся тем, что, с целью интенсификации способа при массовом иммунологическом обследовании, увеличения количества исследуемых объездов, f5

уменьшения количества исследуемого материала и повышения точности способа, отделение лейкоцитов от гемо- лизированных эритроцитов проводят при центрифугировании в солевом растворе в 3-7% желатина, окрашивают осажденные клетки после фиксации, а мазки клеток приготавливают на поверхности пленки с белковым покрытием в процессе центрифугирования планшета с ресуспендированными в лунках, фиксированными окрашенными клетками и их осаждения из лунок на поверхность пленки.

Способ относится к области медицины и заключается в выделении суспензии лейкоцитов крови, постановке реакций розеткообразования и фагоцитоза, фиксации, окраске и приготовлении мазков. Целью изобретения является интенсификация способа при массовом иммунологическом обследовании, увеличение количества исследуемых образцов, уменьшение количества исследуемого материала и повышение точности способа. Цель достигается добавлением 3 - 7% желатина к 10-кратному раствору Хенкса, что избавляет от загрязнения оболочками эритроцитов клеточные препараты на этапе выделения лейкоцитов

проведением окраски клеток непосредственно в суспензии до нанесения мазков

механическим приготовлением мазков-отпечатков одновременно и однотипно путем центрифугирования при 180 - 400G перевернутой многолуночной емкости с пробами на плотно фиксированные к ней бумажную прокладку с отверстиями и прозрачную пленку, используемую в качестве препаратоносителя.