СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ И УСТОЙЧИВОСТИ КЛЕТОК КОРИНЕБАКТЕРИЙ Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/24 C12N13/00 

Способ определения морфологической изменчивости клеток коринебактерий после воздействия ультразвука относится к микробиологии и может быть использован для выявления трансформированных вариантов микроорганизмов и определения их устойчивости.

Известен способ определения динамики изменчивости микроорганизмов (Патент RU 2141532 С1, 6 С 12 Q 1/01, 1/24, С 12 N, 13/00, "Способ определения динамики изменчивости микроорганизмов", Н.Т.Понкратова, Н.М.Колычев, Бюл. №32, 20.11.99). Данный метод основан на воздействии низкоэнергетическим лазерным излучением при энергетических экспозициях от 0,05 до 0,5 Дж/см, напряженностью магнитного поля 60 мТл в течение 60 секунд на микробную клетку в биологической среде с последующей фиксацией бактериальных клеток тушью или азур-эозином. Метод позволяет выявлять изменчивость микроорганизмов в динамике. Однако известный способ не позволяет определить степень устойчивости измененных микроорганизмов.

Задачей изобретения является повышение эффективности выявления морфологической изменчивости клеток коринебактерий путем воздействия на взвесь микроорганизмов в 0,5-0,55% растворе хлорида натрия ультразвуком в диапазоне 40-45 кГц, частотой 83-85 мА при экспозиции 5-30 минут, что позволяет оценить степень устойчивости изучаемых микроорганизмов.

Ультразвуковое воздействие приводит к образованию кавитационных полостей в микробных клетках, вследствие чего происходит ионизация молекул воды. Кроме того, в поле действия ультразвуковых волн в поверхностных слоях и внутри клеток возникают микропотоки, смещающие внутриклеточные структуры и вызывающие в них необратимые деструктивные процессы. При разрушении микроорганизмов ультразвуком основная роль принадлежит механическому фактору, тогда как термический фактор не оказывает никакого влияния. Это позволяет использовать ультразвук для обработки бактериальных клеток при получении вакцин, токсинов микроорганизмов без повышения температуры или добавления химических веществ. В результате этого полученные биопрепараты сохраняют высокие иммуногенные свойства. Поскольку бактерии обладают относительно малой массой и жесткой оболочкой, ультразвуковые колебания действуют на них в очень слабой степени. Для усиления действия ультразвуковых волн микроорганизмы погружают в 0,5-0,55% раствор хлорида натрия. Предлагаемый режим обработки является оптимальным для разрушения микробных клеток.

Описание опыта

Определение морфологической изменчивости и устойчивости клеток коринебактерий осуществляли после воздействия на них ультразвука с помощью прибора УЗДН 2Т. Питающее напряжение 220 Вт, частота 83-85 мА, звуковой диапазон 40-45 кГц, экспозиция от 5 до 30 минут. Объектом исследований служил референтный штамм С.pseudotuberculosis 70 R, депонированный в ВГНКИ М.В.Заболотных, Н.М.Колычевым, И.Г.Трофимовым в 1989 г. Взвесь коринебактерий готовили из суточной агаровой культуры на стерильном 0,5-0,55% растворе хлорида натрия. Эта концентрация соли является оптимальной для достижения бактерицидного эффекта. Взвесь коринебактерий с концентрацией 1 млрд. м.т. в объеме 40 мл на 0,5-0,55% растворе хлорида натрия разливали в стерильные колбы. После обработки ультразвуком взвесь коринебактерий в объеме 0,4 мл переносили на чашки Петри с коринебакагаром (КБА). Результаты роста учитывали после инкубирования посевов при температуре 37°С в течение 24 - 36 часов в сравнении с контрольными культурами (не подвергнутыми воздействию ультразвука).

Для выявления L-трансформированных вариантов коринебактерий после воздействия на них ультразвука бактериальную взвесь культурального штамма 70 R с концентрацией 1 млрд м.т. в 1 мл засевали методом укола в полусинтетическую среду Школьниковой в модификации И.Р.Дорожковой с последующим культивированием ее при 37°С в течение семи суток.

Для определения патогенных свойств С.Pseudotuberculosis 70 R до и после воздействия физического фактора использовали белых мышей весом 18-20 г. Для заражения животных готовили 1 млрд взвеси культур коринебактерий на физиологическом растворе. Полученные суспензии вводили мышам интраперитонеально в объеме 1 мл.

Морфологическая характеристика колоний и клеток коринебактерий после воздействия физического фактора

Интактные культуры коринебактерий на коринебакагаре через 18-24 часов инкубирования при 37°С формировали колонии черного цвета. Колонии штамма 70 R имели округлую форму диаметром 2-3 мм с неровными краями, куполообразным возвышением в центре, сухой, шероховатой, матовой поверхностью. При прикосновении бактериологической петлей легко сдвигались с поверхности среды, крошились. В физиологическом растворе плохо суспендировались. Коринебактерии штамма 70 R в мазках-препаратах представляли собой грамположительные овоиды длиной 0,68-1,34 мкм, шириной 0,42-1,06 мкм, расположенные одиночно и скоплениями. После воздействия на микроорганизмы ультразвуковыми колебаниями отмечали различия в интенсивности роста колоний коринебактерий на КБА (см. чертеж). На чертеже видно, что при пятиминутной экспозиции воздействия ультразвуком 96% колоний штамма 70 R сохраняли жизнеспособность. При десятиминутной экспозиции воздействия количество колоний снижалось с 2818±74 до 1812±96, что соответствовало 72% жизнеспособных колоний. При 15-минутной ультразвуковой экспозиции насчитывали 987±47 колоний или 39% жизнеспособных колоний микроорганизмов. При 20 и 25-минутной экспозиции количество колоний снижалось с 57±8 до 12±4, что составляло 2% и 0,5% соответственно.

После 30 мин воздействия ультразвуком рост колоний не обнаружен. Изменчивость клеток С.Pseudotuberculosis 70 R при воздействии на них низкоэнергетическим лазерным излучением и ультразвуковыми колебаниями представлена в таблице 1. Способ определения динамики изменчивости микроорганизмов, выбранный ближайшим аналогом, основан на воздействии низкоэнергетическим лазерным излучением при энергетических экспозициях от 0,05 до 0,5 Дж/см напряженностью магнитного поля 60 мТл в течение 60 секунд на микроорганизмы. В отличие от предлагаемого метода он позволяет выявлять изменчивость микроорганизмов в динамике без констатации степени патогенности трансформированных вариантов микроорганизмов.

При обработке ультразвуком мощностью 44 кГц в течение 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут количество колоний штамма 70 R снижалось в 1,2, 1,6, 2,9, 49 и 235 раз (табл. 1). Через 30 минут рост колоний отсутствовал (р<0,05). На питательной среде коринебактерии в R-форме образовывали округлые колонии диаметром 2,5-3 мм темно-коричневого цвета с размытыми, вспененными краями и приподнятым центром, матовой, шероховатой поверхностью. При микроскопии мазков из колоний выявляли слабоокрашенную, бесформенную массу, а также бактериальные клетки булавовидных, гантелеобразных форм.

Таким образом, предлагаемый способ воздействия на микроорганизмы ультразвуком в диапазоне 40-45 кГц, частотой 83-85 мА с экспозицией от 5 до 15 мин позволяет изучать динамику трансформации микроорганизмов. Воздействием ультразвука в течение 30 минут достигается полная инактивация микроорганизмов.

При воздействии на взвесь коринебактерий ультразвуком с экспозицией от 5 до 25 минут микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность и, приспосабливаясь, образуют трансформированные варианты, выявляемые на полужидкой среде Школьниковой.

Морфология L-вариантов коринебактерий при фазово-контрастной микроскопии разнообразна. Они вариабельны по форме, величине, оптической плотности и представлены, в основном, скоплениями или отдельно расположенными шаровидными структурами, бесструктурными диффузными массами, распадающимися зернистыми образованиями.

Экспериментально установлено, что патогенные свойства интактных штаммов коринебактерий влияют на срок жизни лабораторных животных (табл. 2). Из таблицы видно, что продолжительность жизни лабораторных животных, зараженных коринебактериями штамма 70 R, составила в среднем 7,7±0,6 суток. Отмечено значительное снижение массы тела мышей с 19,6±0,4 до 17,5±0,7 г или на 11% от первоначального веса. У животных наблюдали вялость, отказ от корма, слипание шерсти. При вскрытии у павших мышей отмечали сильное истощение. В месте введения инфекционного материала обнаружены множественные кровоизлияния, мелкие гнойные очажки размером 0,1×0,1 мм. Имел место выраженный гепатолиенальный синдром, характеризующийся увеличением печени и селезенки в 1,5-2 раза в сравнении с контролем с образованием в них кровоизлияний и гнойных очагов размерами 0,2×0,2 мм. Паховые лимфатические узлы были увеличены до размеров горошины и содержали зеленовато-белые гнойные массы творожистой консистенции. Из пораженных паренхиматозных органов, лимфоузлов и гнойных очагов в месте введения выделяли исходную культуру коринебактерий.

В мазках-отпечатках выявляли грамположительные крупные овоиды, располагавшиеся скоплениями, в виде римской V, длиной 0,68-1,34 мкм, шириной 0,42-1,06 мкм.

Таблица 2
Биологическая оценка изменчивости клеток С.Pseudotuberculosis 70 R после воздействия ультразвука№ п/пШтамм 70 R (интактный)Штамм 70 R (обработанный ультразвуком) Продолжительность жизни мышей, суткиМасса лабораторных животных, гПродолжительность жизни мышей, суткиМасса лабораторных животных, г  До зараженияПосле заражения До зараженияПосле заражения1720,017,23018,018,92719,816,93019,720,53819,017,43019,520,14920,018,33019,019,95820,119,03020,020,7М±m7,7±0,619,6±0,417,5±0,73019,2±0,520,0±0,4

На питательной среде коринебактерии штамма 70 R росли в виде черных, округлых, с неровными краями, шероховатых, с матовой поверхностью, сухих колоний. После заражения мышей взвесями коринебактерий, инактивированными ультразвуком, животные сохраняли жизнеспособность в течение всего срока наблюдения (табл.2). Прирост массы составил в среднем 4%. После вскрытия умерщвленных животных изменений во внутренних органах не выявлено. Культуры коринебактерий не выделены.

Таким образом, предлагаемый способ определения морфологической изменчивости клеток коринебактерий после воздействия ультразвука позволяет повысить эффективность выявления измененных клеток и определить степень их устойчивости.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выявления трансформированных вариантов коринебактерий и приготовления специфических биопрепаратов. Морфологическую изменчивость клеток коринебактерий и их устойчивость определяют после воздействия на взвесь клеток в 0,5-0,55% растворе хлорида натрия ультразвуком в диапазоне 40-45 кГц с частотой 83-85 мА при экспозиции от 5 до 30 минут. В течение времени экспонирования с интервалом в 5 минут анализируют изменение морфологии клеток, определяют число жизнеспособных клеток и оценивают наличие морфологической изменчивости по образованию L-трансформированных клеток при экспозиции от 5 до 15 минут. Степень устойчивости клеток оценивают по снижению числа жизнеспособных клеток: от 5 до 15 минут экспозиции - высокая, от 16 до 25 минут - средняя, от 26 до 30 минут - отсутствие устойчивости. Способ позволяет повысить эффективность выявления изменчивости коринебактерий. 1 ил., 2 табл.

Способ определения морфологической изменчивости и устойчивости клеток коринебактерий, отличающийся тем, что на взвесь клеток в 0,5-0,55% растворе хлорида натрия воздействуют ультразвуком в диапазоне 40-45 кГц с частотой 83-85 мА при экспозиции 5 - 30 мин, в течение времени экспонирования через каждые 5 мин анализируют изменение морфологии клеток, определяют число жизнеспособных клеток и оценивают наличие морфологической изменчивости по образованию L-трансформированных клеток при экспозиции в течение 5 - 15 мин, а степень устойчивости клеток оценивают по снижению числа жизнеспособных клеток, определяя ее как высокую при экспозиции 5 - 15 мин, как среднюю - при экспозиции 16 - 25 мин и отсутствие устойчивости при экспозиции 26 - 30 мин.