СПОСОБ НАКОПЛЕНИЯ ЛИСТЕРИОЗНОГО МИКРОБА (LISTERIA MONOCYTOGENES) Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью Listeria monocytogenes морской воды и морепродуктов.

Водная среда является одной из экологических ниш обитания L.monocytogenes. Начиная с конца 80-х годов и до настоящего времени в ряде стран Европы и Америки были отмечены многочисленные вспышки листериоза у людей, связанные с употреблением в пищу инфицированных морских продуктов. В связи с этим проблема изоляции штаммов листериозного микроба из морской среды является достаточно актуальной.

Очень низкая концентрация листерий по сравнению с количеством сопутствующей сапрофитной микрофлоры в исследуемых образцах затрудняет выделение возбудителя методом прямого высева на дифференциально-диагностическую среду. Для увеличения количества листериозного микроба в исследуемых образцах используют способ накопления культуры возбудителя на средах обогащения.

Известен способ накопления листериозного микроба при температуре 4-6°С в течение 14 суток на среде обогащения - фосфатно-солевом буфере (ФСБ) [Беленева И.А. Автореф. дис. канд. биол. наук. - Владивосток, 1996. - 197 с.]. Среду готовят на основе дистиллированной воды с добавлением NaH₂PO₄ безводн. - 2,3 г/л и Na₂HPO₄ безводн. - 12,5 г/л, NaCl - 5,8 г/л, рН 7,4. Т.к. накопление культуры проводится при температуре 4-6°С, этот способ получил название «холодовое» обогащение.

Принцип метода заключается в том, что при выдерживании исследуемых образцов, отобранных из теплокровного организма, на «холоде» происходит подавление сопутствующей мезофильной микрофлоры. В условиях отсутствия конкурентной микрофлоры листерии, обладающие психрофильными свойствами, активно размножаются, что приводит к увеличению концентрации возбудителя в исследуемом материале. Учитывая тот факт, что в образцах, отобранных из морской среды, сопутствующей микрофлорой являются психрофильные микроорганизмы, метод «холодового» обогащения является неэффективным.

Недостатками данного метода являются:

1. Отсутствие фактора, сдерживающего размножение сопутствующей психрофильной флоры.

2. Невозможность изолировать штаммы L.monocytogenes из морской среды в неизмененном (природном) виде при использовании неадаптированной среды обогащения, из-за известной изменчивости листериозного микроба.

3. Неполное выявление и учет внеорганизменных популяций L.monocytogenes из морской среды.

Задачей данного изобретения является более полное выявление и учет внеорганизменных популяций листерий, обитающих в морской среде, за счет сдерживания размножения сопутствующей психрофильной флоры и предотвращение изменчивости листериозного микроба.

Достигается это тем, что накопление листериозного микроба в исследуемых образцах, отобранных из морской среды, проводится при температуре 18-20°С в течение 14 суток на среде обогащения для L.monocytogenes, включающей в себя растворитель и питательную основу. В качестве растворителя используют стерильную морскую воду, а в качестве питательной основы - минеральные соли при следующем соотношении компонентов в маточных растворах, мг/л дистиллированной воды:

Раствор №1:

NaH₂PO₄ - 10

NaNO₃ - 150

Раствор №2:

Na₂SiO₃×9Н₂О - 30-60

Раствор №3:

CuSO₄×5H₂O - 0,0196

ZnSO₄×7H₂O - 0,044

CoCl₂×6Н₂O - 0,020

MnCl₂×4H₂O - 0,360

Na₂MoO₄×2H₂O - 0,0126

Раствор №4:

Na₂EDTA - 6,8

Раствор №5:

FeCl₃×6Н₂O - 5,3

Причем 1 литр среды обогащения состоит из маточных растворов в следующем количестве:

Раствор №1 - 0,5-2 мл

Раствор №2 - 0,5-2 мл

Раствор №3 - 0,5-2 мл

Раствор №4 - 0,5-2 мл

Раствор №5 - 0,5-2 мл,

Остальное - стерильная морская вода

Существенными признаками предложения следует считать накопление листериозного микроба при температуре 18-20°С, что обеспечивает подавление сопутствующей психрофильной микрофлоры в исследуемых образцах; применение среды обогащения, отличной от известной по качественному и количественному составу.

Выход за пределы заявленных значений компонентов среды приводит либо к перерасходу используемых реактивов, либо к снижению ростовых показателей среды и появлению нежелательной изменчивости листериозного микроба.

Пределы содержания минеральных веществ и витаминов в питательной основе предлагаемой среды обогащения являются оптимальными и обусловливают относительную сбалансированность стоимости среды с ее ростовыми характеристиками.

Использование морской воды в качестве растворителя позволяет избежать изменения биологических свойств выделяемых штаммов, изначально обитающих в морской среде, и увеличивает вероятность обнаружения листериозного микроба в исследуемых образцах.

Способ осуществляют следующим образом. В среду обогащения вносят исследуемый материал (морская вода, ил, содержимое кишечника гидробионтов и т.д.) в соотношении 1:1. Инокулированную среду инкубируют при температуре 18-20°С в течение 14 суток. После чего исследуемый материал высевают на плотные дифференциально-диагностические среды для L.monocytogenes.

Для приготовления среды обогащения сначала готовят маточные растворы, мг/л дистиллированной воды:

Раствор №1:

NaH₂PO₄ - 10

NaNO₃ - 150

Раствор №2:

Na₂SiO₃×9H₂O - 30-60

Раствор №3:

CuSO₄×5H₂O - 0,0196

ZnSO₄×7H₂O - 0,044

CoCl₂×6Н₂O - 0,020

MnCl₂×4H₂O - 0,360

Na₂MoO₄×2Н₂O - 0,0126

Раствор №4:

Na₂EDTA - 6,8

Раствор №5:

FeCl₃×6Н₂O - 5,3

Перед внесением в среду обогащения маточные растворы стерилизуют давлением при 1-1,5 атм. Морская вода фильтруется через бумажно-ватный фильтр и после пастеризуется при температуре 70-75°С на водяной бане в течение 20 минут трехкратно с промежутком 24 часа.

К маточным растворам в следующих количествах:

Раствор №1 - 0,5-2 мл

Раствор №2 - 0,5-2 мл

Раствор №3 - 0,5-2 мл

Раствор №4 - 0,5-2 мл

Раствор №5 - 0,5-2 мл

добавляют стерильную морскую воду до 1 литра.

Пример

Исследуемый материал (морская вода, ил, содержимое кишечника гидробионтов) вносят в пробирки со средой обогащения в соотношении 1:1 и инкубируют при температуре 18-20°С в течение 14 суток. Затем содержимое пробирок интенсивно встряхивают и производят посев 0,1 мл суспензии на плотную дифференциально-диагностическую среду для L.monocytogenes. Среда обогащения для L.monocytogenes включает в себя следующие компоненты:

Раствор №1 - 1 млСостав раствора №1 мг/л дистиллированной воды: NaH₂PO₄ - 10 NaNO₃ - 150

Раствор №2 - 1 млСостав раствора №2, мг/л дистиллированной воды: Na₂SiO₃×9H₂O - 30-60Раствор №3 - 1 млСостав раствора №3, мг/л дистиллированной воды: CuSO₄×5H₂O - 0,0196 ZnSO₄×7H₂O - 0,044 CoCl₂×6Н₂О - 0,020 MnCl₂×4Н₂О - 0,360 Na₂MoO₄×2Н₂О - 0,0126Раствор №4 - 1 млСостав раствора №4, мг/л дистиллированной воды: Na₂EDTA - 6,8Раствор №5 - 1 млСостав раствора №5, мг/л дистиллированной воды: FeCl₃×6Н₂O - 5,3Стерильная морская вода - до одного литра.

Процесс размножения L.monocytogenes (штамм 10 CN, 1/2а серотипа) в заявляемой и известной среде обогащения (ФСБ) представлен на чертеже. За 14 суток культивирования в заявляемой среде обогащения при температуре 18-20°С концентрация L.monocytogenes (штамм 10 CN) увеличилась на 3,6 lg (чертеж, кривая 1). При культивировании на фосфатно-солевом буфере (прототип) за тот же период времени при температуре 4-6°С концентрация листериозного микроба увеличилась на 3,3 lg (чертеж, кривая 2).

Приведенный пример показывает, что предлагаемая среда обогащения по своим ростовым свойствам практически не уступает прототипу. Преимущества предлагаемой среды перед известной, выражаются в возможности изоляции штаммов листериозного микроба в неизмененном (природном) виде, а также способности более полного выявления и учета внеорганизменных популяций листерий, обитающих в морской среде.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью морской среды. Способ накопления листериозного микроба (Listeria monocytogenes) включает культивирование листерий в среде обогащения при температуре 18-20°С, причем среда обогащения содержит растворитель и питательную основу. В качестве растворителя используют стерильную морскую воду, а в качестве питательной основы минеральные соли в маточных растворах, мг/л дистиллированной воды, причем 1 литр среды обогащения состоит из 5 маточных растворов и стерильной морской воды. Изобретение обеспечивает более полное выявление и учет внеорганизменных популяций листерий, обитающих в морской воде. 1 ил.

Способ накопления листериозного микроба (Listeria monocytogenes), включающий культивирование листерий в среде обогащения, отличающийся тем, что накопление бактерий проводят при температуре 18-20°С, а среда обогащения содержит растворитель и питательную основу, причем в качестве растворителя используют стерильную морскую воду, а в качестве питательной основы - минеральные соли, и при следующем соотношении компонентов в маточных растворах, мг/л дистиллированной воды:

Раствор №1:

NaH₂PO₄ - 10

NaNO₃ - 150

Раствор №2:

Na₂SiO₃·9H₂O - 30-60

Раствор №3:

CuSO₄·5H₂O - 0,0196

ZnSO₄·7H₂O - 0,044

CoCl₂·6Н₂O - 0,020

MnCl₂·4H₂O - 0,360

Na₂MoO₄·2H₂O - 0,0126

Раствор №4:

Na₂EDTA - 6,8

Раствор №5:

FeCl₃·6Н₂O - 5,3,

причем 1 л среды обогащения состоит из маточных растворов в следующем количестве:

Раствор №1 - 0,5-2 мл

Раствор №2 - 0,5-2 мл

Раствор №3 - 0,5-2 мл

Раствор №4 - 0,5-2 мл

Раствор №5 - 0,5-2 мл

Остальное - стерильная морская вода.