СОДЕРЖАЩАЯ ЛИЗИН ДОБАВКА К КОРМАМ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2006 года по МПК A23K1/00 A23K1/16 C12P13/08 

Настоящее изобретение относится к содержащим лизин водным добавкам к кормам для животных, которые при необходимости содержат микроорганизмы, предпочтительно в инактивированной форме, применяемые в процессе ферментации, и к способу получения такой композиции.

Предпосылки создания изобретения

Незаменимая аминокислота L-лизин находит широкое применение в качестве добавки к кормам для животных.

Известно, что L-лизин получают путем ферментации с использованием штаммов коринебактерий, прежде всего Corynebacterium glutamicum. Вследствие большого значения этого продукта постоянно ведутся работы по совершенствованию способа его получения. Усовершенствования способа могут касаться улучшения присущих самому микроорганизму характеристик продуктивности, например с помощью мутагенеза и селекции, технологических сторон процесса ферментации, таких как, например перемешивание и обеспечение кислородом, состава питательных сред, например концентрации сахара в процессе ферментации или обработки продуктов, например с помощью ионообменной хроматографии или кристаллизации.

Из уровня техники известны три различные группы форм содержащих L-лизин продуктов, которые получают из содержащего L-лизин ферментационного бульона.

Наиболее распространенная группа включает порошкообразную или кристаллическую формы продукта из очищенного, соответственно чистого L-лизина, который обычно представлен в виде соли, такой как, например, моногидрохлорид L-лизина.

Другая группа твердых форм продукта, например такая, как описанная в ЕР-В 0533039, содержит наряду с L-лизином добавки, используемые в процессе ферментации, и при необходимости инактивированную биомассу применяемого микроорганизма.

Порошкообразная, кристаллическая, а также гранулированная формы продукта имеют явные недостатки с точки зрения удобства в использовании и применении. На качество продукта в значительной степени влияют метеорологические условия, такие как, например, высокая влажность воздуха, поскольку вследствие возможного комкования и слипания ухудшается стойкость при хранении и затрудняется дозировка продукта при его использовании. С другой стороны, обработка сухих порошкообразных содержащих L-лизин продуктов может приводить к нежелательному пылеобразованию.

Третья группа содержащих L-лизин продуктов включает концентрированные водные щелочные растворы и поэтому лишена указанных выше недостатков (ЕР-В 0534865).

Для различных форм существуют различные способы получения содержащих L-лизин продуктов из содержащего L-лизин ферментационного бульона.

Для получения твердого чистого L-лизина в настоящее время в основном используются два различных метода.

Лизин может быть получен в виде моногидрохлорида (Lys•HCl) путем кристаллизации из соответствующего ферментационного бульона после отделения инактивированной биомассы пригодными методами. Очистку фильтрата перед дальнейшим концентрированном, как правило, осуществляют с помощью ионообменной хроматографии в несколько стадий. Для этой цели отделенный от биомассы ферментационный бульон прежде всего предпочтительно подкисляют путем добавления соляной кислоты (HCl) или серной кислоты (H₂SO₄), чтобы облегчить адсорбцию лизина ионообменной смолой. Наряду с полученным путем ферментации L-лизином также неспецифически связываются различные другие катионы, присутствующие в ферментационном бульоне. В целом для получения чистого продукта необходимо использовать различные подключаемые последовательно обменные колонки. В завершение адсорбированный лизин предпочтительно элюируют щелочным раствором аммиака и регенерируют ионообменную колонку. После этого полученный таким образом раствор лизина концентрируют и после нейтрализации с помощью соляной кислоты получают лизин•HCl в кристаллической форме.

Другой метод позволяет получать лизин в форме кристаллической соли после очистки активированным углем (SU 183581). Для этого содержащий лизин ферментационный бульон инактивируют стандартным методом путем нагрева во влажной атмосфере и отделяют фильтрацией от биомассы. После подкисления фильтрата до рН 5 добавляют при постоянном перемешивании при 50-55°С 4-5% активированного угля для удаления из фильтрата нежелательных примесей и во избежание окрашивания кристаллизата. Путем последующей дополнительной фильтрации отделяют активированный уголь и затем путем добавления гидроксида кальция осаждают растворенный сульфат в виде сульфата кальция. Этот продукт фильтруют, удаляют аммиачный компонент в вакууме с помощью роторного испарителя и затем концентрируют раствор до тех пор, пока при охлаждении не произойдет кристаллизация.

Недостаток обеих этих технологий обработки заключается в наличии многочисленных отдельных стадий обработки и в использовании дорогостоящих методов очистки с помощью ионообменной хроматографии. При удалении нежелательных солей, соответственно при использовании различных элюирующих сред образуются дополнительные потоки отходов, которые требуют либо трудоемкой очистки, либо дорогостоящей утилизации.

Как описано в ЕР-В 0533039, эти недостатки удается преодолеть благодаря тому, что весь ферментационный бульон, при необходимости включая биомассу, концентрируют и сушат распылением при высокой температуре.

В US 5990350 описан способ получения содержащего L-лизин гранулята, в котором отсутствует биомасса. Согласно этому способу сначала с помощью ультрафильтрации биомассу отделяют от ферментационного бульона и отбрасывают. Затем полученный таким образом фильтрат концентрируют путем почти полного выпаривания присутствующей воды. После этого полученный таким путем концентрат сушат и перерабатывают дорогостоящим методом грануляции распылением в псевдоожиженном слое с получением требуемого гранулята.

В ЕР-В 0534865 описан способ получения водных основных содержащих L-лизин растворов из ферментационного бульона. Согласно описанному в указанной заявке способу биомассу отделяют от ферментационного бульона и отбрасывают. С помощью основания, такого как, например, гидроксид натрия, калия или аммония, значение рН доводят до 9-11. Минеральные компоненты (неорганические соли) отделяют от бульона после концентрирования и охлаждения путем кристаллизации и либо используют в качестве удобрения, либо отбрасывают (направляют в отходы).

Задача изобретения

Задача изобретения состоит в разработке новых водных пригодных в качестве добавки к кормам композиций, содержащих L-лизин и его соли.

Кроме того, задачей изобретения является разработка более экономичного и эффективного способа получения таких композиций в сравнении с известными в настоящее время способами.

Описание изобретения

Незаменимая аминокислота лизин находит широкое применение в качестве добавки к кормам для животных.

Микроорганизмы рода Corynebacterium отличаются способностью выделять L-лизин в соответствующей ферментационной среде в течение относительно короткого промежутка времени в высокой концентрации. Процесс обычно осуществляют в виде периодического процесса с подпиткой. В настоящее время получаемый ферментативным путем L-лизин перерабатывают преимущественно в кристаллический продукт, порошок или гранулят.

Объектом изобретения является добавка к кормам для животных, получаемая на основе ферментационного бульона, отличающаяся тем, что она содержит

а) L-лизин и/или его соли,

б) полученную в процессе ферментации биомассу в количестве от 0 до 100%, предпочтительно от 50 до 100% и наиболее предпочтительно от 90 до 100%,

в) по крайней мере преобладающую часть других растворенных и суспендированных ингредиентов ферментационного бульона,

г) представлена в жидкой форме, при необходимости в виде суспензии, и

д) имеет значение рН менее 7.

Содержание лизина (как такового) в добавке к кормам для животных составляет от 10 мас.% до 35 мас.%, предпочтительно от 15 мас.% до 35 мас.%, особенно предпочтительно от 18 мас.% до 35 мас.% и наиболее предпочтительно от 21 мас.% до 34 мас.% в пересчете на общее количество добавки. Значение рН составляет менее 7, предпочтительно от 2 до 6,5, особенно предпочтительно от 2,5 до 6 и наиболее предпочтительно от 2,5 до 5.

Содержание общей сухой массы в добавке составляет от 10 мас.% до 55 мас.%, предпочтительно от 20 мас.% до 55 мас.%, особенно предпочтительно от 35 мас.% до 55 мас.% и наиболее предпочтительно от 45 мас.% до 54 мас.%. В состав сухой массы наряду с лизином входят:

- предпочтительно биомасса продуцирующего микроорганизма,

- неорганические и другие органические компоненты ферментационного бульона и

- образовавшиеся в процессе ферментации побочные продукты, если их не отделяют соответствующими методами, такими как, например, сепарация или фильтрация.

Если биомассу полностью или частично сохраняют в добавке, то она содержит протеин микроорганизма в концентрации максимум до 4 мас.%.

Добавка содержит в качестве неорганических компонентов среди прочего кальций, магний, фосфор в виде фосфата и серу в виде сульфата, а в качестве органических компонентов среди прочего витамины, такие как, например, биотин и тиамин, или сахара, например изомальтозу.

К образующимся в ограниченном количестве в процессе ферментации органическим побочным продуктам относятся L-аминокислоты, выбранные из группы, включающей L-аланин, L-аспарагин, L-глутамин, L-метионин, L-треонин и L-валин. Кроме того, к ним относятся органические кислоты, несущие от одной до трех карбоксильных групп, такие как, например, молочная кислота, уксусная кислота и яблочная кислота. К ним относятся также сахара, такие как, например, трегалоза.

Наличие этих соединений является при определенных условиях желательными, если они повышают ценность добавки.

Следующим объектом изобретения является способ получения водных растворов/суспензий, содержащих лизин и/или его соли, отличающийся тем, что

а) путем ферментации получают содержащий L-лизин бульон,

б) при необходимости путем добавления содержащего L-лизин вещества концентрацию лизина доводят до требуемой,

в) рН раствора/суспензии доводят до значения менее 7 и

г) полученный таким образом бульон при необходимости концентрируют в вакууме,

при этом последовательность стадий б), в) и г) может быть изменена.

Еще одним объектом изобретения является способ получения водных растворов/суспензий, содержащих лизин и/или его соли, отличающийся тем, что

а) путем ферментации получают содержащий L-лизин бульон,

б) рН полученного таким образом бульона доводят до значения менее 7 и

в) из раствора/суспензии при необходимости полностью или частично выделяют биомассу,

г) при необходимости путем добавления содержащего L-лизин вещества концентрацию лизина доводят до требуемой и

д) полученный таким образом бульон при необходимости концентрируют в вакууме, при этом последовательность стадий б), в), г) и д) может быть изменена.

Продуцирующие L-лизин мутанты коринебактерий подробно описаны в известных публикациях, например в US 4657860.

Для продуцирования L-лизина эти штаммы можно культивировать непрерывно или периодически с использованием периодического процесса (культивирование партий) или периодического процесса с подпиткой либо периодического процесса с повторяющейся подпиткой. Обзор известных методов культивирования приведен в учебнике Chrniel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (изд-во Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) или в учебнике Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (изд-во Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Используемая культуральная среда должна быть соответствующим образом адаптирована к требованиям конкретного штамма. В качестве источника углерода могут быть использованы сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, например соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, например пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, например глицерин и этанол, и органические кислоты, например уксусная кислота. Эти вещества могут применяться по отдельности или в виде смеси. В качестве источника азота могут применяться органические азотсодержащие соединения, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкость, образующаяся после замачивания зерен кукурузы до разбухания, соевая мука и мочевина, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота могут применяться по отдельности или в виде смеси. В качестве источника фосфора могут применяться кислый фосфат калия или дикалийгидрофосфат, или соответствующие натриевые соли. Кроме того, культуральная среда должна содержать соли металлов, например, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. В дополнение к вышеназванным соединениям могут использоваться также такие важные для роста вещества, как аминокислоты и витамины. Кроме того, в культуральную среду могут быть добавлены соответствующие предшественники. Вышеуказанные добавки можно вводить в культуральную среду в виде одноразовой добавки или добавлять соответствующим образом в процессе культивирования.

Для контроля значения рН культуральной среды соответственно применяют основные соединения, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, или кислые соединения, такие как фосфорная кислота или серная кислота. Для контроля ценообразования добавляют антивспениватели, например, такие как полигликолевые эфиры жирных кислот. Для поддержания стабильности плазмид могут быть добавлены соответствующие конкретной среде вещества, обладающие избирательным действием, например антибиотики. Для поддержания аэробных условий в культуру вводят кислород или содержащие кислород газовые смеси, например воздух, и перемешивают с помощью соответствующих систем или с помощью потока газа. Температура культивирования в норме составляет от 25°С до 37°С. Культивирование продолжают до тех пор, пока не образуется максимальное количество L-лизина. Как правило, эта цель достигается в течение 10 -160 ч.

Примеры пригодных ферментационных сред описаны, например, в ЕР-В 0532867, US 5840551 и US 5990350.

Анализ L-лизина можно проводить с помощью анионообменной хроматографии с последующей дериватизацией с использованием нингидрина по методу, описанному у Spackman и др. (Analytical Chemistry, 30, 1190 (1958)), или с помощью ЖХВР с обращенной фазой по методу, описанному у Lindroth и др. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

Содержание L-лизина (как такового) в применяемых согласно изобретению ферментационных бульонах предпочтительно составляет более 60 г/л при содержании неметаболизируемых сахаров менее 5,0 г/л. При общем содержании сухой массы более 10 мас.% доля сухой биомассы предпочтительно составляет от 1 до 4 мас.%. При этом содержание побочных продуктов и витаминов (аминокислоты, органические кислоты) в ферментационном бульоне предпочтительно составляет менее 2 мас.%.

В целом при осуществлении предлагаемого способа сначала инактивируют, соответственно убивают, например, путем тепловой обработки, присутствующую в ферментационном бульоне биомассу. Однако при необходимости инактивацию можно и не проводить. После этого значение рН ферментационного бульона доводят с помощью неорганической кислоты, такой как, например, серная кислота, соляная кислота или фосфорная кислота, или органической кислоты, такой как, например, лимонная кислота, уксусная кислота или муравьиная кислота, или с помощью смеси различных кислот до величины менее 7, предпочтительно до 2-6,5, особенно предпочтительно до 2,5-6 и наиболее предпочтительно до 2,5-5. При необходимости перед или после подкисления биомассу полностью или частично отделяют с помощью широко известных методов сепарации или фильтрации. Отделение минеральных компонентов обычно не требуется. После этого кислый содержащий L-лизин раствор, соответственно суспензию концентрируют известными методами (например с использованием таких устройств, как роторный испаритель, тонкопленочный выпарной аппарат или выпарной аппарат с падающей пленкой), предпочтительно в вакууме, до тех пор, пока не получат жидкий продукт с содержанием лизина (исходя из L-лизина как такового) от 10 мас.% до 35 мас.%, предпочтительно от 15 мас.% до 35 мас.%, особенно предпочтительно от 20 мас.% до 35 мас.% и наиболее предпочтительно от 21 мас.% до 34 мас.% при содержании общей сухой массы от 10 мас.% до 55 мас.%, предпочтительно от 20 мас.% до 55 мас.%, особенно предпочтительно от 35 мас.% до 55 мас.% и наиболее предпочтительно от 45 мас.% до 54 мас.%. Как правило, бульон следует концентрировать таким образом, чтобы предпочтительно минеральные компоненты (неорганические соли) не осаждались из ферментационного бульона, а лизин оставался в растворенном состоянии. При необходимости требуемая концентрация L-лизина в продукте может быть достигнута путем добавления на любой стадии способа содержащего L-лизин вещества.

Получаемый (-ая) таким образом раствор/суспензия имеет кислое значение рН, является легко транспортируемым (-ой), легко поддается дозировке, является стабильным (-ой) в отношении микроорганизмов и обладает лучшей стабильностью при хранении в сравнении с щелочным раствором.

Подкисление можно также проводить после или в процессе концентрирования. Обладающие функциональной активностью анионы, такие как сульфат, хлорид, фосфат, цитрат и т.д., можно вводить в среду в форме обычных поступающих в продажу солей еще перед началом ферментации.

Понятие "суспензия" подразумевает, что предпочтительно инактивированные микроорганизмы присутствуют в продукте по изобретению в нерастворенном виде.

Примеры

Ниже изобретение более подробно поясняется на примерах.

Пример 1

Получение ферментационного бульона, содержащего L-лизин

Методы ферментации для получения содержащих лизин ферментационных бульонов, которые подвергают переработке согласно изобретению, подробно описаны в различных патентных публикациях (ЕР-В 0532867 и US 5840551).

Пример 2

Получение не содержащего биомассу продукта

В соответствии с примером 1 приготавливают 20 кг ферментационного бульона с содержанием приблизительно 9,5 мас.% лизина (как такового). Сначала присутствующую в ферментационном бульоне биомассу инактивируют путем тепловой обработки в течение 30 мин при 80°С. После этого инактивированную биомассу отделяют путем центрифугирования в течение 20 мин при 4000 об/мин (лабораторная центрифуга типа Biofuge-Stratos, фирма Heraeus, Дюссельдорф, Германия). Значение рН 1,0 л очищенной таким образом надосадочной жидкости доводят приблизительно до 4 путем последовательного добавления порций концентрированной серной кислоты. Затем содержание жидкости в центрифугате уменьшают в вакууме с помощью роторного испарителя (лабораторный роторный испаритель типа Büchi Rotavapor RE-120, фирма Büchi-Labortechnik GmbH, Констанц, Германия) приблизительно до 50% сухой массы.

Содержание L-лизина (как такового) в полученном таким образом жидком продукте составляло 31,5 мас.% при значении рН 4. Общее содержание сухой массы составляло 49,3 мас.%.

Пример 3

Получение продукта, содержащего биомассу

В соответствии с примером 1 приготавливают 20 кг ферментационного бульона с содержанием приблизительно 9,5 мас.% лизина (как такового). Присутствующую в ферментационном бульоне биомассу инактивируют непосредственно в биореакторе путем тепловой обработки в течение 30 мин при 80°С. Значение рН 1,0 л этого содержащего биомассу ферментационного бульона доводят после этого приблизительно до 4 путем последовательного добавления порций концентрированной серной кислоты. Затем содержание жидкости в этом кислом содержащем лизин ферментационном бульоне уменьшают в вакууме с помощью роторного испарителя (лабораторный роторный испаритель типа Büchi Rotavapor RE-120, фирма Büchi-Labortechnik GmbH, Констанц, Германия) приблизительно до 50% сухой массы.

Содержание L-лизина (как такового) в полученном таким образом жидком продукте составляло 21,8 мас.% при значении рН 4. Общее содержание сухой массы составляло 50,7 мас.%. После хранения в течение 16 месяцев при 20°С не было обнаружено никакого существенного изменения состава.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к содержащим лизин водным добавкам к кормам для животных и к способам их получения. Изобретение включает культивирование продуцирующего L-лизин микроорганизма, при необходимости удаление биомассы, доведение рН ферментационного бульона или надосадочной жидкости, полученной путем центрифугирования, до значения от 2 до 7. Причем содержание в добавке L -лизина равно от 18 до 35% в пересчете на общую массу добавки. Способ позволяет получить добавку, обладающую лучшей стабильностью при хранении. 2 н.п. и 3 з.п. ф-лы.

1. Добавка к кормам для животных, характеризующаяся тем, что она получена ферментацией продуцирующего L-лизин микроорганизма, при необходимости удалением биомассы, доведением рН ферментационного бульона или надосадочной жидкости, полученной путем центрифугирования, до значения от 2 до 7, причем содержание в ней L-лизина равно от 18 до 35 мас.% в пересчете на общую массу добавки.2. Добавка к кормам для животных по п.1, имеющая значение рН от 2 до 6,5.3. Способ получения добавки к кормам для животных по п.1, включающий культивирование продуцирующего L-лизин микроорганизма, при необходимости удаление биомассы, доведение рН ферментационного бульона или надосадочной жидкости, полученной путем центрифугирования, до значения от 2 до 7, причем содержание в добавке L-лизина равно от 18 до 35% в пересчете на общую массу добавки.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что при необходимости концентрацию лизина доводят до требуемой путем добавления L-лизина или содержащего L-лизин раствора.5. Способ по п.3, отличающийся тем, что бульон концентрируют.