СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА ЛИСТЕРИЙ (LISTERIA MONOCYTOGENES) В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в качестве питательной среды при санитарно-гигиеническом контроле за инфицированностью Listeria monocytogenes почв, растений и продуктов питания.

Известен способ приготовления питательной среды для культивирования иерсиний на основе растительных продуктов (Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии. Тех. Конф. 4.1. Махачкала, с.108-109). При изготовлении питательной среды в качестве продуктов растительного продукта используют гидролизат белка пшеничных отрубей.

Недостатками этой среды является неадаптированность к росту внеорганизменных популяций бактерий и смывов с овощей, хотя в качестве питательной основы здесь используют продукт растительного происхождения - отруби пшеничные, однако их применяют в виде гидролизата и в сочетании с продуктами животного происхождения - автолизата селезенки. В результате этого среда является трудоемкой, дорогостоящей и не приспособленной для роста внеорганизменных популяций бактерий, так как длительно существующие в окружающей среде бактерии могут подвергаться изменчивости, плохо формировать колонии на средах, содержащих продукты животного происхождения.

Наиболее близкой к заявляемому техническому решению является способ приготовления питательной среды для культивирования и количественного учета иерсиний и листерий в объектах внешней среды (Патент RU №2161655, МКИ С 27 С 1/04, С 12 N 1/20 от 10.11.1998; Бузолева Л.С., Сомов Г.П.). Питательная среду готовят из отваров отрубей ржаных, капусты и моркови, а также соли фосфатного буфера.

Недостатком этой среды является трудоемкость ее приготовления и многокомпонентность.

При создании изобретения - способа приготовления питательной среды для культивирования и количественного учета листерий в объектах внешней среды ставилась задача: повышение диагностической эффективности питательной среды для более полного выявления внеорганизменных популяций бактерий, упрощение технологии ее приготовления, удешевление среды и расширение сырьевой базы.

Задача решается за счет того, что для приготовления питательной среды для культивирования и количественного учета листерий в объектах внешней среды используют питательную основу из продукта растительного происхождения, фосфатный буфер с рН 7,4 и агар в количестве 10-15 г, причем в качестве продукта растительного происхождения используют силос кукурузный, при этом питательную основу готовят путем настаивания его в фосфатном буфере с рН 7,4 в течение 10-12 часов при комнатной температуре при следующем соотношении компонентов, г/л:

Силос кукурузный 50-150,

Фосфатный буфер с рН 7,4 Остальное

Полученный настой фильтруют, дважды по 20-30 мин стерилизуют текучим паром, охлаждают и добавляют к агару до 1 л.

Существенными признаками предложения следует считать получение питательной среды, отличной от известной по качественному и количественному составу.

Получаемая питательная среда отличается малокомпонентностью, исключительной дешевизной и простотой приготовления.

Пределы содержания компонентов и времени настаивания в предлагаемой питательной среде являются оптимальными и обуславливают относительную сбалансированность стоимости среды с ее ростовыми характеристиками. Использование силоса позволяет избежать изменения биологических свойств выделяемых штаммов, изначально обитающих в почвенной экосистеме, и увеличивает вероятность обнаружения листериозного микроба в исследуемых образцах.

Применение силоса кукурузного обеспечивает питательной среде необходимое количество органических, минеральных веществ, а также определенный набор витаминов. Кроме того, кукуруза является природным субстратом жизнеобитания листерий в естественных условиях.

Настаивание силоса кукурузного в фосфатном буфере с рН 7,4 способствует более быстрому разрушению оболочек клеток и выходу органических веществ в раствор.

Выход за пределы заявленных значений компонентов приводит либо к перерасходу продукции, либо к снижению ростовых свойств среды.

Настаивание силоса кукурузного в течение 10-12 часов позволяет полностью извлечь из силоса необходимые органические вещества. При настаивании смеси менее 10 часов не происходит полный выход органических веществ из силоса в раствор, а при настаивании более 12 часов существенных изменений в сторону увеличения количества органических веществ и соответственно повышения диагностической эффективности питательной среды не наблюдается.

Стерилизация настоя текучим паром дважды по 20-30 мин позволяет избавиться от сопутствующих микроорганизмов. В результате полученный настой можно готовить впрок и использовать по мере надобности.

При стерилизации настоя один раз и меньше 20 мин не удается избавить его от сопутствующих микроорганизмов, а при стерилизации настоя больше двух раз и 30 мин существенных изменений не происходит.

Данные приемы значительно упрощают технологию изготовления питательной среды, а также значительно удешевляют ее по отношению к прототипу.

Применение агара микробиологического в количестве 10-15 г обеспечивает питательной среде плотную основу для формирования колоний.

Способ осуществляется следующим образом.

Для приготовления 1 л питательной среды сначала готовят настой из силоса кукурузного. Настой готовят следующим образом:

1. Готовят фосфатный буфер. Для приготовления 1 л фосфатного буфера берут натрий фосфорнокислый двузамещенный 8,7 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 2,7 г/л, доводят до 1 л дистиллированной водой, устанавливают рН 7,4. Буфер фосфатный готовят на основе стерильной воды.

2. К 50-150 г измельченного кукурузного силоса добавляют до 1 л фосфатный буфер с рН 7,4, смесь настаивают 10-12 часов, затем отфильтровывают через ватно-марлевый фильтр. Готовый настой стерилизуют текучим паром дважды по 20-30 мин.

Настой можно готовить впрок, хранить в холодильнике, использовать по мере необходимости.

Для приготовления 1 л. питательной среды берут 10-15 г агара микробиологического и добавляют до 1 л полученный настой.

Примеры конкретного выполнения

Пример №1

Для приготовления 1 л питательной среды сначала готовят настой для питательной среды. Для этого берут 100 г измельченного кукурузного силоса и добавляют к нему фосфатного буфера с рН 7,4 до 1 л, настаивают 11 часов, затем отфильтровывают через ватно-марлевый фильтр. Готовят буфер фосфатный рН 7,4 на основе стерильной воды. Для приготовления фосфатного буфера берут натрий фосфорнокислый двузамещенный 8,7 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный 2,7 г/л, до 1 л дистиллированная вода, устанавливают рН 7,4. Готовый настой стерилизуют текучим паром дважды при 100°С по 25 мин. Настой можно готовить впрок, хранить в холодильнике, использовать по мере необходимости.

Затем к 10 г агара добавляют до 1 л полученный настой. И получают питательную среду для культивирования и количественного учета листерий (Listeria monocytogenes) в объектах внешней среды.

Полученная питательная среда слегка опалесцирует, темно-кремового цвета, не имеет запаха, рН среды 7,4.

На приготовленную среду высевают листерии в физиологическом растворе 10² КОЕ/мл.

За сутки культивирования количество колоний листерий составило 400±50.

Пример 2 аналогичен примеру №1, однако кукурузного силоса берут в количестве 150 г, смесь выдерживают в течение 12 часов, а агара используют 15 г.

Полученная питательная среда слегка опалесцирует, темно-кремового цвета, не имеет запаха, рН среды 7,4.

На приготовленную среду высевают листерии в физиологическом растворе 10² КОЕ/мл.

За сутки культивирования количество колоний листерий составило 42±11.

Пример 3 аналогичен примеру №1, однако кукурузного силоса берут в количестве 50 г, смесь выдерживают в течение 12 часов, а агара используют 15 г.

Полученная питательная среда слегка опалесцирует, темно-кремового цвета, не имеет запаха, рН среды 7,4.

На приготовленную среду высевают листерии в физиологическом растворе 10² КОЕ/мл.

За сутки культивирования количество колоний листерий составило 290±28.

Данные по всем примерам представлены в таблице. В контроле питательной средой для культивирования служили среды СО и питательная среда для культивирования и количественного учета иерсиний и листерий в объектах внешней среды Бузолевой, Сомова.

Приведенные примеры показывают, что предлагаемая питательная среда по своим ростовым свойствам не уступает прототипу. Преимущества предлагаемой среды перед известной выражаются в способности более полного выявления и учета вне организменных популяций листерий, обитающих в почвенных экосистемах. Способ приготовления питательной среды прост, не требует специального оборудования и реактивов. Применение предлагаемой среды для культивирования листериозного микроба в микробиологических исследованиях позволяет снизить себестоимость целевого продукта.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления питательной среды при санитарно-гигиеническом контроле за инфицированностью листериями (Listeria monocytogenes) почв, растений и продуктов питания. Готовят питательную основу из силоса кукурузного, фосфатного буфера с рН 7,4 и агара в количестве 10-15 г. Кукурузный силос настаивают в фосфатном буфере с рН 7,4 в течение 10-12 ч при комнатной температуре при следующем соотношении компонентов, г/л: силос кукурузный 50-150, фосфатный буфер с рН 7,4 остальное. Полученный настой фильтруют, дважды по 20-30 мин стерилизуют текучим паром, охлаждают и добавляют к агару до 1 л. Изобретение обеспечивает повышение диагностической эффективности среды, упрощение технологии ее приготовления и удешевление среды. 1 табл.

Способ приготовления питательной среды для культивирования и количественного учета листерий в объектах внешней среды, содержащей питательную основу из продукта растительного происхождения, фосфатный буфер с рН 7,4 и агар в количестве 10-15 г, отличающийся тем, что в качестве продукта растительного происхождения используют силос кукурузный, причем питательную основу готовят путем настаивания его в фосфатном буфере с рН 7,4 в течение 10-12 ч при комнатной температуре при следующем соотношении компонентов, г/л:

Силос кукурузный 50-150

Фосфатный буфер с рН 7,4 Остальное

полученный настой фильтруют, дважды по 20-30 мин стерилизуют текучим паром, охлаждают и добавляют к агару до 1 л.