СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/49 G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины, в частности к исследованию крови, и может быть использовано для лабораторной диагностики антифосфолипидного синдрома.

Известно, что антифосфолипидный синдром (АФС) является частой причиной рецидивирующих тромбозов, тромбоэмболии, инфарктов, нарушений мозгового кровообращения и других тромботических нарушений. Сущность его патогенеза заключается в появлении в крови антифосфолипидных антител (АФА) к отрицательно заряженным фосфолипидам и белково-фосфолипидным комплексам. К этой группе антител относится ″волчаночный антикоагулянт″ (ВА), впервые идентифицированный и описанный Conley C.L. и соавт. в 1952 г. Он появляется в крови при многих иммунных заболеваниях и синдромах. Известны случаи обнаружения ВА у больных без четких проявлений каких-либо других заболеваний. Появление ВА в крови ухудшает течение предшествующего заболевания часто приводит к развитию тромботических осложнений и является одной из причин невынашивания беременности. Поэтому быстрая и точная диагностика АФС является актуальной задачей.

Известен способ диагностики АФС путем определения в крови антител к отрицательно заряженным фосфолипидам (иммуноглобулинов G, М и А, в том числе антикардиолипиновых) (Harris E.N., Gharavi A.E., Patel S.A., Hughes G.R.V.Evaluation of the anti-cardiolipin test: report of an international workshop held 4 April 1986. // Clin. Exp. Immunol. - 1987. - 68. - P.215-22).

Недостатком известного способа является низкая специфичность, поскольку он не выявляет ВА, а только определяет состояние иммунной системы, при которой возможно присутствие в крови этого антикоагулянта. Известный способ трудоемкий, часто дает ложноположительные результаты анализа, требует специального оборудования для иммуноферментного анализа и дорогостоящих импортных реагентов.

Наиболее близким по достигаемому положительному результату (прототип) является способ диагностики АФС по патенту №2104550 от 10.02.98 г., Россия. Приоритет от 24.05.95 г. (Способ диагностики антифосфолипидного синдрома).

Способ-прототип осуществляют следующим образом:

Предварительно получают бедную тромбоцитами контрольную нормальную плазму и бедную тромбоцитами плазму (БТП) больного.

Этап 1. Параллельно на образцах контрольной нормальной плазмы и БТП больного выполняют ориентировочные фосфолипидзависимые коагуляционные тесты.

Этап 2. При выявлении гипокоагуляции в каком-либо ориентировочном тесте выполняют первый коррекционный тест. Для этого в качестве исследуемого образца плазмы используют смесь БТП больного и контрольной нормальной плазмы в соотношении 4:1. Устранение гипокоагуляции в смеси с контрольной нормальной плазмой исключает наличие в плазме ВА.

Этап 3. При отсутствии коррекции гипокоагуляции в тесте смешивания с контрольной нормальной плазмой выполняют второй коррекционный тест, где БТП больного смешивают с 3% раствором эритрофосфатида. Если достигнута коррекция гипокоагуляции эритрофосфатидом, диагностируют АФС.

К недостаткам способа-прототипа следует отнести:

1. Трудоемкость, многоэтапность и связанную с этим значительную затрату времени.

2. Невозможность количественной оценки полученных результатов исследования.

3. Невозможность диагностики АФС на фоне применения антикоагулянтов непрямого действия (АНД).

Заявляемый способ лишен этих недостатков: выполняется в два этапа, что значительно сокращает время исследования и дает количественное выражение результатов, на его показания не оказывают влияния АНД.

Авторы предлагают высокоэффективный способ диагностики антифосфолипидного синдрома, позволяющий распознавать АФС, на основе определения протромбинового времени свертывания с двумя тромбопластиновыми реагентами: высокочувствительным и низкочувствительным к действию ВА.

Положительным результатом заявляемого изобретения является повышение точности, за счет количественной оценки результатов исследования, эффективная диагностика АФС на фоне лечения АНД и упрощение способа. Положительный результат достигается тем, что используют высокочувствительный и низкочувствительный к волчаночному антикоагулянту тромбопластиновые реагенты, вычисляют отношение индексов удлинения протромбинового времени и при значении отношения больше 1,1 диагностируют АФС.

Способ осуществляют следующим образом:

Реактивы и оборудование:

1. Цитрат натрия, трехзамещенный, 3,8% раствор, получают растворением 3,8 г трехзамещенного цитрата натрия в 100 мл дистиллированной воды.

2. Тромбопластин ВА+ (Техпластин™), фирма ″Технология-Стандарт″, Россия, (ISI=1,1), - тромбопластиновый реагент с высокой чувствительностью к ВА, лиофилизирован.

3. Тромбопластин ВА-, фирма «Технология-Стандарт», Россия, (ISI=1,1) - растворимый тромбопластиновый реагент с низкой чувствительностью к ВА, лиофилизирован.

4. РНП-плазма, фирма «Технология-Стандарт», Россия. Референтная нормальная плазма, лиофилизирована.

5. Центрифуга ОПН-8.

6. Коагулометр «Минилаб 701», производитель «Юнимед», Россия.

Подготовка исследуемой БТП больного и контрольной нормальной плазмы крови (у здоровых людей)

Кровь получают из локтевой вены самотеком через иглу в пластиковую пробирку, содержащую 0.1 М раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Кровь центрифугируют 5 минут при скорости вращения 1000 об/мин (200 g). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 минут при скорости 3500 об/мин (1200 g). Полученную БТП используют для проведения исследования.

Разведение реагентов

1. Разведение Тромбопластина ВА+

Во флакон с тромбопластином добавить 5 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать. Инкубировать реагент при 37°С в течение 20 мин.

2. Разведение Тромбопластина ВА-

Во флакон с тромбопластином добавить 5 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать. Инкубировать реагент при 37°С в течение 20 мин.

3. Во флакон с РНП-плазмой добавить 1 мл дистиллированной воды. Перед применением плазма должна быть выдержана при комнатной температуре в течение 15 мин.

Ход определения

Этап 1. Параллельно на образцах референтной нормальной плазмы и БТП больного определяют протромбиновое время свертывания с тромбопластином ВА+.

0,1 мл БТП инкубируют 1 мин в термостате коагулометра при +37°С. Затем добавляют 0,2 мл тромбопластинового реагента с высокой чувствительностью к ВА. Коагулометр регистрирует свертывание (результат, полученный на образце плазмы больного, обозначают как t₁, а аналогичный результат анализа референтной нормальной плазмы обозначают как t₂).

Этап 2. Параллельно на образцах референтной нормальной плазмы и БТП больного исследуют протромбиновое время свертывания с тромбопластином ВА-.

0,1 мл БТП инкубируют 1 мин в термостате коагулометра при +37°С. Затем добавляют 0,2 мл тромбопластинового реагента с низкой чувствительностью к ВА. Коагулометр регистрирует свертывание (результат, полученный на образце плазмы больного, обозначают как t₃, а аналогичный результат исследования референтной нормальной плазмы обозначают как t₄).

Вычисляют показатель NR (NR - отношение индексов протромбинового времени, которое количественно оценивает гипокоагуляционный эффект при АФС по результатам определения протромбинового времени с разными тромбопластинами) по формулам:

где: t₁ - время свертывания БТП больного с тромбопластином ВА+;

t₂ - время свертывания референтной нормальной плазмы с тромбопластином ВА+;

t₃ - время свертывания БТП больного с тромбопластином ВА-;

t₄ - время свертывания референтной нормальной плазмы с тромбопластином ВА-;

R_x - показатель удлинения времени свертывания у больного, в сравнении с контролем, в тесте с тромбопластином ВА+;

R_y - показатель удлинения времени свертывания у больного, в сравнении с контролем, в тесте с тромбопластином ВА-;

Оценка полученных результатов

При обследовании здоровых людей и больных без АФС установлено, что в среднем показатель NR был равен 0,99 (SD=0,055, m=0,01, n=30), а пределы нормальных колебаний (X±2SD) составили 0,88-1,10. Следовательно, NR у здоровых людей и больных без АФС (в плазме крови которых отсутствует ВА) всегда меньше 1,1. В тех случаях, где NR равняется или превышает 1,1, диагностируют антифосфолипидный синдром.

Клиническая апробация предлагаемого способа

Апробацию заявляемого способа диагностики провели на 27 больных с АФС, который протекал на фоне системной красной волчанки (СКВ). Больные обследовались до назначения АНД и на фоне проведения терапии этими антикоагулянтами. Для клинико-лабораторной диагностики СКВ использовали принятые ревматологами критерии. У всех обследованных больных с АФС имелись лабораторные признаки ВА (удлинение времен свертывания в фосфолипидзависимых коагуляционных тестах, отсутствие коррекции удлинения времени свертывания нормальной плазмой, наличие коррекции удлинения времени свертывания эритрофосфатидом).

Контрольные исследования были выполнены на группе здоровых людей (30 человек) и группе больных с СКВ, у которых отсутствовали признаки АФС (25 человек).

Из таблицы I видно, что NR у больных с АФС был достоверно выше аналогичного показателя в группе здоровых и показателя NR у больных без АФС.

Диагностика АФС у больных, получающих АНД

Известно, что основным клиническим проявлением АФС являются тромботические нарушения, и поэтому этим больным часто проводится терапия АНД под контролем международного нормализованного отношения (MHO). При этом терапевтический диапазон MHO стремятся поддерживать между 2,0 и 3,0. Заявляемый способ позволяет проводить диагностику АФС у больных, получающих АНД. Такая возможность имеется благодаря тому, что индекс чувствительности обоих тромбопластинов (так называемый ISI) к гипокоагуляционным эффектам, обусловленным применением АНД, одинаковый, но чувствительность к гипокоагуляционному действию ВА разная. Для подтверждения возможности диагностики АФС на фоне приема АНД мы провели исследование 11 больных с АФС, получающих АНД, результаты которого представлены в таблице II. Из таблицы следует, что на фоне применения АНД показатель NR не изменяется.

Специфичность способа и его воспроизводимость

Заявляемый способ отличается высокой специфичностью к гипокоагуляционному действию ВА. Другие причины, вызывающие удлинение протромбинового времени, не оказывают влияния на показания заявляемого способа, так как параллельно определяют два протромбиновых времени (с высокочувствительным и низкочувствительным к ВА тромбопластиновыми реагентами). В частности, гепарин, дефицит факторов свертывания крови, их иммунные ингибиторы, эффекты АНД одинаково будут вызывать гипокоагуляцию в тесте как с высокочувствительным, так и с низкочувствительным к ВА тромбопластиновыми реагентами.

Для оценки воспроизводимости способа использовали коэффициент вариации CV(%) Коэффициент вариации этого теста при исследовании в разные дни не превышает 5%.

Пример практического использования предлагаемого способа:

Больной Т., 30 лет, наблюдается в Алтайском гематологическом центре с диагнозом первичный АФС с 1999 г. За время заболевания дважды отмечает тромботические осложнения: тромбоз вен голени слева в июне 1999 года и тромбоэмболия легочной артерии в августе 2001 года. Наследственность не отягощена. Повторное обращение больного в Алтайский гематологический центр обусловлено субфебрильной температурой в течение последних 2-х недель, головной болью, слабостью. При физикальном обследовании существенных нарушений не выявлено. В анализах крови обнаружены: антитела (Ig G) к кардиолипину, уровень ЦИК повышен до 40 уд.ед.

Проведена лабораторная диагностика АФС (см. табл.III). На основании клинических и лабораторных данных сформулирован диагноз: Первичный антифосфолипидный синдром, состояние после ТЭЛА (2001).

Назначены АНД в дозе 5 мг/сут (Варфарин). Вновь проведено исследование системы гемостаза (см. табл.III). Через две недели после курса лечения (включавшего плазмаферез, применение дезагрегантов и др.) состояние больного улучшилось, нормализовалась температура, прекратились головные боли, уменьшилась слабость. Больному вновь была проведена лабораторная диагностика АФС способом прототипом и заявляемым способом (см. табл.IV).

Как следует из представленной таблицы, после лечения значимо снизился показатель NR, хотя традиционные тесты для выявления ВА остаются положительными.

В приведенном клиническом примере представлено практическое значение заявляемого способа диагностики антифосфолипидного синдрома. Как следует из таблицы III, у больного качественные реакции, выявляющие ВА, положительны (каолиновое время, время свертывания с разведенным тромбопластином, лебетоксовый тест, тест коррекции с нормальной плазмой не выявляет коррекцию, тест коррекции с эритрофосфатидом устраняет гипокоагуляцию в тестах). На фоне применения АНД также имеется гипокоагуляция, но при этом (используя традиционные тесты) невозможно дифференцировать причину гипокоагуляции (гипокоагуляционный эффект ВА или гипокоагуляционный эффект применяемых антикоагулянтов). Заявляемый способ диагностирует АФС и показывает стабильные результаты NR на фоне применения АНД. После курса лечения у больного, как следует из таблицы IV, качественные реакции, выявляющие ВА, остаются положительны, степень удлинения времени свертывания в различных тестах разная, поэтому, используя способ-прототип, трудно объективно оценить эффективность применявшихся методов лечения, но заявляемый способ демонстрирует снижение показателя NR, что соответствует клиническому улучшению состояния больного. Таким образом, заявляемый способ позволяет объективно (и количественно) оценить эффективность применявшихся методов лечения.

Таблица I
Способ диагностики антифосфолипидного синдромаРасчетный показательЗдоровыеБольные СКВ без АФС IIБольные СКВ с АФС IIINR0,99±0,011,01±0,011,22±0,04Достоверность различий, РP_I-II>0,5P_II-III<0,001P_I-III<0,001

Таблица II
Показатель NR у здоровых людей и больных с АФСПоказатели 
Здоровые
IБольные с АФС до начала терапии АНД
IIБольные с АФС на фоне приема АНД
IIINR0,99±0,011,23±0,071,24±0,08Достоверность различий, РP_I-II<0,001P_II-III>0,5Р_I-III<0,005

Показатель NR у здоровых людей (n=30) и больных с АФС до начала терапии АНД и на фоне применения АНД (n=11)

Изобретение относится к медицине, точнее к исследованию крови, и может быть использовано для лабораторной диагностики антифосфолипидного синдрома. Способ заключается в оценке времени свертывания исследуемой плазмы в фосфолипидзависимом тесте, при этом используют высокочувствительный и низкочувствительный к волчаночному антикоагулянту тромбопластиновые реагенты, вычисляют отношение индексов удлинения протромбинового времени и при значении отношения, равном или больше 1,1, диагностируют АФС. Способ обеспечивает сокращение времени исследования, дает количественное выражение результатов, на его показания не оказывает влияния антикоагулянты непрямого действия. 4 табл.

Способ диагностики антифосфолипидного синдрома (АФС), включающий оценку времени свертывания исследуемой плазмы в фосфолипидзависимом тесте, отличающийся тем, что используют высокочувствительный и низкочувствительный к волчаночному антикоагулянту тромбопластиновые реагенты, вычисляют отношение индексов удлинения протромбинового времени и при значении отношения, равном или больше 1,1, диагностируют АФС.