СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, преимущественное применение найдет в биохимии и токсикологии и может быть использовано для определения токсичности лекарственных препаратов и химических веществ.

Известен способ определения токсичности биологически активных веществ путем введения испытуемых веществ группе подопытных животных и выявления среднесмертельной дозы препарата [1].

Однако известный способ не позволяет точно определить предельно допустимую концентрацию химических веществ.

Известен способ определения токсичности химических веществ путем введения лабораторным животным (мышам) одновременно гидрокортизона и токсического агента с последующим определением активности тирозинаминотрансферазы печени черта 4-8 часов после введения [2].

Недостатком известного способа является его продолжительность, т.e. не менее 8 часов эксперимента, а также сочетанное введение химических веществ.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения токсичности химических веществ [3]. Сущность известного прототипа заключается в определении в гомогенате тканей печени лабораторных животных активности фермента ацилазы (N - ацил - DL - аминокислота - аминогидролазы К.Ф. 3.5.1.14.) через 2-4 часа после введения животным токсического вещества. О токсичности вещества судят по достоверному снижению уровня активности фермента по сравнению с контролем.

Целью изобретения является сокращение времени исследования токсичности химических веществ.

Для достижения поставленной цели проводится:

1. Введение токсического агента лабораторным животным.

2. Экспозиция, обеспечивающая развитие токсического действия (30-90 минут).

3. Забой животных, извлечение печени и приготовление гомогената ее тканей.

4. Определение активности фермента лецитин: холестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ, К.Ф. 2.3.1.43) в тканях печени по следующей методике: через 30 минут после инкубации рабочей смеси с 0,1 мл исследуемой жидкости при 37°С из нее хлороформ - этанолом экстрагировали липиды, пробы наносили на пластинки Siluphol (Чехия) размером 8×100 мм и проводили одномерную восходящую хроматографию до фронта 80 мм. В качестве контроля использовали экстракт рабочего раствора, инкубированный в тех же условиях без добавления исследуемой жидкости. Для определения ферментативной активности пластинку разрезали пополам (0-50 мм, где остаются субстраты и 50-100 мм, куда продвигаются при хроматографировании эфиры холестерина), счищали носитель с липидами в 2 пробирки, содержащие по 5 мм 10% раствора фосфорномолибденовой кислоты, и нагревали до 80°С в водяной бане. Активность ЛХАТ рассчитывали по формуле:

где Е₀ и Е₁ - экстинции, пропорциональные содержанию липидов в начальной и конечной половинках пластинки;

5000 - пересчетный коэффициент.

Р - концентрация белка в гомогенате.

Пример 1. Группе беспородных белых мышей самцов массой 18-20 г внутрибрюшинно вводился эндотоксин (фирма "Sigma", США S.eridens) в дозе 10 мг/кг веса. Контрольной группе животных вводился физиологический раствор. Опытная группа состояла из 50 животных. Контрольная - 35. Затем животные забивались через 30, 60, 90, 120, 180 минут соответственно. У животных бралась печень, приготовлялся гомогенат тканей органа, в котором определялась активность фермента ацилазы [3] и ЛХАТ по описанной выше методике. Статистическая обработка проводилась по методам вариационной статистики с учетом коэффициента Стьюдента. Результаты эксперимента отражены в табл. №1, 2.

Пример 2. Группе беспородных белых мышей самцов массой 21-23 г внутрибрюшинно вводился тетрахлорметан (ТХМ) в растворе в дозах 1 мл/кг, 4 мл/кг веса. Контрольной группе вводился физиологический раствор. Опытная группа состояла из 50 животных на каждую дозировку вводимого вещества. Затем животные забивались, из печени их готовился тканевой гомогенат, в котором определяли активность ферментов ЛХАТ и ацилазы. Статистическая обработка проводилась аналогичным образом. Данные эксперимента приведены в таблицах №1, 2.

Сущность заключается в использовании другого информативного теста, что и позволяет сократить время исследования токсичности химических веществ, оценить опасность данного вещества на организм и определить степень влияния исследуемого агента на ткани печени и в целом на живой организм.

Данный способ может быть использован в медицине (токсикологии, фармакологии).

Литература:

1. Саноцкий И.В. "Методы определения токсичности и опасности химических веществ", М., 1970.

2. Авторское свидетельство СССР №1163264, МКИ³ G 01 N 33/48; 23.06.85.

3. Авторское свидетельство СССР №1686376, МКИ³ G 01 N 33/68, 23.10.91.

Таблица №1.
Активность ЛХАТ печени при токсическом воздействии.Вещество30 мин60 мин90 мин120 мин180 мин n=10n=10n=10n=10n=10Эндотоксин10,18+0,3*8.68+0,17*7.82+0,2*7.29+0,24*6.87+0,31*ТХМ в дозе:     1 мл/кг10.71+0,27*9.07+0.15*8.17+0,2*6.37+0,31*5.92+0,33*4 мл/кг9.82+0,29*8,14+0,19*7.32+0,27*5.97+0,38*5.47+0.41*Контрольn=7n=7n=7n=7n=7 14.25+0,314.06+0,414.41+0,2214,32+0,3114.17+0,6n - число животных в эксперименте (группе). Активность фермента ЛХАТ выражалась в мк Кат/г белка.* - р<0.05.

Таблица №2.
Активность ацилазы печени при токсическом воздействии.Вещество30 мин60 мин90 мин120 мин180 мин n=10n=10n=10n=10n=10Эндотоксин3.14+0,333.11+0,352.83+0,461.21+0,24*1.93+0,18*ТХМ в дозе:     1 мл/кг3.17+0,442.93+0,372.51+0,41.21+0,23*1.295+0,26*4 мл/кг3.23+0.312.89+0,252.74+0,371.19+0,25*1,41+0,33*Контрольn=7n=7n=7n=7n=7 3,5+0,293,2+0,313.0+0,422,9+0,443,3+0,25n - число животных в эксперименте (группе). Активность фермента ацилазы выражалась в ЕД фермента/мг белка.* - р<0.05.

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к биохимии и токсикологии, а именно к способу определения токсичности лекарственных препаратов и химических веществ. Способ включает введение лабораторным животным токсического агента, забой животных, приготовление гомогената ткани печени с последующим определением активности фермента, отличающийся тем, что определяют активность фермента лецитин: холестеринацил-трансферазы и по снижению уровня активности фермента в течение 30-180 минут после введения вещества по сравнению с контролем судят о токсичности вещества. Технический результат: сокращение времени исследования токсичности химических веществ. 2 табл.

Способ определения токсичности химических веществ, включающий введение лабораторным животным токсического агента, забой животных, приготовление гомогената ткани печени с последующим определением активности фермента, отличающийся тем, что определяют активность фермента лецитин: холестеринацил-трансферазы и по снижению уровня активности фермента в течение 30-180 мин после введения вещества по сравнению с контролем судят о токсичности вещества.