СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕПРЯМЫМИ АНТИКОАГУЛЯНТАМИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины, в частности к исследованию крови, и может быть использовано для выявления нарушений системы свертывания крови, в том числе для контроля лечения антикоагулянтами непрямого действия при профилактике тромбозов и тромбоэмболий.

В 1983 году ВОЗ [WHO 1211 Geneva 27 Switzerland. /Recommended methodology for using WHO International Reference Preparation for Thrombo-plastin], совместно с Комитетом по тромбозам и гемостазу, рекомендовано при контроле за применением непрямых антикоагулянтов (НА) результаты определения протромбинового времени в бедной тромбоцитами плазме (БТП) выражать в показателе международного нормализованного отношения (MHO или в английской транскрипции INR - international normalized ratio). Вместе с тем, существует настоятельная необходимость в определении MHO не только в БТП, но и в капиллярной крови, особенно при неотложных состояниях, в педиатрической практике и подборе дозы НА.

Известен способ контроля лечения непрямыми антикоагулянтами путем определения протромбинового времени в БТП, заключающийся в определении времени свертывания БТП при ее смешивании с тромбопластин - кальциевой смесью (Quick A. J. The prothrombin time in hemophilia and in obstructive jaundice. // J. Biol. Chem. - 1935. - Vol. 109. - P.73-74). Однако способ не предусматривает исследование капиллярной крови, а для получения исследуемой БТП существует дополнительный этап, а именно центрифугирование стабилизированной цитратом венозной крови.

Наиболее близким к заявляемому решению по достигаемому положительному результату является унифицированный способ (прототип) контроля лечения непрямыми антикоагулянтами путем определения протромбинового времени в капиллярной крови (Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований, утверждены Приказом Министра здравоохранения СССР 960 от 15 октября 1974 г., под редакцией В.В. Меньшикова, М., 1977, c. 27-29).

Способ-прототип осуществляют следующим образом.

Реактивы для выполнения способа-прототипа:
1. 3,8%-ный раствор цитрата натрия;
2. 0,5%-ный раствор хлорида кальция;
3. 1%-ный раствор тромбопластина.

Оборудование для выполнения способа-прототипа
1. Водяная баня на +37^oС.

2. Секундомеры.

3. Скарификаторы.

4. Микропипетки с объемом измерения до 0,1 мл.

Материал для исследования способом-прототипом: капиллярная, стабилизированная цитратом, кровь.

Ход определения способа-прототипа. В микропипетку набирают 0,02 мл раствора цитрата натрия. Мякоть пальца здорового человека протирают спиртом и после его высыхания делают прокол стерильным скарификатором. Набирают в ту же микропипетку 0,08 мл свободно выступающей крови, немедленно выдувают содержимое в пробирку и перемешивают кровь с антикоагулянтом. Точно также набирают цитратную кровь еще в две пробирки. Каждую пробирку устанавливают последовательно в водяную баню при температуре +37^oС и через 1 мин добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция и 0,1 мл раствора тромбопластина. В момент добавления последнего реактива включают секундомер и по образованию сгустка отмечают протромбиновое время свертывания. По результатам в трех пробирках вычисляют средний показатель.

Аналогичным образом проводят получение стабилизированной цитратом капиллярной крови и определение протромбинового времени у больного.

Оценка результатов исследования способом-прототипом. Протромбиновую активность крови определяют по формуле:
ПАК(%)=(А/В)х100,
где ПАК - показатель протромбиновой активности крови;
А - протромбиновое время в капиллярной крови здорового человека;
В - протромбиновое время в капиллярной крови больного.

В норме показатель протромбиновой активности крови составляет 93-107%. При лечении непрямыми антикоагулянтами этот показатель должен быть в пределах 45-65%.

Недостатками способа-прототипа являются следующие.

1. Нестандартный способ выражения результатов исследования, не учитывающий чувствительность используемого тромбопластина к дефициту К-витаминзависимых факторов протромбинового комплекса (факторов VII, X, II).

2. Несопоставимость результатов исследования способом-прототипом с результатами способа определения протромбинового времени свертывания в БТП у больных, получающих НА. Это объясняется несоответствием использованных конечных концентраций цитрата натрия и хлорида кальция в способе-прототипе, в сравнении с таковыми концентрациями, используемыми в способе определения протромбинового времени в БТП.

Заявляемый способ лишен этих недостатков: при оценке результатов протромбинового теста у больных, получающих НА, учитывается чувствительность тромбопластина к дефициту факторов протромбинового комплекса; результаты способа выражены в стандартном (рекомендованом ВОЗ) показателе MHO, результаты определения заявляемым способом у больных, получающих НА, совпадают с результатами способа, выполненного у тех же больных на БТП.

Авторы предлагают способ, позволяющий с высокой точностью определить протромбиновое время в капиллярной крови, так как предлагается использовать стандартизированный по международному индексу тромбопластин при исследовании капиллярной крови. Кроме того, в заявляемом способе используется оптимальное соотношение цитрата натрия и хлорида кальция, что позволило полностью воспроизвести результаты, получаемые при исследовании БТП больных. Таким образом, заявляемый способ обладает всеми достоинствами способа определения на БТП (аналога), но не требует дополнительного этапа центрифугирования, что позволяет существенно повысить его доступность (увеличить число лечебных учреждений, где возможно выполнить этот тест, а именно участковые больницы, фельдшерско-акушерские пункты, здравпункты и другие небольшие лечебные учреждения), так как при исследовании капиллярной крови нет необходимости оснащения клинических лабораторий центрифугами и сокращается время исследования. Кроме того, при исследовании заявляемым способом протромбинового времени у новорожденных (у всех новорожденных снижен уровень факторов протромбинового комплекса, особенно важно это исследование с желтухой новорожденных) устраняется необходимость в пунктировании поверхностной лобной вены для получения 3 мл венозной крови, а выполняется точное исследование протромбинового времени в капиллярной крови (для исследования достаточно лишь 0,20 мл крови), при передозировке и при подборе дозы непрямых антикоагулянтов, так как имеется риск опасных для жизни кровотечений, рекомендуется ежедневное определение MHO, этот показатель, как известно, определить способом прототипом невозможно, а используя способ аналог дополнительно необходима венепункция для забора 9 мл венозной крови и необходим дополнительный этап центрифугирования крови.

Положительными результатами заявляемого способа являются повышение точности контроля.

Положительный результат достигается за счет того, что используют стандартизированный по международному индексу чувствительности тромбопластин, а молярное соотношение конечной концентрации безводного хлорида кальция к конечной концентрации безводного цитрата натрия в составляет от 1,5 до 2,0.

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы и оборудование
1. 3,8% раствор цитрата натрия. Получают растворением 3,8 г трехзамещенного цитрата натрия (5,5 водного) в 100 мл дистиллированной воды.

2. Лиофильно высушенный тромбопластиновый реагент "Техпластин" производства фирмы "Технология-Стандарт", г. Барнаул, Россия (стандартизированный по международному индексу чувствительности - МИЧ). Перед использованием реагент разводят добавлением 5,0 мл раствора хлорида кальция в концентрации, взятой в диапазоне от 0,0325 М до 0,0400 М, выдерживают на водяной бане при температуре +37^oС не менее 15 мин.

3. Коагулометр, типа Тромбостат-2 (фирмы "Behnk Elektronik").

4. Скарификаторы.

5. Капилляр Панченкова.

6. Микропипетки вместимостью 0,1 мл; 5,0 мл.

7. Пробирки стеклянные.

8. Спирт 70^o.

9. Стерильные ватные шарики.

Получение капиллярной крови
1. Капилляр Панченкова промыть 3,8% раствора цитрата натрия;
2. После обработки спиртом и прокола мякоти пальца скарификатором первую каплю крови удалить ватным тампоном.

3. В капилляр набрать 3,8% раствора цитрата натрия до деления "80".

4. Перенести цитрат в чистую пробирку.

5. В тот же капилляр набрать кровь до деления "0".

6. Полученную кровь перенести в чистую пробирку.

7. В тот же капилляр повторно набрать кровь до деления "20".

8. В пробирке смешать обе порции крови, дополнительно перемешать их пипетированием. При этом получают кровь, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. До исследования (промежуток времени не более 60 мин) образцы крови хранят при комнатной температуре (+18...+25^oС) в герметично закрытом виде для предотвращения высыхания.

Ход определения
Исследуемый образец капиллярной крови больного, в объеме 0,1 мл, инкубируют 1 мин в кювете коагулометра при +37^oС. Затем вносят 0,1 мл прогретого до температуры +37^oС тромбопластин-кальциевого реагента, включают таймер (секундомер) и определяют время свертывания.

Такое исследование капиллярной крови больного проводят дважды. Из двух определений вычисляют средний результат протромбинового времени свертывания (в секунду).

Аналогично исследуют капиллярную кровь, стабилизированную цитратом натрия, взятую от практически здорового человека.

Оценка полученных результатов
Результаты оценивают по международному нормализованному отношению (MHO), рассчитанному по формуле:
МНО=(ПВ_{больного}/ПВ_{контроля})^мич,
где MHO - международное нормализованное отношение;
ПВ_{больного} - протромбиновое время в капиллярной крови больного;
ПВ_{контроля} - протромбиновое время в капиллярной крови здорового человека;
МИЧ - международный индекс чувствительности тромбопластина.

По результатам обследования 45 практически здоровых людей установлено, что в среднем показатель MHO в капиллярной крови (Х±m) равен 1,010±0,003 (σ= 0,02). В результате обследования капиллярной крови 128 больных с различными нарушениями, требующими применения непрямых антикоагулянтов, установлено, что показатель MHO в диапазоне от 2,0 до 4,0 эффективно предупреждает тромботические нарушения и не вызывает каких-либо кровотечений.

Апробация предлагаемого способа
Апробацию заявляемого способа диагностики провели на 128 больных, получающих антикоагулянты непрямого действия. Сравнение показателей протромбинового времени, полученных разными способами, провели на 10 больных, у которых были установлены искусственные клапаны сердца. Сравнение показателей представлено в табл.1. Из нее видно, что используя предлагаемый способ, эффект от применения НА оценивают в показателе MHO и эти результаты совпадают с величинами MHO, определяемыми в цитратной бедной тромбоцитами плазме (коэффициент корреляции при этом составил +0,998, р<0,001). Из таблицы видно также, что на показатели заявляемого способа не оказывает влияние применение разных тромбопластинов, в отличие от способа-прототипа (показатели ПАК достоверно отличаются при использовании разных тромбопластинов).

Воспроизводимость способа
Для оценки воспроизводимости способа использовали коэффициент вариации CV(%). Коэффициент вариации заявляемого способа при исследовании в разные дни не превышает 5%.

Результаты оптимизации конечной концентрации цитрата натрия и хлорида кальция
Для получения высокой сопоставимости результатов исследования предлагаемого способа с результатами способа, где используется БТП, мы провели расчет молярного соотношения конечных концентраций в тестируемой смеси хлорида кальция и цитрата натрия.

Для этой цели применили формулу расчета:

где МС - молярное соотношение;
S₁ - конечная концентрация хлорида кальция (в пересчете на безводный) в тестируемой смеси;
S₂ - конечная концентрация цитрата натрия (в пересчете на безводный) в тестируемой смеси.

Используя эту формулу установлено, что молярное соотношение конечной концентрации безводного хлорида кальция к конечной концентрации безводного цитрата натрия в способе-прототипе составляет 2,12.

Для уточнения оптимального диапазона молярного соотношения конечных концентраций в тестируемой смеси цитрата натрия и хлорида кальция при определении протромбинового времени в капиллярной крови, мы провели исследование, результаты которого представлены в табл. 2. Из таблицы видно, что оптимальным диапазоном молярного соотношения конечных концентраций безводного хлорида кальция к конечной концентрации безводного цитрата натрия является диапазон от 1,5 до 2,0.

Клинические примеры
1. Больная М.С., 43 лет, поступила в отделение пороков сердца Алтайского краевого кардиологического диспансера 19.01.99 с диагнозом: Ревматизм, неактивная фаза; Состояние после протезирования митрального клапана (1989 г.); Постоянная форма мерцательной аритмии, НК-II а; Последствия перенесенного нарушения мозгового кровообращения в бассейне средней мозговой артерии с правосторонним гемипарезом и явлениями дизартрии. Цель госпитализации - подбор и корректировка дозы непрямых антикоагулянтов. Из анамнеза установлено, что в течение последних 5 суток у больной неоднократно возникали длительные (более 40 минут) носовые кровотечения. При исследовании протромбинового времени 19.01.99, у больной выявлена выраженная гипокоагуляция на фоне применения 0,2 мг пелентана. Показатель MHO в капиллярной крови, заявляемым способом, составил 7,8, что свидетельствует о значительной передозировке этого лекарственного препарата и высоком риске развития опасных для жизни кровотечений. В связи с этим, лекарственный препарат был отменен. При повторном ежедневном исследовании системы гемостаза было обнаружено снижение показателя MHO до 1,9 только 21.01.99. С 22.01.99 пелентан вновь назначен в половинной дозе 0,1 мг. Носовых кровотечений или других симптомов кровоточивости во время коррекции дозы препарата не наблюдалось. При ежедневном исследовании протромбинового времени, заявляемым способом, к 25.01.99 показатель MHO достиг 3,5, т.е. рекомендованного для таких больных диапазона.

2. Больной Т.В., 36 лет, поступил в кардиохирургическое отделение Алтайского краевого кардиологического диспансера 20.10.98 с диагнозом: Хронический септический эндокардит с поражением митрального клапана. Недостаточность митрального клапана, HK-II Б. Больному 02.12.98 произведена операция по протезированию митрального клапана в условиях искусственного кровообращения. Установлен протез митрального клапана ЛИКС-36. С 08.12.98 пациенту назначен непрямой антикоагулянт - фенилин в дозе 30 мг/сутки. При исследовании гемостаза 11.12.98 (на четвертый день приема непрямых антикоагулянтов) показатель MHO в капиллярной крови составил 1,6, что было расценено, как недостаточная доза непрямых антикоагулянтов и доза препарата была повышена на 15 мг/сутки (с 30 до 45 мг в сутки). При ежедневном исследовании только к 16.12.98 на фоне увеличеной дозы препарата выявлено увеличение показателя MHO до 3,4. В результате подбора и корректировки дозы препарата, поддерживающая доза фенилина у данного пациента составила 45 мг/сутки, а показатель MHO в течение последующих 12 месяцев удерживался в рекомендуемом для таких больных диапазоне.

3. Больная К.М., 33 года обратилась в Алтайский гематологический центр 12.03.99 с жалобами на маточные кровотечения (Нb=77 г/л) и наличие субъективных признаков сидеропенического синдрома. Из анамнеза установлено, что больная в течение 5-и месяцев применяет непрямые антикоагулянты (фенилин в дозе 60 мг), подбор и контроль дозы были проведены по показателю ПАК в капиллярной крови (способу-прототипу) в больнице города Бийска. Из амбулаторной карты установлено, что данный показатель в течение последних 4-х месяцев был в пределах 55-65% (т.е. подбор и корректировка дозы фенилина были проведены без учета индекса чувствительности тромбопластина). При исследовании капиллярной крови заявляемым способом показатель MHO составил 5,7, что свидетельствует о значительной передозировке этого препарата и высоком риске развития опасных для жизни кровотечений. Была снижена доза препарата до 45 мг и проводили ежедневный контроль протромбинового времени в капиллярной крови, заявляемым способом. Показатель MHO достиг рекомендуемого уровня - 2,6 к 21.03.99. Каких-либо кровотечений или других симптомов кровоточивости во время коррекции дозы препарата не было.

Преимущества заявляемого способа: точное определение (рекомендованного ВОЗ) показателя MHO в капиллярной крови. Полная сопоставимость результатов определения заявляемым способом с показателями, полученными на БТП, в отличие от способа-прототипа, так как имеется оптимизация конечных концентраций цитрата натрия и хлорида кальция. Сокращение времени исследования, в сравнении со способом-аналогом, так как отсутствует дополнительный этап приготовления бедной тромбоцитами плазмы, а именно центрифугирование. Кроме того, для выполнения теста нет необходимости в дополнительном оборудовании для проведения центрифугирования (центрифуга, центрифужные кюветы), а для выполнения способа-аналога это оборудование необходимо.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лечению антикоагулянтами непрямого действия. Способ позволяет повысить точность контроля лечения непрямыми антикоагулянтами. Проводят их введение больному под контролем протромбинового времени в капиллярной крови, при этом протромбиновое время определяют с использованием стандартизированного по международному индексу чувствительности тромбопластину и молярного соотношения конечной концентрации безводного хлорида кальция к конечной концентрации безводного цитрата натрия, составляющего от 1,5 до 2,0, рассчитывают международное нормализованное отношение (MHO) по формуле МНО=(ПВ_{больного}/ПВ контроля)^МИЧ, где ПВ_{больного} - протромбиновое время в капиллярной крови больного, ПВ_{контроля} - протромбиновое время в капиллярной крови здорового человека, МИЧ - международный индекс чувствительности тромбопластина, и под контролем MHO осуществляют подбор и корректировку дозы препаратов, при этом показатель MHO должен быть в диапазоне от 2,0 до 4,0. 2 табл.

Способ контроля лечения непрямыми антикоагулянтами путем их введения больному под контролем протромбинового времени в капиллярной крови, отличающийся тем, что протромбиновое время определяют с использованием стандартизированного по международному индексу чувствительности тромбопластину и молярного отношения конечной концентрации безводного хлорида кальция к конечной концентрации безводного цитрата натрия, составляющего от 1,5 до 2,0, рассчитывают международное нормализованное отношение (MHO) по формуле

МНО=(ПВ_{больного}/ПВ_{контроля})^МИЧ,

где ПВ_{больного} - протромбиновое время в капиллярной крови больного; ПВ_{контроля} - протромбиновое время в капиллярной крови здорового человека;

МИЧ - международный индекс чувствительности тромбопластина,

и под контролем MHO осуществляют подбор и корректировку дозы препаратов, при этом показатель MHO должен быть в диапазоне от 2,0 до 4,0.