ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ UREAPLASMA UREALYTICUM И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ УРЕАПЛАЗМОЗОВ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Ureaplasma urealyticum и диагностики урогенитальных уреаплазозов, путем выделения уреаплаз из клинического материала.

Этиологическая структура урогенитальных инфекций постоянно меняется. В последнее время резко возросла частота хламидийной, вирусной, микоплазменной, уреаплазменной и смешанной инфекций, борьба с которыми представляет значительные трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам и особенностями ответных реакций организма.

Особый интерес представляют микоплазменные и уреаплазменные инфекции. Заболевания человека, вызываемые уреаплазмами, объединяют в группу уреаплазмозов человека. Человек является естественным хозяином одиннадцати видов микоплазм. Пять из них, в том числе Ureaplasma urealyticum, патогенны в полном соответствии с постулатами Коха.

Имеются убедительные доказательства этиологической роли уреаплазм при привычных абортах и преждевременных родах. Уреаплазменная инфекция верхних отделов генитального тракта приводит к воспалительным процессам, нарушающим репродуктивную функцию организма. Заселение уреаплазмами эндометрия в 50% случаев приводит к самопроизвольным абортам. Колонизация уреаплазмами фаллопиевых труб может вызвать сальпингит, приводящий к сужению просвета или даже к полной их непроходимости. Имеются данные о серологических подтвержденных случаях внутриутробной респираторной инфекции плода, вызванной уреаплазмами. Таким образом, очевидна необходимость специального обследования всех беременных женщин для выявления случаев урогенитального уреаплазмоза и последующей санации.

Наибольшую диагностическую ценность имеют методы выявления возбудителей и их антигенов. Указанное определяется рядом особенностей урогенитальных инфекций и их возбудителей: их широким распространением и длительностью циркуляции антител после перенесенной инфекции (особенно IgG-антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА)), наличием хронических и латентных форм, частыми микст-инфекциями, высокой серологической гетерогенностью и антигенной изменчивостью, широким спектром перекрестных серологических реакций, низкими титрами специфических иммуноглобулинов при локальных формах инфекций и др. Наиболее простым и надежным является культуральный метод диагностики урогенитальных инфекций.

Из патентной литературы известна "Питательная среда для выделения Ureaplasma urealyticum" Для приготовления среды в 1 л дистиллированной воды вносят, г/л: питательный бульон 20-27, экстракт кормовых дрожжей 3-8; цистин 0,1-0,2; мочевина 0,01-0,05; тиаминбромид 0,003-0,007; бромкрезоловый пурпурный 0,01-0,03 и калий фосфорнокислый 6-10. Смесь кипятят и стерилизуют. После стерилизации в остывшую среду вносят лошадиную сыворотку 150-250 г и амфотерицин В 30-70 ед. Среда имеет рН 5,4-5,8, чувствительность 10^-5 ЦИЕ/мл. (См. патент РФ №1495381, 1989)

Также известна "Питательная среда для выделения уреаплазм". Готовят бульон из свежей плаценты, промытой водопроводной водой и освобожденной от оболочек. Плаценту нарезают небольшими кусочками, взвешивают, помещают в кастрюлю, заливают двойным количеством водопроводной воды и кипятят в течение 30 мин. Полученный бульон осветляют и стерилизуют автоклавированием. Берут плацентарного бульона 700-800 г/л, экстракта кормовых дрожжей 3,5-4,5 г/л гидролиза казеина 6-10 г/л, мочевины 0,5-10,0 г/л, лошадиной сыворотки 40-100 г/л, фенолового красного 0020-0025, доливают водой дистиллированной до 1 л. Устанавливают рН 6,0-6,2, разливают во флаконы и лиофильно высушивают. (См. патент РФ №1723128, С 12 Q 1/20, 1992).

Наиболее близким к заявляемому способу является "Способ подсчета, обнаружения и идентификации микоплазм в общем и урогенитальных микоплазм в частности, и биологическая среда, специально приспособленная для этой цели". Способ характеризуется ферментативными реакциями, которые протекают при анаэробных условиях в жидкой среде для выращивания микоплазм, содержащей бульон для культивирования микоплазм, лошадиную сыворотку, ампициллин, бактрим, восстановитель тиогликолят натрия, дрожжевой экстракт, цистеин и аргинин. В качестве цветового индикатора используют феноловый красный. Для создания анаэробных условий, используют парафиновое масло. Анализируя изменение цвета индикатора в течение одного-двух дней делают выводы о наличии микоплазменной инфекции. (См. патент US №5091307, 1992).

Культуральный метод диагностики урогенитальных инфекций, для выявления Ureaplasma urealyticum на селективной жидкой питательной среде является наиболее простым и надежным. Использование этого метода позволяет осуществлять выявление и идентификацию Ureaplasma urealyticum, а также оценивать степень обсемененности исследуемого материала в цветообразующих единицах (ЦОЕ/мл). Последнее особенно важно для клинической оценки этиологии воспалительных процессов. Имеющим этиологическое значение считается концентрация уреаплазм в исследуемом материале не менее 10000 ЦОЕ/мл. Определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам и целенаправленное назначение препаратов существенно повышает эффективность проводимой терапии, что выгодно отличает культуральный метод от других методов диагностики урогенитальных уреаплазмозов (полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунофлюоресценции (РИФ)). Культуральный метод диагностики урогенитальных уреаплазмозов является более достоверным в сравнении с РИФ, более низкая чувствительность и специфичность которой определяется малыми линейными размерами этих микроорганизмов, выраженной их гетерогенностью и изменчивостью, часто встречающейся низкой концентрацией уреаплазм в первичном материале и, соответственно, необходимости их накопления для выявления, сложностью взятия качественного соскоба для этой реакции.

Разработана технология получения селективной питательной среды, что дает возможность проведения идентификации выделенных культур уреаплазм и оценки их количества (титра) в образцах. При разработке были получены оптимальные соотношения компонентов селективной жидкой питательной среды для выявления Ureaplasma urealyticum, что привело к повышению ее чувствительности.

Среда обеспечивает рост Ureaplasma urealyticum, сопровождающийся изменением цвета среды за счет проявления ферментативной активности, и тормозит рост сопутствующих грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов.

Питательная среда для выявления Ureaplasma urealyticum, содержит питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду. Отличается тем, что, в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок - антибиотики; при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

- сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems" США, кат. №237500, 2002 г.) 18-22- триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709,2002 г.) 8-12- дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) 3-4- среда 199 сухая ("Sigma", кат. №М5017, 2002 г.) 4,7-5,2- L-цистеина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №8277, 2002 г.) 0,10-0,15- мочевина ("Sigma", США, кат. № U 4128, 2002 г.) 0,40-0,60- индикатор - феноловый красный ("Sigma", США, кат. №Р 5530, 2002 г) 0,04-0,07- сыворотка лошадиная 0,25-0,30- селективные добавки - антибиотики 0,63-1,25- дистиллированная вода остальное

Питательная среда содержит селективные добавки - антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

- ампициллина натриевая соль 0,50-1,00- ванкомицина гидрохлорид 0,10-0,20- полимиксин В сульфат 0,01-0,02- амфотерицин В 0,01-0,02- линкомицина гидрохлорид 0,02-0,03

В предложенном составе питательной среды представлено оптимальное количественное соотношение компонентов, концентрация антибиотиков и индикаторного красителя. Предложенный способ диагностики инфекций, вызываемых Ureaplasma urealyticum, включает введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний в лунки культурального планшета, исследуемого материала и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. В качестве питательной среды используют:

питательную среду, содержащую питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду, в качестве питательной основы - сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок - антибиотики. Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление, так и идентификацию возбудителей, определить степень обсемененности и спектр чувствительности к различным антибактериальным препаратам, оценить эффективность проведенного лечения.

Использование заявляемого состава питательной среды позволяет упростить состав, повысить скорость и точность способа диагностики уреаплазменной инфекции за счет повышения чувствительности среды.

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №237500, 2002 г.) - 18-24 г, триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.) - 8-12 г, дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) - 3-4 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.) - 4,7-5,2 г, L-цистеина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №8277, 2002 г.) - 0,1-0,15 г, мочевину ("Sigma", США, кат. № U 4128, 2002 г.) - 0,4-0,6 г, феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р 5530, 2002 г.) - 0,04-0,07 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250-300 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль - 0,5-1,0 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,1-0,2 г, полимиксин В сульфат - 0,01-0,02 г, амфотерицин В - 0,01-0,02 г, линкомицина гидрохлорид - 0,02-0,03 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Пример 1.

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №237500, 2002 г.) - 18 г, триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.) - 8 г, дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) - 3 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.) - 4,7 г, L-цистеина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №8277, 2002 г.) - 0,1 г, мочевину ("Sigma", США, кат. № U 4128, 2002 г.) - 0,4 г, феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р 5530, 2002 г.) - 0,04 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль - 0,5 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,1 г, полимиксин В сульфат - 0,01-0,02 г, амфотерицин В - 0,01 г, линкомицина гидрохлорид - 0,02 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Пример 2 (оптимальный).

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №237500, 2002 г.) - 20 г, триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.) - 10 г, дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат, №211929, 2002 г.) - 3 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.) - 4,95 г, L-цистеина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №8277, 2002 г.)- 0,125 г, мочевину ("Sigma", США, кат. № U 4128, 2002 г.) - 0,5 г, феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р 5530, 2002 г.) - 0,05 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль - 0,75 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,15 г, полимиксин В сульфат - 0,01-0,02 г, амфотерицин В - 0,015 г, линкомицина гидрохлорид - 0,025 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Пример 3.

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №237500, 2002 г.) - 24 г, триптозу ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.) - 12 г, дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) - 4 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.) - 5,2 г, L-цистеина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №8277, 2002 г.) - 0,15 г, мочевину ("Sigma". США, кат. № U 4128, 2002 г.) - 0,6 г, феноловый красный ("Sigma", США, кат. № P 5530, 2002 г.) - 0,07 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 300 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль - 1 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,2 г, полимиксин В сульфат - 0,01-0,02 г, амфотерицин В - 0,02 г, линкомицина гидрохлорид - 0,03 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Селективная питательная среда должна обеспечивать рост Ureaplasma urealyticum, сопровождающийся изменением цвета среды с желтого на красный за счет проявления уреазной активности, и тормозить рост сопутствующих микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов). Способ диагностики урогенитальных микроплазмозов.

1. Разморозить питательную среду при комнатной температуре или на водяной бане при температуре 40°С-45°С.

2. Внести по 0,225 мл питательной среды в 4 последовательные лунки культурального 96-луночного планшета (или 4 микропробирки на 1,5 мл или 0,5 мл), промаркировать лунки планшета (микропробирки): первую. - 3, вторую - 4, третью - 5, четвертую - 6.

3. Суспендировать на вортексе исследуемый образец.

4. Сделать серию 10-кратных разведений исследуемого образца в питательной среде: внести 0,25 мл исследуемого образца в лунку (микропробирку) 3, тщательно пипетировать, перенести 0,25 мл из полученного разведения в следующую лунку (микропробирку) и повторить процедуру разведения.

5. В 4 последовательные лунки культурального планшета (микропробирки), обозначенные "К-" внести по 0,200 мл питательной среды и провести процедуру 10-ти кратного разведения, как описано в п.4, используя вместо исследуемого образца транспортную среду.

6. В каждую лунку планшета (микропробирку) внести по 0,70 мл стерильного минерального масла для создания анаэробных условий.

7. Планшет (микропробирки) помещают в термостат и инкубируют при температуре (37±1)°С.

8. Регистрацию результатов проводят на третьи сутки инкубации в термостате при ежедневном визуальном просмотре посевов и о степени обсемененности материала судят по изменению цвета питательной среды.

В качестве транспортной среды используют среду при следующем соотношении ингредиентов,: г/л:

- сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems" США, кат. №237500, 2002 г.) 18-22- триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709,2002 г.) 8-12- дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211929, 2002 г.) 3-4

- среда 199 сухая ("Sigma", кат. №М5017, 2002 г.) 4,7-5,2

- L-цистеина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. №8277, 2002 г.) 0,10-0,15- индикатор - феноловый красный ("Sigma", США, кат. №Р 5530, 2002 г) 0,04-0,07- сыворотка лошадиная 0,20-0,30- ампициллина натриевая соль 0,50-1,00- ванкомицина гидрохлорид 0,10-0,20- полимиксин В сульфат 0,01-0,02- амфотерицин В 0,01-0,02- дистиллированная вода остальное

Для проведения диагностики используется следующий клинический материал:

- соскоб клеток слизистой уретры, цервикального канала, влагалища;

- первая порция утренней мочи (осадок, полученный центрифугированием 10 мл первой порции утренней мочи);

- секрет предстательной железы (V - 0,50-0,10 мл), эякулят (V - 0,50-0,10 мл).

Ключевым моментом в диагностике возбудителей урогенитальных микоплазмозов являются взятие исследуемого материала и условия его хранения. Необходимо:

1) брать материал до начала проведения антибактериальной терапии;

2) процедура взятия материала должна быть стандартной;

3) важно получить достаточное количество клеток, поскольку уреаплазма является микроорганизмом, колонизирующим клеточную поверхность;

4) не использовать при взятии материала местных антисептиков;

5) тщательное удаление слизи из цервикального канала;

6) взятие уретральных образцов следует проводить не ранее чем через 2-3 - часа после мочеиспускания;

7) получение секрета предстательной железы и эякулята проводят непосредственно после мочеиспускания;

8) исследуемый материал помещают в специальную транспортную среду, наилучшим образом обеспечивающую сохранение жизнеспособности уреаплазм.

Табл.1
Условия хранения образцов.Условия храненияМаксимальн. продолжительность хранения, час.При комнатной температуре от 18°С до 24°С 5В холодильной камере (на нижней полке холодильника) при температуре от 2°С до 6°С 96

Табл.2
Интерпретация результатов.Результаты
+ - есть рост Ureaplasma urealyticum
- - отсутствие роста Ureaplasma urealyticumИнтерпретацияЛунка(пробирка)Выявление Ureaplasma urealyticumОбсемененность исследуемого образца ЦОЕ (цветообразующих единиц)/мл образца3456----He выявлено +---Обнаружено10³++--Обнаружено10⁴+++-Обнаруженою⁵++++Обнаружено10⁶-+++Обнаружено10⁶

Учет результатов.

Учет результатов проводят путем визуального просмотра засеянных планшетов (пробирок). Рост Ureaplasma urealyticum наблюдается в течение 48-72 часов. Рост Ureaplasma urealyticum сопровождается изменением цвета питательной среды с желтого на красный, без помутнения, за счет проявления уреазной активности, образования аммиака и сдвига рН. Рост отмечается на вторые сутки инкубации. В случае низкой обсемененности материала изменение цвета среды происходит на третьи сутки.

Табл.3
Среда для выявления Ureaplasma urealyticumпитательная средачисло произведенных посевовчисло выделенных культурабсолютное значение%известная1977638,6предлагаемая1978744,2Табл.4
Рост Ureaplasma urealyticum при посеве исследуемого материала в разных разведенияхразведение исследуемого материала (посевная доза)рост на известной средерост на предлагаемой среде10^-3768710^-4768710^-5698710^-65072

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Ureaplasma urealyticum и диагностики урогенитальных уреаплазозов путем выделения уреаплаз из клинического материала. Питательная среда Ureaplasma urealyticum содержит питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду. В качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок - антибиотики. Предложенный способ диагностики инфекций, вызываемых Ureaplasma urealyticum, включает введение питательной среды вышеоговоренного качественного и количественного состава компонентов, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний в лунки культурального планшета, исследуемого материала и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление, так и идентификацию возбудителей, определить степень обсемененности и спектр чувствительности к различным антибактериальным препаратам, оценить эффективность проведенного лечения. Использование питательной среды позволяет упростить состав, повысить скорость и точность способа диагностики уреаплазменной инфекции за счет повышения чувствительности среды. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Питательная среда для выявления Ureaplasma urealyticum, содержащая питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок - антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 237500, 2002 г.)18-22Триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211709, 2002 г.)8-12Дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211929, 2002 г.)3-4Среда 199 сухая ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.)4,70-5,20

L-Цистеина гидрохлорид

("Sigma", США, кат. № 8277, 2002 г.)0,10-0,15Мочевина ("Sigma", США, кат. № U 4128, 2002 г.)0,40-0,60Индикатор-феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р 5530, 2002 г.)0,04-0,07Сыворотка лошадиная0,25-0,30Селективные добавки - антибиотики0,63-1,25Дистиллированная водаОстальное

Ампициллина натриевая соль0,50-1,00Ванкомицина гидрохлорид0,10-0,20Полимиксин В сульфат0,01-0,02Амфотерицин В0,01-0,02Линкомицина гидрохлорид0,02-0,03

Сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 237500, 2002 г.)18-22Триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211709, 2002 г.)8-12Дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211929, 2002 г.)3-4Среда 199 сухая ("Sigma", кат. № М5017, 2002 г.)4,70-5,20L-Цистеина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. № 8277, 2002 г.)0,10-0,15Мочевина ("Sigma", США, кат. № U 4128, 2002 г.)0,40-0,60Индикатор-феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р 5530, 2002 г.)0,04-0,07Сыворотка лошадиная0,25-0,30Ампициллина натриевая соль0,50-1,00Ванкомицина гидрохлорид0,10-0,20Полимиксин В сульфат0,01-0,2Амфотерицин В0,01-0,02Линкомицина гидрохлорид0,02-0,03Дистиллированная водаОстальное

вносят в лунки культурального планшета транспортную среду, маркируют лунки планшета; суспендируют на вортексе исследуемый образец материала, делают серию 10-кратных разведении исследуемого образца в питательной среде и повторяют процедуру разведения; в обозначенные контрольные лунки культурального планшета вносят питательную среду и проводят процедуру разведения с использованием транспортной среды; в каждую лунку планшета вносят стерильное минеральное масло, создающее анаэробные условия; планшет помещают в термостат и инкубируют при температуре (37±1)°С; регистрацию результатов проводят на третьи сутки инкубации в термостате при ежедневном визуальном просмотре посевов.

Сердечно-мозговая вытяжка ("Becton Dickinson microbiology systems" США, кат. № 237500, 2002 г.)18-22Триптоза ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. №211709, 2002 г.)8-12Дрожжевой экстракт ("Becton Dickinson microbiology systems", США, кат. № 211929, 2002 г.)3-4Среда 199 сухая ("Sigma", кат. № M5017, 2002 г.)4,70-5,20L-Цистеина гидрохлорид ("Sigma", США, кат. № 8277, 2002 г.)0,10-0,15Индикатор-феноловый красный ("Sigma", США, кат. № Р 5530, 2002 г.)0,04-0,07Сыворотка лошадиная0,25-0,30Ампициллина натриевая соль0,50-1,00Ванкомицина гидрохлорид0,10-0,20Полимиксин В сульфат0,01-0,02Амфотерицин В0,01-0,02Дистиллированная водаОстальное