СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕЖДУНАРОДНОГО НОРМАЛИЗОВАННОГО ОТНОШЕНИЯ (МНО) ПО ВЕЛИЧИНЕ ПРОТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/49 G01N33/86 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике нарушений системы свертывания крови и контролю антикоагулянтной терапии.

В лабораторной практике известны способы контроля гемостаза по величине протромбинового времени (ПВ), заключающиеся в регистрации времени свертывания нитратной плазмы крови с низким количеством тромбоцитов, т.н. обедненной по тромбоцитам плазмы (ОТП), под действием тромбопластин-кальциевой смеси (1).

К недостаткам метода определения ПВ в ОТП относится наличие этапа центрифугирования крови, усложняющего проведение анализа и способного активировать процесс коагуляции.

Кроме этого, в методе используется относительно большой объем отбираемой у больного венозной крови (5-10 мл), что нежелательно при частом мониторинге системы гемостаза, особенно в педиатрической практике.

Еще одним недостатком этого способа является то, что получаемые результаты могут быть ошибочны, так как не учитывают различную чувствительность применяемых тромбопластинов к сниженной активности факторов VII, Х и II свертывания крови.

Известен способ определения ПВ в капиллярной крови с использованием тромбопластин-кальциевой смеси (2).

Недостатком данного метода является низкая точность измерения ПВ, связанная с отсутствием учета различной чувствительности применяемых тромбопластинов к дефициту факторов протромбинового комплекса, что особенно важно у больных, получающих антикоагулянтную терапию.

Наиболее близким к представленному изобретению является способ определения ПВ капиллярной крови (3).

Способ-прототип осуществляется следующим образом.

Реактивы и оборудование для проведения способа-прототипа

1. 3,8% раствор цитрата натрия.

2. Лиофильно высушенный тромбопластиновый реагент "Техпластин" (производства фирмы "Технология-Стандарт", Барнаул, РФ), стандартизированный по МИЧ.

3. Коагулометр типа Тромбостат-2 фирмы Behnk Electronic.

4. Скарификаторы.

5. Капилляры Панченкова.

6. Пипетки вместимостью 0,1 мл и 5,0 мл.

7. Спирт 70°.

8. Пробирки стеклянные.

9. Стерильные ватные шарики.

Материал для исследования - 180 мкл капиллярной крови, стабилизированной 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1.

Ход определения. Исследуемый образец капиллярной крови больного в объеме 0,1 мл инкубируют 1 минуту в кювете коагулометра при 37°С. Затем вносят 0,1 мл прогретого до температуры 37°С тромбопластин-кальциевого реагента, включают таймер (секундомер) и определяют время свертывания. Аналогично исследуют капиллярную кровь здоровых людей. Результаты оценивают по величине Международного нормализованного отношения (MHO), учитывающей чувствительность применяемых тромбопластинов к дефициту факторов протромбинового комплекса (4) и рассчитываемой по формуле

где МИЧ - Международный индекс чувствительности тромбопластинового реагента - показатель чувствительности тромбопластина к активности факторов протромбинового комплекса и

ПВ контроля - величина ПВ капиллярной крови здорового человека.

Основным недостатком способа-прототипа является погрешность получаемых результатов, не учитывающих влияние величины гематокрита в анализируемой капиллярной крови.

Кроме этого, способ предусматривает проведение определения ПВ в капиллярной крови здоровых доноров для каждого из используемых реагентов тромбопластина, что делает этот способ нестандартным.

Еще одним недостатком прототипа является кратковременность хранения исходного анализируемого материала (не более 1 часа до проведения измерения), что усложняет процесс исследования и может влиять на стандартность получаемых результатов.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и правильности определения MHO по величине ПВ капиллярной крови и стандартизация метода.

В разработанном методе правильность результатов обусловлена учетом величины гематокрита крови обследуемого, достигаемым введением в расчетную формулу MHO коэффициента (К), зависимого от значения гематокрита и равного величине отношения ПВ ОТП к ПВ капиллярной крови. Величину К определяли, измеряя ПВ одномоментно в капиллярной крови и ОТП у 128 больных с вариабельностью значений гематокрита от 0,15 до 0,70.

Результаты представлены на чертеже.

Используемая репрезентативная выборка позволила с помощью статистического метода рассчитать величины К для диапазона значений гематокрита от 0,15 до 0,70. Статистически установленные значения К для конкретной величины гематокрита представлены в таблице.

Таблица
Зависимость величины К от значения гематокритаГематокрит0,150,200,300,350,400,500,600,70К1,201,151,191,071,020,980,940,89

Техническим результатом предлагаемого изобретения является высокая степень точности и правильности определения MHO по величине ПВ капиллярной крови обследуемых за счет введения в расчет MHO в капиллярной крови предварительно математически вычисленного значения зависимого от гематокрита коэффициента К.

Повышение стандартизации предлагаемого метода достигается использованием при расчете MHO величины ПВ нормальной плазмы, представляющей собой пул, полученный из крови, взятой не менее чем у 30 здоровых доноров. Использование для разведения анализируемой пробы капиллярной крови в качестве консервирующего раствора трехзамещенного цитрата натрия позволяет получать стабильный материал, обладающий сниженной вязкостью, что способствует увеличению точности дозирования исследуемых проб и повышению времени сохранения этих проб при комнатной температуре в течение 4-6 часов.

Сущность изобретения заключается в том, что в капиллярной крови больного определяют гематокрит, затем к пробе капиллярной крови обследуемого, разведенной нитратным консервантом в отношении 1:1, добавляют тромбопластин-кальциевую смесь и определяют время образования сгустка. Измерения повторяют дважды с одной и той же пробой крови, рассчитывают среднее значение, соотносят его с величиной ПВ нормальной плазмы, определенной в одномоментном исследовании с той же тромбопластин-кальциевой смесью, и рассчитывают MHO по формуле

где К - коэффициент, зависящий от значения гематокрита,

ПВ_КК - протромбиновое время капиллярной крови,

ПВ_НП - протромбиновое время нормальной плазмы,

МИЧ - Международный индекс чувствительности тромбопластинового реагента.

Способ осуществляют следующим образом.

Реагенты и оборудование.

1. Консервант для капиллярной крови на основе трехзамещенного цитрата натрия.

2. Лиофилизированный реагент тромбопластин-кальциевой смеси ("Ренампластин" производства НПО "Ренам" "Общества Больных Гемофилией", РФ г.Москва) с аттестованной по вторичному Стандарту (производство Dade Bchring) величиной МИЧ. Коагулометр механического или оптического типа (например, Amelung КС 4А micro или bioMerieux Option 4 plus).

3. Пластиковые пробирки с крышкой объемом 0,5 мл (например, пробирки Эппендорф).

4. Капилляры стеклянные с объемом до риски 100 мкл, не обязательно градуированные (например, капилляры Панченкова).

5. Скарификаторы.

6. Пипетки на 0,1 мл и 5,0 мл.

7. Спирт этиловый 70°.

8. Ватные тампоны стерильные.

Получение материала для исследования: нитратный консервант для капиллярной крови набирают до риски (100 мкл) в стеклянный капилляр и переносят в пластиковую пробирку с крышкой. Капиллярную кровь после прокалывания протертой спиртом мякоти пальца и удаления ватным тампоном первой капли крови, содержащей тканевые прокоагулянты, отбирают этим же капилляром до риски (100 мкл), переносят в пластиковую пробирку, содержащую 100 мкл цитратного консерванта, и тщательно перемешивают пилотированием. Полученный материал для исследования может храниться в закрытых крышкой пластиковых пробирках в течение 4-6 часов при комнатной температуре.

Определение ПВ в материале для исследования: в кювету коагулометра с помощью точно откалиброванной микропипетки с переменным объемом до 100 мкл переносят 75 мкл материала для исследования и прогревают в течение двух минут при 37°С. В кювету с прогретым материалом для исследования добавляют 50 мкл предварительно прогретого при 37°С раствора тромбопластин-кальциевой смеси и с этого момента определяют время образования сгустка (по показаниям таймера или секундомера). Измерение ПВ в капиллярной крови одного испытуемого проводят 2 раза, рассчитывают среднее арифметическое и представляют этот результат как искомую величину ПВ, измеренную в секундах. Конечный результат выражают в MHO, величину которого рассчитывают по формуле

где

К - коэффициент, зависящий от значения гематокрита и равный величине отношения ПВ в обедненной по тромбоцитам плазме к ПВ в капиллярной крови,

ПВ_КК - протромбиновое время капиллярной крови,

ПВ_НП - протромбиновое время нормальной плазмы,

МИЧ - Международный индекс чувствительности тромбопластинового реагента.

Пример 1. В стеклянный капилляр до риски (100 мкл) набирают цитратный консервант для капиллярной крови и переносят в пластиковую пробирку с крышкой. Затем в эту же пробирку переносят 100 мкл капиллярной крови, отбираемой тем же капилляром после прокалывания стерилизованной спиртом мякоти пальца обследуемого и удаления ватным тампоном первой капли крови. Полученный материал для исследования тщательно перемешивают пипетированием. Исследуемый образец может храниться до проведения анализа в течение 4-6 часов. В кювету коагулометра типа Amelung КС 4А micro откалиброванной микропипеткой на 0,1 мл с переменным объемом переносят 75 мкл материала для исследования и прогревают при 37°С в течение 2 минут. Затем в эту кювету добавляют 50 мкл предварительно прогретого при 37°С раствора тромбопластин-кальциевой смеси, например "Ренампластин". Приготовление рабочего раствора тромбопластин-кальциевой смеси проводят следующим образом: в флакон с лиофилизированно высушенным тромбопластином вносят 4,0 мл дистиллированной воды и растворяют при покачивании. Рабочий раствор реагента стабилен в течение 5 суток при температуре 2-8°С. Перед использованием рабочий раствор реагента прогревают при 37°С в течение 20 минут и перемешивают покачиванием. В момент внесения тромбопластин-кальциевой смеси по таймеру (секундомеру) определяют время образования сгустка. Измерения проводят два раза, рассчитывают среднее арифметическое, и эту величину представляют как выраженное в секундах значение протромбинового времени капиллярной крови обследуемого. С помощью этой же тромбопластин-кальциевой смеси одномоментно определяют величину протромбинового времени нормальной плазмы. В соответствии со значением гематокрита крови обследуемого выбирают величину коэффициента К по составленной нами таблице. Зная показатель МИЧ для используемого тромбопластина, рассчитывают величину MHO капиллярной крови обследуемого по формуле

где

К - коэффициент, зависящий от значения гематокрита и равный величине отношения ПВ в обедненной по тромбоцитам плазме к ПВ в капиллярной крови,

ПВ_КК - протромбиновое время капиллярной крови,

ПВ_НП - протромбиновое время нормальной плазмы,

МИЧ - Международный индекс чувствительности тромбопластинового реагента.

Пример 2. Больной Б., 70 лет. Диагноз: истинная полицитемия (эритремия). Гематокрит - 0,6.

Для определения MHO по величине ПВ капиллярной крови получали материал для исследования, для чего в пластиковую пробирку с крышкой переносили стеклянным капилляром 100 мкл нитратного консерванта и 100 мкл отобранного тем же капилляром анализируемой капиллярной крови и тщательно перемешивали пилотированием. В кювету коагулометра откалиброванной микропипеткой на 100 мкл с переменным объемом переносили 75 мкл полученного материала для исследования и добавляли 50 мкл предварительно прогретого при 37°С раствора тромбопластин-кальциевой смеси. В этот момент включали секундомер (таймер) и определяли время образования сгустка. Измерения проводили два раза и рассчитывали среднее арифметическое ПВ, которое было равно 19,8 сек. Величина ПВ нормальной плазмы была равна 15,9 сек. Значение К для гематокрита больного составляло 0,94. МИЧ применяемого тромбопластина был равен 1,09. На основании полученных данных величина MHO для капиллярной крови больного Б. была равна МНО=(0,94×19,8/15,9)^1,09=1,19. При параллельном определении ПВ в ОТП рассчитываемая величина MHO для плазмы больного составляла 1,175. Полученные значения MHO для капиллярной крови и ОТП практически между собой не отличалась.

Для предотвращения тромбоза у обследованного больного при указанном заболевании необходимо поддерживать MHO на уровне 2,0-3,0. В связи с этим было принято решение о назначении антикоагулянта варфарина.

Пример 3. Больной К., 54 года. Диагноз: флебит с тромбофлебитом. Гематокрит - 0,4.

Определение MHO для капиллярной крови проводили как изложено в примерах 1 и 2.

До назначения антикоагулянтной терапии величины MHO, определенные параллельно в капиллярной крови и ОТП, были равны 1,087 и 1,033 соответственно. На основании этих данных была назначена антикоагулянтная терапия варфарином, которая способствовала увеличению значения MHO в капиллярной крови и ОТП до 2,56 и 2,55 соответственно и улучшению состояния больного.

ЛИТЕРАТУРА

1. Quick A.J. The prothrombin time in hemophilia and in obstuctive jaundice. J. Biol. Chem., 1935, v.109, p.73.

2. Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований. Ред. В.В.Меньшиков, М., 1977, 27 с.

3. Момот А.П., Тараненко И.А., Мамаев А.Н. Способ контроля лечения непрямыми антикоагулянтами. Патент РФ №2222019 от. 20. 01.2004.

4. Recommended methodology for using WHO International Reference Preparation for Thromboplastin. WHO, Geneva, 1983.

Изобретение относится к лабораторной диагностике нарушений системы свертывания крови и может быть использовано для контроля антикоагулянтной терапии. Сущность способа состоит в том, что в капиллярной крови больного определяют гематокрит, дважды измеряют величину ПВ, рассчитывают среднее значение, соотносят его с величиной ПВ нормальной плазмы и рассчитывают MHO по формуле с учетом коэффициента, зависящего от величины гематокрита и международного индекса чувствительности тромбопластинового реагента. Техническим результатом является повышение точности определения MHO по величине ПВ и стандартизация метода. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Способ определения Международного нормализованного отношения (MHO) по величине протромбинового времени (ПВ) капиллярной крови, включающий определение ПВ капиллярной крови, стабилизированной нитратным консервантом, под действием тромбопластинкальциевой смеси, отличающийся тем, что в капиллярной крови больного определяют гематокрит, дважды измеряют величину ПВ, рассчитывают среднее значение, соотносят его с величиной ПВ нормальной плазмы и рассчитывают MHO по формуле

где К - коэффициент, зависящий от величины гематокрита;

ПВ_кк - протромбиновое время капиллярной крови;

ПВ_нп - протромбиновое время нормальной плазмы;

МИЧ - Международный индекс чувствительности тромбопластинового реагента.